諸氏鯔蝦虎魚(yú)卵黃蛋白原基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及表達(dá)

余露軍, 蔡 磊, 李 舸, 陳小曲, 陳 琳, 李建軍

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諸氏鯔蝦虎魚(yú)卵黃蛋白原基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及表達(dá)

余露軍, 蔡 磊, 李 舸, 陳小曲, 陳 琳, 李建軍

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東廣州 510663)

為了探討諸氏鯔蝦虎魚(yú)()卵黃蛋白原組織分布及17β-雌二醇(E2)暴露對(duì)雄性諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg的影響, 作者采用RT-PCR、RACE方法克隆并分析了諸氏鯔蝦虎魚(yú)卵黃蛋白原(Vg)基因的全長(zhǎng)cDNA序列, 并對(duì)Vg在諸氏鯔蝦虎魚(yú)體內(nèi)的組織表達(dá)分布及E2誘導(dǎo)后不同時(shí)間表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明: 獲得的Vg cDNA序列全長(zhǎng)5 067 bp, 開(kāi)放閱讀框(ORF)含4 992 bp, 編碼1 663個(gè)氨基酸, 含有信號(hào)肽、多絲氨酸區(qū)域, 推測(cè)其編碼氨基酸分子量為186.2 ku, 等電點(diǎn)為9.31。熒光定量PCR結(jié)果顯示, Vg在諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟中表達(dá)量最高。E2誘導(dǎo)后, 諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟中Vg mRNA的表達(dá)量第1天達(dá)到小高峰, 第3天達(dá)到高峰, 第7天開(kāi)始明顯下降, 第11天仍能維持較高水平。本研究成功克隆了諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因全長(zhǎng)cDNA序列, 諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟是Vg主要合成場(chǎng)所, E2誘導(dǎo)雄性諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg的表達(dá)作為生物標(biāo)志物用于近海環(huán)境雌激素類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景。

諸氏鯔蝦虎魚(yú)(); 卵黃蛋白原; cDNA全長(zhǎng); 熒光定量PCR; 17b-雌二醇

卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg)是幾乎所有卵生動(dòng)物中卵黃蛋白(Vitellins, Vn)的前體[1], 為雌性動(dòng)物特有的蛋白, 在雄性動(dòng)物體內(nèi)含量極低或完全沒(méi)有, 但在雌激素類(lèi)物質(zhì)的的誘導(dǎo)下, 雄性動(dòng)物也能合成卵黃蛋白原[2], 這種受雌激素類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)的特性, 使得卵黃蛋白原被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的毒性評(píng)價(jià), 已成為外源雌激素和內(nèi)分泌干擾物毒理研究的理想生物標(biāo)志物[3]。

魚(yú)類(lèi)是水環(huán)境生態(tài)鏈中重要的一環(huán), 是理想的水環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)生物, 目前已有多種魚(yú)類(lèi)用于環(huán)境雌激素的研究[4-5], 其中斑馬魚(yú)()[6]、劍尾魚(yú)()[7]、唐魚(yú)()[8]、青鳉()[9]等多種魚(yú)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在卵黃蛋白原(Vg)水平開(kāi)展了相關(guān)的研究。河口與近海水域是陸地水流與海洋的交匯處, 也是環(huán)境污染物的匯聚地, 但河口魚(yú)類(lèi)在環(huán)境雌激素效應(yīng)方面的研究較少。諸氏鯔蝦虎魚(yú)() 屬于鱸形目(Perciformes), 蝦虎魚(yú)科(Gobiidae), 鯔蝦虎魚(yú)屬(), 為暖水性底層小型魚(yú)類(lèi), 棲息于河口、咸淡水水域中, 具有體形小、適應(yīng)鹽度范圍廣、對(duì)許多毒物敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)[10]。諸氏鯔蝦虎魚(yú)作為一種海洋水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 已開(kāi)展海洋污染物的相關(guān)毒性評(píng)價(jià)[11-12]。本研究以諸氏鯔蝦虎魚(yú)為實(shí)驗(yàn)材料, 克隆了諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因全長(zhǎng)cDNA序列, 并對(duì)Vg在諸氏鯔蝦虎魚(yú)體內(nèi)的組織分布及雌激素誘導(dǎo)后不同時(shí)間表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了研究, 為諸氏鯔蝦虎魚(yú)應(yīng)用于近海環(huán)境雌激素類(lèi)污染物的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用諸氏鯔蝦虎為本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁殖的子9代封閉群(4~5月齡), 半靜態(tài)方式養(yǎng)殖, 體長(zhǎng)23~34 mm,水質(zhì)條件為鹽度25±2, 溫度(26±2)℃, 光周期14 h︰10 h (光照︰黑暗)。

1.2 諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增及序列分析

總RNA提取: 取3尾雌性諸氏鯔蝦虎魚(yú)新鮮肝臟組織并混合, 按Trizol(Invitrogen)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA, 超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000C, Thermo Scientific)測(cè)定RNA純度和濃度, 計(jì)算加入的RNA樣本量(Total RNA 400 ng), 按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

Vg cDNA克隆: 根據(jù)GenBank中已知魚(yú)類(lèi)黃鰭刺蝦虎魚(yú)()(AB088473.1)Vg-530cDNA序列, 合成1對(duì)引物PVg(表1)。以第一鏈cDNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 根據(jù)獲得的Vg基因片段分別設(shè)計(jì)5′RACE下游巢式引物5′GSP 外側(cè)和5′GSP 內(nèi)側(cè)、3′RACE上游巢式引物 3′GSP 外側(cè)和3′GSP 內(nèi)側(cè)(表 1), PCR擴(kuò)增方法參照劉春等[13]的方法進(jìn)行, PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收 (Omega) 純化后與pMD-19T載體( Takara) 連接, 挑取陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

表1 引物序列

序列分析: 測(cè)序獲得的序列用DNAstar7.1分析軟件進(jìn)行全長(zhǎng)拼接, 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)與已知魚(yú)類(lèi)Vg氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析, 用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。采用在線翻譯工具( http: //www.expasy.ch) 對(duì)序列進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)組分析[14]。

1.3 諸氏鯔蝦虎魚(yú)不同組織器官中Vg的表達(dá)

隨機(jī)挑選3尾雌性諸氏鯔蝦虎魚(yú)(4~5月齡), 分別取肝、脾、腸、鰓、肌肉、腦、卵巢組織, 取3個(gè)平行樣品, 按1.2中的方法進(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

根據(jù)諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因cDNA序列, 用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)熒光定量檢測(cè)引物RT-Vg和內(nèi)參基因β-actin的引物RT-act(表1), 采用熒光定量PCR技術(shù)(ABI 7500)對(duì)諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝、脾、腸、鰓、肌肉、腦、卵巢組織(=3)中的Vg表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè), 并以b-actin為內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析[13]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss17.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析, excel軟件作圖。

1.4 雌激素誘導(dǎo)不同時(shí)間諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟中Vg的表達(dá)

挑選已具備性特征的雄性諸氏鯔蝦虎魚(yú)(4~5月齡)暴露于100 μg/L的β-雌二醇[13](溶解于無(wú)水乙醇), 每組20尾, 每組3個(gè)平行, 同時(shí)設(shè)置海水對(duì)照組, 對(duì)照組加入同樣濃度的無(wú)水乙醇(終濃度<0.01%)。暴露時(shí)間為11 d, 每天更換一次試液。每天投喂適量鹵蟲(chóng)()無(wú)節(jié)幼體, 分別在1、3、5、7、9、11 d取3尾魚(yú)肝臟組織混合, 凍存于液氮中。

按1.2中的方法對(duì)上述樣品進(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板, 采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)雌激素誘導(dǎo)后諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟中的Vg進(jìn)行檢測(cè), 檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)分析同1.3。

2 結(jié)果

2.1 諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因cDNA 序列擴(kuò)增及結(jié)構(gòu)分析

用DNAStar軟件對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因核心片段、3′端、5′端序列片段進(jìn)行拼接, 獲得諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因的全長(zhǎng) cDNA 序列。該序列全長(zhǎng)5067 bp, 包含起始密碼子ATG、終止密碼子TAG及加尾信號(hào)AATAAA, 在GenBank庫(kù)中的登錄號(hào)為KP162167。鯔蝦虎魚(yú)卵黃蛋白原基因cDNA序列含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF), 編碼1663個(gè)氨基酸, N-端的前15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽, 有4個(gè)糖基化位點(diǎn), 其中2個(gè)可能是有效的糖基化位點(diǎn)在112~114, 1133~1135。序列還含有一個(gè)多聚絲氨酸區(qū)(氨基酸位點(diǎn)在1088~1187)。根據(jù)推算, 其編碼的蛋白分子量為186.2 ku, 等電點(diǎn)為9.31。該基因的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列如圖1。

信號(hào)肽位置用水平線標(biāo)出, 陰影部分為多聚絲氨酸區(qū)域, 黑色框?yàn)榧游残盘?hào)

The signal peptide site of vitellogenin is marked by the horizontal line, polyserine domain is indicated by shading, polyadenylation signal is indicated by black border

2.2 諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因氨基酸同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因編碼的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索、比對(duì), 結(jié)果顯示與同屬于蝦虎魚(yú)科的黃鰭刺蝦虎魚(yú)(BAC06190.1)、矛尾刺蝦虎魚(yú)(AAV84912.1)同源性最高, 均為73%, 與小長(zhǎng)臂蝦虎魚(yú)(AGO64301.1)、北方藍(lán)鰭金槍魚(yú)()(ACX32463.1)、金頭鯛()(CDK37743.1)氨基酸同源性分別為59%、52%、50%, 與其他幾種魚(yú)類(lèi)氨基酸同源性為47%~43%(表2)。選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中15種硬骨魚(yú)類(lèi)的Vg基因氨基酸序列, 利用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 分子進(jìn)化分析表明, 諸氏鯔蝦虎魚(yú)與黃鰭刺蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)聚為一支, 親緣關(guān)系最近(圖2)。

表2 諸氏鯔蝦虎魚(yú)與其他魚(yú)類(lèi)Vg基因氨基酸同源性比較

節(jié)點(diǎn)處數(shù)值為自展置信值, 自展重復(fù)1000次

The degree of confidence for each branch point was determined by bootstrap analysis (1000 repetitions)

2.3 Vg在諸氏鯔蝦虎魚(yú)的組織分布

利用熒光定量RT-PCR方法對(duì)雌性諸氏鯔蝦虎魚(yú)7個(gè)組織中Vg的表達(dá)情況結(jié)果如圖3所示。諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg在肝臟中相對(duì)表達(dá)量最高, 脾、腸中有極微量表達(dá)(均小于肝臟表達(dá)量的1%), 鰓、腦、肌肉、卵巢中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá), 肝中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他各組織中的相對(duì)表達(dá)量相比(<0.01)。

2.4 雌激素誘導(dǎo)后諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟中Vg的表達(dá)規(guī)律

雌激素誘導(dǎo)雄性諸氏鯔蝦虎魚(yú), 不同時(shí)間肝臟中Vg的相對(duì)表達(dá)結(jié)果如圖4。由圖可知, 在試驗(yàn)期間內(nèi), E2誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟中Vg的相對(duì)表達(dá)量在雌激素誘導(dǎo)后均顯著高于對(duì)照組(< 0.01); 諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟中Vg相對(duì)表達(dá)量第1天即達(dá)到小高峰, 第3天相對(duì)表達(dá)量顯著高于第1天相對(duì)表達(dá)量, 達(dá)到高峰(<0.01); 第7天開(kāi)始明顯下降, 相對(duì)表達(dá)量顯著低于第5天相對(duì)表達(dá)量(<0.05); 至第11天仍能維持較高水平, 但與第7天相比沒(méi)有顯著性差異(>0.05)。

a. 與對(duì)照組相比差異極顯著(<0.01); b. 與前一時(shí)間點(diǎn)相比差異顯著(<0.05); c. 與前一時(shí)間點(diǎn)相比差異極顯著(<0.01)

a. extremely significant difference compared with the control group (<0.01); b. significant difference compared with the former point (<0.05); c. extremely significant difference compared with the former point (<0.01)

3 討論

3.1 諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg基因結(jié)構(gòu)分析

卵黃蛋白原基因大都起源于一個(gè)共同的祖先基因, 不同氨基酸功能區(qū)域進(jìn)化速度存在較大差異, 既含進(jìn)化較快的富含絲氨酸區(qū)域, 也有進(jìn)化速度極慢的高保守結(jié)構(gòu)區(qū)域[15]。在種間進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析時(shí)能表現(xiàn)出很高的分辨率, 因此可以用于進(jìn)化關(guān)系較近的物種間的系統(tǒng)進(jìn)化研究[16]。本實(shí)驗(yàn)從雌性諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝組織中克隆得到5 067 bp的Vg基因全長(zhǎng)cDNA序列, 該序列ORF編碼的氨基酸序列與GenBank中登陸的15種魚(yú)類(lèi)Vg的ORF比對(duì), 與同屬于蝦虎魚(yú)科的黃鰭刺蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)同源性最高為73%, 與其他13種魚(yú)類(lèi)同源性為59%~ 43%。以擴(kuò)增得到的諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg氨基酸序列與15種魚(yú)類(lèi)Vg氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 諸氏鯔蝦虎魚(yú)與同為蝦虎魚(yú)科的黃鰭刺蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)聚為一支, 其親緣關(guān)系較近, 上述結(jié)果表明, 本實(shí)驗(yàn)成功克隆了諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg全長(zhǎng)cDNA序列。

Vg基因是由多個(gè)基因編碼的相關(guān)蛋白組成的一個(gè)多基因家族, 魚(yú)類(lèi)也被證實(shí)存在多種形式的Vg[15, 17]。由于 Vg 結(jié)構(gòu)和功能的多樣性, 目前Vg沒(méi)有統(tǒng)一的命名和分類(lèi)規(guī)則, Hiramatsu等[18]根據(jù)Vg 結(jié)構(gòu)氨基端脂磷蛋白重鏈(LvH)-高磷蛋白-脂磷蛋白輕鏈(LvL)-β組分-羧基端編碼序列 (β-c)的區(qū)別, 將Vg分為 VgA、VgB和VgC 3類(lèi)。在不同種類(lèi)的魚(yú)類(lèi)中, Vg 分子結(jié)構(gòu)同樣具有多樣性, 根據(jù)卵細(xì)胞中降解程度的差異可分為VgA 和 VgB, 但都具有完整的PV結(jié)構(gòu), VgC結(jié)構(gòu)中則缺乏 PV結(jié)構(gòu)或PV結(jié)構(gòu)較短, 分子量也較小[19]。本研究所得的諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg序列編碼1663個(gè)氨基酸, 明顯多于劍尾魚(yú)VgC(1250 aa)、小長(zhǎng)臀蝦虎魚(yú)VgC(1238aa)編碼的氨基酸序列, 且該序列ORF編碼的氨基酸序列在GenBank中比對(duì)結(jié)果顯示, 與其編碼的氨基酸序列相似性最高的前10種魚(yú)類(lèi), 除黃鰭刺蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)Vg沒(méi)有明確分類(lèi)外, 其余魚(yú)類(lèi)均為VgA, 因此所得序列可能為諸氏鯔蝦虎魚(yú)VgA。

3.2 諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg mRNA表達(dá)的組織分布

卵黃蛋白原有內(nèi)源性卵黃蛋白原合成和外源性卵黃蛋白原合成兩種合成方式, 在卵生脊椎動(dòng)物中, Vg在肝臟內(nèi)合成, 通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸至卵巢, 最后儲(chǔ)存在卵母細(xì)胞中為胚胎發(fā)育提供能量[20-21]。目前多數(shù)研究認(rèn)為肝臟是魚(yú)類(lèi)卵黃蛋白原合成組織, 魚(yú)類(lèi)主要進(jìn)行外源性的卵黃蛋白原合成。Yan等[22]發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)和青鳉Vg A基因只在雌魚(yú)肝臟中表達(dá), 在肌肉、腸、卵巢中均無(wú)發(fā)現(xiàn)。劉春等[13]研究表明, 肝是劍尾魚(yú)Vg C主要合成場(chǎng)所, 表達(dá)量最高, 脾、腎、卵巢有微量表達(dá), 腦、肌肉、鰓幾乎無(wú)表達(dá)。本研究用熒光定量PCR方法對(duì)諸氏鯔蝦虎魚(yú)雌魚(yú)7個(gè)組織器官進(jìn)行了Vg mRNA表達(dá)量的檢測(cè), 結(jié)果顯示Vg mRNA在肝臟中表達(dá)量最高, 脾、腸中有極微量表達(dá)(<1%), 鰓、腦、肌肉、卵巢中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá), 表明肝臟是諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg合成的主要場(chǎng)所。

3.3 雌二醇誘導(dǎo)后的雄性諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg mRNA表達(dá)規(guī)律

Vg是包括魚(yú)類(lèi)在內(nèi)的雌性動(dòng)物特有的一種蛋白,但在雌激素誘導(dǎo)下雄魚(yú)也能產(chǎn)生該蛋白[23], 魚(yú)類(lèi)體內(nèi)Vg這種特性, 使其成為檢測(cè)外源雌激素和內(nèi)分泌干擾物的最為普遍的方法之一[24], 多種魚(yú)類(lèi)開(kāi)展了水環(huán)境雌激素效應(yīng)相關(guān)的研究。劉春等[13]研究發(fā)現(xiàn), 100mg/L的17b-雌二醇(E2)誘導(dǎo)雄性劍尾魚(yú)后, 肝臟Vg mRNA相對(duì)表達(dá)量在誘導(dǎo)后第1天達(dá)到小高峰, 第5天達(dá)到高峰, 第9天后維持相對(duì)低的表達(dá)量。Yan等[22]研究表明, 1mg/L E2誘導(dǎo)后的斑馬魚(yú)Vg A mRNA在第2天達(dá)到小高峰, 在30 d達(dá)到高峰, 0.1mg/L E2誘導(dǎo)后的青鳉Vg A mRNA在第3天和12天達(dá)到高峰。黃曄等[6]用250 ng/L E2誘導(dǎo)雄性斑馬魚(yú), 第4天肝臟Vg mRNA才檢測(cè)到表達(dá)。劍尾魚(yú)、斑馬魚(yú)、青鳉Vg mRNA表達(dá)規(guī)律不一致, 除物種不同外, 還可能為E2誘導(dǎo)濃度不同所致。本研究中諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg mRNA表達(dá)規(guī)律與劍尾魚(yú)研究結(jié)果相似, 但諸氏鯔蝦虎魚(yú)肝臟Vg mRNA表達(dá)高峰維持時(shí)間更長(zhǎng), 這可能與魚(yú)的種類(lèi)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明, 雌二醇能顯著誘導(dǎo)雄性諸氏鯔蝦虎魚(yú)Vg的表達(dá), 諸氏鯔蝦虎魚(yú)體內(nèi)Vg作為生物標(biāo)志物用于近海環(huán)境雌激素類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Full-length cDNA cloning and expression analysis of vitellogenin gene in

YU Lu-jun, CAI Lei, LI Ge, CHEN Xiao-qu, CHEN Lin, LI Jian-jun

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Key Laboratory of Guangdong Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China)

To explore the tissue distribution of the vitellogenin (Vg) gene inand the effect of the pollutant 17β-estradiol on male, the full length of vitellogenin (Vg) cDNA inwas cloned by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques using total RNA extracted from the liver of female fish. Meanwhile, the expression of Vg mRNA ofwas determined by real-time fluorescent quantitative PCR. The full length of’s Vg cDNA sequence contains 5 067 bp nucleotides, with a complete open reading frame (ORF) of 4 992 bp, which encodes 1 664 amino acid proteins with a deduced protein molecular weight of 186.2 ku. The ORF contains signal peptides and a polyserine domain. The real-time RT-PCR result showed that’s Vg mRNA was primarily detected in the liver. Furthermore, Vg mRNA expression levels at different time points of E2 treatment of male fish were determined.’s Vg mRNA expression levels reached the peak on the third day and then the expression levels declined on the seventh day. These results indicated that the full length of Vg cDNA inwas cloned successfully. This study suggests that Vg in malecan be considered as a valid biomarker for offshore environmental monitoring of estrogenic substances.

; vitellogenin; full-length cDNA; quantitative real-time RT-PCR; 17β-estradiol

Feb. 1, 2015

X171; S917

A

1000-3096(2016)09-0023-09

10.11759//hykx 20150201004

2015-02-01;

2015-04-27

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAK11B902); 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B010500021, 2012B040302006)

余露軍(1982年-), 男, 湖南岳陽(yáng)人, 工程師, 碩士, 主要從事水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其病害方面的研究, 電話: 020-84106815, E-mail: ljyu1212@163.com; 李建軍, 通信作者, E-mail: lijianjun1125@126.com

[Foundation: National Key Technology Support Program (2013BAK11B902);Science and Technology Program of Guangdong Province (2011B010500021, 2012B040302006)]