神經降壓素受體1在大鼠肺缺血再灌注損傷中的表達及作用*

周志毅，朱幸沨，孫潔，陳靜瑜，楊國儀

（江蘇省無錫市人民醫(yī)院1.病理科；2.胸外科，江蘇 無錫 214023；3.江蘇省人體器官移植重點實驗室，江蘇 無錫 214023）

論著

神經降壓素受體1在大鼠肺缺血再灌注損傷中的表達及作用*

周志毅1，朱幸沨2，孫潔3，陳靜瑜2，楊國儀1

（江蘇省無錫市人民醫(yī)院1.病理科；2.胸外科，江蘇 無錫 214023；3.江蘇省人體器官移植重點實驗室，江蘇 無錫 214023）

目的觀察神經降壓素受體1（NTR1）在大鼠肺缺血再灌注損傷LIRI模型中的表達和作用及其與Toll樣受體4（TLR4）和缺氧誘導因子（HIF-1α）的關系，探討NTR1在LIRI中的病理作用機制。方法40只雄性SD大鼠，分為8組進行觀察。①假手術組；②LIRI組；③LIRI+生理鹽水對照組；④LIRI+DMSO對照組；⑤LIRI+脂多糖干預組（TLR4激活組）；⑥LIRI+TAK-242干預組（TLR4抑制組）；⑦LIRI+NT干預組（NTR1激活組）；⑧LIRI+SR48692干預組（NTR1抑制組）。制作大鼠原位LIRI模型，取各組大鼠左肺組織，觀察肺組織病理變化、行逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白質印跡法檢測，統計分析NTR1在大鼠LIRI模型中的表達及作用及其與TLR4和HIF-1α的關系。結果肺IRI組NTR1 mRNA及蛋白的表達較假手術組增加（P＜0.05）；NT可進一步增加LIRI的炎癥因子水平、細胞凋亡及肺組織病理損傷，而SR48692可減輕上述改變（P＜0.05）；與LIRI組比較，脂多糖干預組NTR1表達進一步增強，而TAK-242干預組NTR1表達則受到抑制（P＜0.05）；與LIRI組比較，HIF-1α mRNA和蛋白表達被SR48692抑制，而被NT增強（P＜0.05）。結論 NT-NTR1與LIRI關系密切，參與了LIRI的發(fā)病機制，在LIRI中，可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α信號通路，本研究為發(fā)現新的LIRI有效治療靶點提供了理論依據。

大鼠；肺；缺血再灌注損傷；NTR1；TLR4

肺移植是終末期肺疾病患者的唯一治療方案，但約20%肺移植會發(fā)生肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI），LIRI是原發(fā)性移植肺功能衰竭的最主要原因，后者的死亡率高達60%[1]。炎癥性損傷是LIRI的重要相關因素，與LIRI的成因密切相關。目前，神經降壓素（neurotensin，NT）及神經降壓素受體1（neurotensin receptor 1，NTR1）已被證實與炎癥病理過程有密切關系。炎癥因子Toll樣受體4（TLR4）特異性激動劑LPS刺激可促進NTR1介導的炎癥作用，如上調IL-8表達[2]。說明NTR1可能參與了缺血再灌注損傷病理過程，NTR1是否參與LIRI及TLR4介導的炎癥病理過程還不明確。另有研究表明，NT-NTR1可通過活化缺氧誘導因子（HIF-1α）調控大腸炎的炎癥過程[3]。本實驗通過建立大鼠LIRI及干預模型，觀察NTR1在LIRI中的表達、NTR1對LIRI的作用及NTR1與TLR4和HIF-1α的關系，從而探討NTR1在LIRI中的病理作用機制及可能存在的信號通路，為尋找新型治療手段提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠，體重250～300 g，40只，購于揚州大學比較醫(yī)學中心。采用隨機數字表法將SD大鼠分為8組，每組5只：①假手術組；②LIRI組；③LIRI+生理鹽水對照組，靜脈注射生理鹽水2 ml；④LIRI+DMSO對照組，靜脈注射2 ml DMSO；⑤LIRI+脂多糖干預組，將1.5 mg的TLR4特異性激活劑脂多糖溶于2 ml生理鹽水中，靜脈注射；⑥LIRI+TAK-242干預組，將TLR4特異性抑制劑TAK-242 10 mg/kg溶于2 ml DMSO，靜脈注射；⑦LIRI+NT干預組，將4 nmol/kg的NT溶于2 ml生理鹽水，靜脈注射；⑧LIRI+SR48692干預組，將2 mg/kg的SR48692溶于2 ml DMSO，腹腔注射。各組均在阻斷肺門前30 min進行上述相應的處理。

1.2 大鼠LIRI模型的建立

參照FARVIAI等[4]的制作方法建立原位大鼠LIRI模型，阻斷大鼠左肺門1 h，再灌注3 h。具體為：經大鼠腹腔注射15 g/L的戊巴比妥鈉溶液60 mg/kg進行麻醉，并腹腔注射0.5 mg/ml阿托品0.1 mg，皮下注射肝素1 000 IU/kg。大鼠經口氣管插管，置入14G靜脈留置針套管（長度45 mm），接動物呼吸機維持呼吸，通氣頻率為70～75次/min，潮氣量為10 ml/kg，呼氣末正壓為2 cmH2O（0.196 kPa），吸入氧濃度為21%。動物保持右側臥位，沿左側第5肋間作3 cm切口，切開胸廓，暴露左肺門，游離下肺韌帶。于吸氣時完全阻斷左肺門，1 h后恢復血流灌注，實驗過程中腹腔注射生理鹽水0.5 ml/h，于恢復血流后3 h時完整切取左肺。假手術組不阻斷肺門，其他操作同LIRI組。

1.3 檢測項目

1.3.1 各組肺組織中NTR1、HIF-1α、白細胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）等mRNA表達的檢測采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）進行檢測，引物序列詳見表1。用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，實驗操作按產品說明書進行，然后以cDNA為模板，利用各基因的檢測引物進行PCR。擴增程序為：95℃10 min，然后以95℃15 s、60℃60 s、為1個循環(huán)，進行40個循環(huán)。用ABI7900HT型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

表1 相關基因的引物序列

1.3.2 各組肺組織中相關蛋白的表達采用蛋白質印跡法進行定量檢測。取-80℃凍存各組大鼠肺組

織各100 mg，加入2～3 ml的組織蛋白裂解液，勻漿器將組織研碎，取出勻漿液4℃離心（16 000 r/min）15 min。取上清液，按BCA法測定蛋白濃度。等量蛋白上樣進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，用PVDF膜轉膜(濕轉法)。一抗包括NTR1（1∶500，美國abcam公司）及HIF-1α（1∶300，美國abcam公司），并在同樣情況下測定內參β肌動蛋白（β-actin），將同一條件下待測蛋白與β-actin的吸光度值進行統計。

1.3.3 各組肺組織病理學檢查取大鼠左肺中部1/3肺組織，加入4%多聚甲醛固定，行HE染色，顯微鏡下觀察肺泡和間質水腫、中性粒細胞浸潤以及出血情況，肺損傷嚴重性評分參考相關文獻[5]。

1.3.4 各組肺組織細胞的凋亡采用原位末端標記法（TUNEL）進行檢測。采用TUNEL技術標記肺組織石蠟切片中凋亡細胞核DNA3’OH，替代TUNEL反應液作陰性對照，方法參照試劑盒說明書，顯微鏡下觀察凋亡細胞核為棕褐色，正常細胞核呈淡藍色。每張玻片隨機選取6個視野（×400倍），觀察凋亡細胞，并計算凋亡指數（凋亡細胞數/整個視野細胞數×100%）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示。各組間的數據用單因素方差分析One-way ANOVA進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 假手術組及LIRI組中NTR1 mRNA及蛋白的表達

兩組肺組織中NTR1 mRNA及蛋白的表達情況詳見圖1。LIRI組NTR1 mRNA及蛋白的表達較假手術組增加，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 各組肺組織中炎癥因子、細胞凋亡、肺損傷及肺組織病理改變情況的比較

為了進一步探討NTR1表達在LIRI中的作用，應用NT及特異性NTR1抑制劑SR48692，發(fā)現NT可進一步增加炎癥因子水平（TNF-α和IL-6，圖2）、細胞凋亡（圖3）及肺組織病理損傷，而SR48692可減輕LIRI模型的上述改變；LIRI組肺組織呈現明顯的彌漫性肺泡損傷，包括炎癥、肺間隔水腫、肺泡內出血、肺不張及充血，NT可增強上述肺損傷，肺損傷嚴重性評分增加，而SR48692則起減輕作用（表2、圖4）。

圖1 兩組大鼠肺組織中NTR1蛋白及mRNA的表達

圖2 各組肺組織中IL-6、TNF-α mRNA表達的比較

2.3 各組肺組織中TLR4對NTR1表達的影響

經蛋白質免疫印跡檢測發(fā)現，與LIRI組比較，脂多糖干預組NTR1表達進一步增強，TAK-242干預組NTR1表達則受到抑制（P＜0.05）（圖5）。

與LIRI組比較，HIF-1α mRNA和蛋白表達被SR48692抑制，而被NT增強（P＜0.05，圖6）。

圖3 各組肺組織中細胞凋亡情況（TUNEL×200）

圖4 各組肺組織的病理改變情況（HE×200）

圖5 在LIRI模型中，TLR4調控NTR1蛋白及mRNA的表達

圖6 在LIRI模型中，NTR1調控HIF-1α蛋白及mRNA的表達

表2 各組凋亡指數及肺缺血再灌注（IRI）損傷嚴重性評分的比較（±s）

表2 各組凋亡指數及肺缺血再灌注（IRI）損傷嚴重性評分的比較（±s）

注：與LIRI組比較，1）F=71.46，P=0.000；2）F=60.48，P=0.000；3）F=48.05，P=0.000；4）F=22.17，P=0.000

組別凋亡指數肺損傷嚴重性評分假手術組0.60±0.402.40±0.24 LIRI組22.60±1.699.60±0.40 LIRI+DMSO對照組23.00±1.649.00±0.71 LIRI+NT干預組30.40±1.891）12.80±0.732）LIRI+SR48692干預組12.80±1.883）7.00±1.104）

3 討論

在組織缺血基礎上恢復血流后炎癥反應介質增多，導致組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現象稱為缺血再灌注損傷。因此，炎癥性損傷是缺血再灌注損傷的重要相關因素，與其成因密切相關。在本研究中，LIRI的NTR1表達顯著上調，NT-NTR1在LIRI中促進了炎癥反應，發(fā)揮了損傷性病理作用，而炎癥相關因子TLR4顯著正調控NTR1表達，說明NT-NTR1參與并調節(jié)LIRI的病理過程，并且受TLR4的調控，可能是TLR4的下游信號，而NTR1信號可正調控HIF-1α表達，因此，本研究顯示，在LIRI的發(fā)生發(fā)展中可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α的信號通路。

NT參與炎癥病理過程的早期證據是由LAZARUS等[6]發(fā)現的，他們發(fā)現NT可通過高親和力受體與肥大細胞緊密結合，通過鈣動員及磷脂酶C激活釋放組胺，NTR1特異性抑制劑SR48692可阻止這一過程，表明該受體可直接激活肥大細胞，參與炎癥過程。研究表明，NT-NTR1參與了多種炎癥病理過程[2，7]：NT可作用于中性粒細胞、T淋巴細胞及巨噬細胞，促進炎癥細胞的增殖，并具有趨化作用，增強人血中性粒細胞的吞噬作用。配體結合研究表明，NT可通過外周血淋巴細胞表面的高親和力NT受體正調控淋巴細胞系MOLT-4的生長。在梭菌毒素A介導假膜性結腸炎模型中，梭菌毒素A注入結腸絆后，在發(fā)生分泌性及炎癥性病變前，結腸黏膜的NT/NTR1 mRNA及蛋白表達短期內即明顯增多，SR48692可抑制降低腸滲透性，減輕中性粒細胞浸潤、腸損傷及肥大細胞活性，并具有劑量依賴性。在炎癥腸病中，腸黏膜毛細血管內皮細胞表達的NTR1及NT結合可導致炎癥相關細胞因子的活化。NT可增強支氣管活化巨噬細胞IL-1β的表達，可刺激中性粒細胞黏附支氣管上皮細胞，調節(jié)氣道的炎癥反應。NT可顯著增加腹腔淋巴細胞的黏附性和化學趨向性，作用于硫膠質誘導的鼠腹膜巨噬細胞及骨髓來源巨噬細胞，可刺激兩者的吞噬活性。以上說明NT-NTR1與炎癥有著密切關系，在炎癥中發(fā)揮了重要的作用，也可能是LIRI發(fā)生發(fā)展的重要作用機制。在本研究中，LIRI組的NTR1 mRNA及蛋白表達較假手術組均增強，說明NTR1與LIRI具有密切相關性，為了進一步研究NTR1在LIRI中的作用機制，研究人員應用NTR1的激動劑NT及特異性抑制劑SR48692對LIRI組進行干預，發(fā)現NT可進一步增加LIRI的炎癥及病理損傷（包括炎癥因子、細胞凋亡及肺組織病理損傷），而SR48692可減輕LIRI模型的上述改變，進一步表明NTR1在LIRI的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。

至于NT-NTR1參與LIRI發(fā)生發(fā)展的分子信號機制目前還不清楚。在本組LIRI中，TLR4信號可正調控NTR1的表達，而NTR1可正調控HIF-1α的表達。PEREIRA等[8]研究發(fā)現，在穩(wěn)定的內環(huán)境中，施加LPS炎癥刺激，可上調成纖維細胞系的NT/NTR1表達，促進NT信號介導的炎癥過程，如上調IL-8表達，IL-8是一種強有力的中性粒細胞趨化因子。并有研究表明，NT-NTR1可通過活化HIF-1α調控大腸炎的炎癥及血管形成過程[3]。HIF-1α信號通路在能量代謝、炎癥反應及細胞增生與凋亡中起非常重要的作用，抑制HIF-1α的活性被認為是治療許多疾病的新靶點，這些疾病包括局部缺血、脂多糖介導的敗血癥、惡性腫瘤和慢性炎癥等[9-10]。在缺血性損傷或IRI預處理模型中，HIF-1α通常被認為是一種適應性因子，對器官起保護性作用[11]，事實是，HIF-1α的作用是保護性還是損害性可能依賴于損傷的類型及性質[12]。PEYSSONNAUX等[13]發(fā)現在早期膿毒癥中，脂多糖誘導的TLR4依賴性HIF-1α可引發(fā)炎癥細胞活素類的產生，抑制HIF-1α可減輕上述過程及膿毒癥的死亡率。有關研究已報道了HIF-1α在LIRI之TLR4信號中的損害性作用[14]。據上所述，在LIRI中，可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α信號通路，或是LIRI發(fā)生發(fā)展的分子機制之一，NTR1是其中重要的信號傳遞因子。NT–NTR1在炎癥中還可能存在其他信號通路。ZHAO[15-17]等發(fā)現，在NCM460腸上皮細胞中，NT–NTR1的作用依賴RhoA-NF-κB信號，NT使IkBα磷酸化降解，并促進NF-κB亞基

P65的磷酸化及轉錄，經由細胞內鈣動員及PKCα活性，促進IL-8轉導活性。老鼠空腸缺血再灌注損傷的NF-kB/IκB系統激活也與NT相關。以上表明炎癥中還存在NT-NTR1-NF-κB信號通路。

總之，本研究表明，NT-NTR1與LIRI關系密切，參與了LIRI的發(fā)病機制。在LIRI中，可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α信號通路，從而為發(fā)現新的LIRI有效治療靶點提供了理論依據。近來，有文獻表明[18]，NT-NTR1除了具有促急性炎癥的作用外，還可促進慢性黏膜炎癥的愈合。在炎癥及炎癥修復中起雙重作用。在急性炎癥中，NT通過NF-κB信號起促炎癥作用，而在慢性炎癥中，NT-NTR1可通過金屬蛋白酶-EGFR信號促進炎癥的修復。因此，需要以后在LIRI中做進一步的研究。

[1]DE PERROT M,LIU M,WADDELL T K,et al.Ischemia-reperfusion-induced lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167(4):490-511.

[2]ZHAO D,POTHOULAKIS C.Effects of NT on gastrointestinal motility and secretion,androle inintestinal inflammation[J]. Peptides,2006,27(10):2434-2444.

[3]BAKIRTZIK,WESTG,FIOCCHIC,etal.Theneurotensin-HIF-1α-VEGFαaxisorchestrateshypoxia,colonic inflammation,and intestinal angiogenesis[J].Am J Pathol,2014, 184(12):3405-3414.

[4]FARIVAR A S,MERRY H E,FICA-DELGADO M J,et al. Interleukin-6 regulation of direct lung ischemia reperfusion injury[J].Ann Thorac Surg,2006,82(2):472-478.

[5]VAN DER KAAIJ N P,KLUIN J,LACHMANN R A,et al. Alveolar preservation with high inflation pressure and intermediate oxygen concentration reduces ischemia-reperfusion injury of the lung[J].J Heart Lung Transplant,2012,31(5):531-537.

[6]LAZARUS L H,PERRIN M H,BROWN M R.Mast cell binding of neurotensin.I.Iodination of neurotensin and characterization of the interaction of neurotensin with mast cell receptor sites[J]. J Biol Chem,1977,252(20):7174-7179.

[7]ZHAO D,BAKIRTZI K,ZHAN Y,et al.Insulin-like growth factor-1 receptor transactivation modulates the inflammatory and proliferative responses of neurotensin in human colonic epithelial cells[J].J Biol Che,2011,286(8):6092-6099.

[8]PEREIRA D A,MIGUEL N B,MOURA L,et al.Neurotensin decreases the proinflammatory status of human skin fibroblasts and increases epidermal growth factor expression[J].Int J Inflam, 2014,2014:248240.

[9]NICHOLAS S A,SUMBAYEV V V.The role of redox-dependentmechanismsinthedownregulationofligand-induced Toll-like receptors 7,8 and 4-mediated HIF-1 alpha prolyl hydroxylation[J].Immunol Cell Biol,2010,88(2):180-186.

[10]HIERHOLZER C,HARBRECHT B G,BILLIAR T R,et al. Hypoxia-induciblefactor-1activationandcyclo-oxygenase-2 induction are early reperfusion-independent inflammatory events in hemorrhagic shock[J].Arch Orthop Trauma Surg,2001,121 (4):219-222.

[11]FRAISL P,ARAGONéS J,CARMELIET P.Inhibition of oxygen sensors as a therapeutic strategy for ischaemic and inflammatory disease[J].Nat Rev Drug Discov,2009,8(2):139-152.

[12]FEINMAN R,DEITCH E A,WATKINS A C,et al.HIF-1 mediatespathogenicinflammatoryresponsestointestinalischemia-reperfusion injury[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2010,299(4):833-843.

[13]PEYSSONNAUX C,CEJUDO-MARTIN P,DOEDENS A,et al. Cutting edge:Essential role of hypoxia inducible factor-1alpha in development of lipopolysaccharide-induced sepsis[J].J Immunol,2007,178(12):7516-7519.

[14]周志毅,朱幸楓,陳靜瑜,等.缺氧誘導因子-1α在TLR4信號通路介導的大鼠肺缺血再灌注損傷中的影響[J].中華器官移植雜志,2014,35(09):561-566.

[15]ZHAO D,KEATES A C,KUHNT-MOORE S,et al.Signal transduction pathways mediating neurotensin-stimulated interleukin-8 expression in human colonocytes[J].J Biol Chem,2001,276(48): 44464-44471.

[16]ZHAO D,KUHNT-MOORE S,ZENG H,et al.Neurotensin stimulates IL-8 expression in human colonic epithelial cells through Rho GTPase-mediated NF-kappa B pathways[J].Am J Physiol Cell Physiol,2003,284(6):C1397-1404.

[17]ZHAO D,POTHOULAKIS C.Rho GTPases as therapeutic targets for the treatment of inflammatory diseases[J].Expert Opin Ther Targets,2003,7(5):583-592.

[18]ZHAO D,ZHAN Y,KOON H W,et al.Metalloproteinase-dependent transforming growth factor-alpha release mediates neurotensin-stimulatedMAPkinaseactivationinhumancolonic epithelial cells[J].J Biol Chem,2004,279(42):43547-43554.

（張蕾 編輯）

Effect of NTR1 expression in rats with lung ischemia-reperfusion injury and mechanism*

Zhi-yi Zhou1,Xing-feng Zhu2,Jie Sun3,Jing-yu Chen2,Guo-yi Yang1
(1.Department of Pathology,Wuxi People's Hospital,Wuxi,Jiangsu 214023,China;2.Department of Thoracic Surgery,Wuxi People's Hospital,Wuxi,Jiangsu 214023,China;3.Jiangsu Key Larboratory of Human Organ Transplantation,Wuxi,Jiangsu 214023,China)

Objective To investigate neurotensin receptor 1(NTR1)expression and the effect and mechanism of NTR1 expression in rats with lung ischemia-reperfusion injury(LIRI).Methods Forty SD rats were randomly grouped as Sham group,LIRI group,LIRI+saline control group,LIRI+DMSO control group,LIRI+TLR4-activated group, LIRI+TAK-242 group(TLR4-inhibited group),LIRI+NTR1-activated group and LIRI+NTR1-inhibited group.The NTR1 expression and the role of NTR1 in the LIRI rats were detected with RT-PCR and Western blot and statistically analyzed.Results NTR1 mRNA and protein expressions in the LIRI group were significantly increased comparing with the sham group(P＜0.05).NT further increased the levels of inflammatory cytokines,apoptosis and lung pathological injury in the LIRI group,while SR48692 significantly reduced the above changes(P＜0.05). Compared with the LIRI group,NTR1 expression was further enhanced in the LIRI+LPS group and was significantly inhibited in the LIRI+TAK-242 group(P＜0.05).HIF-1α mRNA and protein expressions were significantly inhibited

rats；lung；ischemia-reperfusion injury；NTR1；TLR4

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.002

1005-8982（2016）22-0007-06

2016-04-06

無錫市醫(yī)院管理中心重大扶持項目（No：YGZF1110）；江蘇省人體器官移植重點實驗室開放課題（No：YK201303）

楊國儀，E-mail：yanggywin2013@163.com

by SR48692 and was significantly enhanced by NT compared with the LIRI group(P＜0.05).Conclusions There is a close relationship between NTR1 and LIRI.NT-NTR1 is involved in the pathogenesis of LIRI.There may be TLR4-NTR1-HIF-1α signal pathway in LIRI and the theoretical basis is provided to find new effective therapeutic targets in LIRI.