南極適冷菌Psychrobacter sp. G冷激蛋白基因Csp2039的表達(dá)分析*

李 陽(yáng)，車 帥，王 楨，林學(xué)政*

(1.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島，266061;2.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島， 266061)

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南極適冷菌Psychrobacter sp. G冷激蛋白基因Csp2039的表達(dá)分析*

李 陽(yáng)1,2，車 帥1,2，王 楨1,2，林學(xué)政1,2*

(1.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島，266061;2.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島， 266061)

以南極適冷菌Psychrobactersp. G為研究對(duì)象，利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對(duì)冷激蛋白基因Csp2039在不同溫度/鹽度脅迫條件下的表達(dá)特征進(jìn)行了研究。在轉(zhuǎn)錄水平上，qRT-PCR分析表明，冷激蛋白基因Csp2039的表達(dá)于6 h時(shí)顯著被低溫(0 ℃，10 ℃)和高溫(30 ℃)誘導(dǎo)；低鹽(0)脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)先被誘導(dǎo)后被抑制，在鹽度為15的脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)均被誘導(dǎo)，高鹽(90，120)時(shí)基因Csp2039的表達(dá)在6 h時(shí)顯著被誘導(dǎo)；在溫度和鹽度協(xié)同脅迫條件下，溫度為0 ℃時(shí)，無(wú)論鹽度高低，基因Csp2039的表達(dá)均顯著上升，而高溫(30 ℃)時(shí)，除2 h被低鹽誘導(dǎo)以外，其余條件下均顯著被抑制。在翻譯水平上，Western blot分析表明，冷激蛋白Csp2039的表達(dá)被低溫(0 ℃，10 ℃)顯著誘導(dǎo)，但高溫(30 ℃)對(duì)其抑制并不明顯；在低鹽(0，15)脅迫下，Csp2039蛋白的表達(dá)均被誘導(dǎo)，高鹽(90)脅迫下，Csp2039蛋白的表達(dá)先被抑制，然后逐漸升高；在溫度和鹽度協(xié)同脅迫條件下，低溫(0 ℃)時(shí)，當(dāng)鹽度為15時(shí)，Csp2039蛋白的表達(dá)被誘導(dǎo)，鹽度為90時(shí)，Csp2039蛋白的表達(dá)量被顯著抑制；而高溫(30 ℃)時(shí)，該蛋白在鹽度15時(shí)6 h的表達(dá)量最大，鹽度90時(shí)于6 h其表達(dá)被顯著抑制。比較分析表明，在轉(zhuǎn)錄水平上基因Csp2039表達(dá)量的變化更容易受溫度影響，而在翻譯水平上鹽度對(duì)Csp2039蛋白的影響作用大于溫度；基因Csp2039在翻譯水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答時(shí)間要遲于轉(zhuǎn)錄水平的。

Psychrobacter；冷激蛋白基因Csp2039；qRT-PCR；Western blot；表達(dá)分析

南極具有獨(dú)特的地理、環(huán)境和氣候特征，如寒冷、干燥、低營(yíng)養(yǎng)、強(qiáng)輻射等[1]。微生物在南極生態(tài)系統(tǒng)及物質(zhì)地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用，同時(shí)，基礎(chǔ)研究及開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景也很廣闊。在這一極端的生態(tài)系統(tǒng)中，生態(tài)學(xué)中處于明顯優(yōu)勢(shì)的是低溫微生物，主要嗜冷菌和適冷菌為主[2],具有多種適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制，如極地微生物可以產(chǎn)生在低溫下具有較高酶活力的低溫酶[3]；也可以通過(guò)降低細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度、碳鏈長(zhǎng)度以及增加支鏈脂肪酸的含量來(lái)提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而維持細(xì)胞膜功能[4-5]；冷激基因能夠正常表達(dá)產(chǎn)生冷激蛋白[6]等。冷激蛋白(cold shock protein，Csp)作為RNA的分子伴侶，可阻止mRNA在低溫下形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而保持基因的表達(dá)效率，提高蛋白合成能力，維持正常的生理功能[6]。

冷激蛋白是指生物體在低溫刺激下所產(chǎn)生的一系列小分子蛋白質(zhì)，廣泛存在于嗜冷和嗜溫微生物中[7-8]，包括大腸桿菌[9]、枯草芽孢桿菌[10]、球形節(jié)桿菌[11]、假單胞菌[12]等。大腸桿菌Csp蛋白家族主要包括9種冷激蛋白(CspA～CspI)，其中CspA，CspB，CspE，CspG和CspI與冷激適應(yīng)調(diào)制機(jī)制有關(guān)，均能被低溫誘導(dǎo)[13]，CspD對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期的DNA復(fù)制有抑制作用，但不能被低溫誘導(dǎo)[14]。在對(duì)冷激蛋白的研究中以對(duì)CspA的研究最多。CspA由70個(gè)氨基酸組成，三維結(jié)構(gòu)包括由5個(gè)反向平行的β鏈組成的2個(gè)β折疊的β桶狀結(jié)構(gòu)和7個(gè)表面芳香烴結(jié)構(gòu)，用來(lái)結(jié)合單鏈DNA[15]。大腸桿菌CspA基因序列在5'端有一段比較長(zhǎng)的高度保守的非翻譯區(qū)，對(duì)CspA基因表達(dá)起著非常重要的作用[15]；當(dāng)溫度降低時(shí)，CspA基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上升[16]。在極地細(xì)菌適應(yīng)低溫環(huán)境中冷激蛋白也起著重要的作用，低溫可以誘導(dǎo)冷激蛋白基因的表達(dá)以適應(yīng)外界溫度的變化[17]。南極適冷菌Psychrobactersp. G中有3個(gè)冷激蛋白基因，qRT-PCR研究表明，屬于CspA蛋白家族的基因Csp2039在低溫條件下(0 ℃)表達(dá)量顯著增加[18]。為進(jìn)一步了解南極細(xì)菌的生境適應(yīng)機(jī)制，本研究利用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)對(duì)南極適冷菌Psychrobactersp. G中的Csp2039基因在不同溫度、鹽度和溫鹽協(xié)同脅迫條件下、在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

南極適冷菌Psychrobactersp. G分離自南極喬治王島西南部的海水并保存于本實(shí)驗(yàn)室，該菌株的最適生長(zhǎng)溫度是20 ℃，最適生長(zhǎng)鹽度是45[19]。

南極適冷菌Psychrobactersp. G最適鹽度培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 14 g，溶解于1 L過(guò)濾后的青島近海海水(鹽度約為31)中，并于1×105Pa下濕熱滅菌20 min[18]，所使用不同鹽度培養(yǎng)基的成分見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Component of culture medium

1.2 冷激蛋白基因Csp2039原核表達(dá)體系的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與冷激蛋白基因Csp2039的擴(kuò)增

根據(jù)基因組測(cè)序結(jié)果(CP006265)，設(shè)計(jì)用于冷激蛋白基因Csp2039克隆的特異性引物，在其5′端分別引入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI的酶切位點(diǎn)(表2)。

表2 擴(kuò)增冷激蛋白基因Csp2039的特異性引物Table 2 Specific primers used in amplification of gene Csp2039

特異性引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成。以南極適冷菌Psychrobactersp. G的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 表達(dá)載體pET22b和目的基因的連接

目的基因Csp2039經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳分離后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)切膠回收目的片段，分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI對(duì)載體pET 22b和目的基因Csp2039進(jìn)行雙酶切，于37 ℃水浴中酶切過(guò)夜(12 h)后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收。調(diào)整目的基因DNA和載體的摩爾數(shù)比例約為1/10～1/5，加入T4 DNA連接酶，將混合反應(yīng)物于16 ℃水浴中過(guò)夜(12 h)連接，連接反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。

1.2.3 重組子的鑒定、轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)和重組蛋白的純化

挑取37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后在LB培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的單菌落，移種于含終濃度為100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。為確定插入基因片段的序列準(zhǔn)確性，送新鮮菌液至南京金斯瑞有限公司用T7引物測(cè)序。用普通質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)從重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確的菌液中提取質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)，涂布于重組子篩選平板。將獲得的表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)-pET22b+Csp2039用終濃度為1 mmol/L的IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

利用Ni+親和層析法純化目的重組蛋白，將濃縮后的純化重組蛋白送GenScript公司(南京)制備多克隆抗體(Order ID：5001978-1)。

1.3 脅迫處理

首先將菌株G在最適生長(zhǎng)溫度(20 ℃)和鹽度(45)條件下于250 mL的Zobell 2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待培養(yǎng)液OD600達(dá)到約0.5時(shí)(指數(shù)生長(zhǎng)期)，進(jìn)行如下脅迫處理：1)溫度脅迫：將菌株分別于0,10和30 ℃培養(yǎng)，并分別于2,6和12 h時(shí)各取樣2 mL于-80 ℃保存，將剩余菌液8 000 g離心5 min后用50 mmol Tris-HCl(pH=8.0)重懸，并用Constant Systems高壓細(xì)胞破碎儀(One Shot)破碎菌體，破碎后液體置于-20 ℃保存。2)鹽度脅迫：將OD600約為0.5的培養(yǎng)液于20 ℃下8 000 g離心5 min，收集菌體。將獲得的菌體分別重懸于與離心前體積相等的、鹽度分別為0,15,90和120的培養(yǎng)基中。重懸后的菌體分別于20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2,6和12 h后各取樣2 mL于-80 ℃保存，剩余菌液處理方法同溫度脅迫。3)溫度鹽度協(xié)同脅迫：按照鹽度脅迫的操作方法，將OD600約為0.5的培養(yǎng)液分別于如下條件下繼續(xù)培養(yǎng)：溫度0 ℃，鹽度15；溫度30 ℃，鹽度15；溫度0 ℃，鹽度90；溫度30 ℃，鹽度90。菌株于上述條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)2,6和12 h后各取樣2 mL于-80 ℃保存。最適生長(zhǎng)條件下(溫度為20 ℃，鹽度為45)繼續(xù)培養(yǎng)的菌株于相同時(shí)間點(diǎn)(2,6和12 h)取樣設(shè)為對(duì)照，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的差異表達(dá)分析。

1.4 qRT-PCR分析

利用RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取了經(jīng)不同溫度、鹽度脅迫處理和不同時(shí)間處理的菌株G的總RNA，獲得的總RNA的質(zhì)量通過(guò)測(cè)定其A260/A280值確定。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit (大連寶生物工程有限公司)將得到的1 000 ng RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBRPremixExTaqTMII(大連寶生物工程有限公司)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析。利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)用于基因Csp2039 qRT-PCR的引物(F:GCTAAAGGTTTTGGTT; R: GCTCAGCTTGTGGG)，內(nèi)參基因選定為GAPDH (F: AGTCAGGCACATTTAGCG; R:GGCATAGCCCCATTCATT)[18,20]。qRT-PCR程序參數(shù)設(shè)定：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，退火(Csp2039：44 ℃，GAPDH：51 ℃)20 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，退火(Csp2039：44 ℃，GAPDH：51 ℃)30 s，95 ℃ 30 s。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。基于臨界循環(huán)值(Ct)對(duì)基因Csp2039的mRNA進(jìn)行定量，采用相對(duì)Ct值法(2-ΔΔCt)處理所得數(shù)據(jù)，對(duì)照組基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1[21]，并對(duì)樣本的重復(fù)性以及樣本間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中為實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組比較。

1.5 Western blot檢測(cè)

冷激蛋白Csp2039不同脅迫條件下在翻譯水平上的表達(dá)研究采用Western blot技術(shù)進(jìn)行[22]。步驟如下：

1)SDS-PAGE電泳完成后，將濃縮膠部分去除，用適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡膠大約15 min；

2)根據(jù)膠的大小，剪一張同樣大小的PVDF膜，剪去一角作為正反面的標(biāo)記，PVDF膜要用適量的甲醇浸泡30 s后轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡膜約15 min；

3)根據(jù)PVDF膜的大小剪切4塊厚濾紙(濾紙的大小應(yīng)略大于PVDF膜的大小)，將剪好的濾紙放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，平衡約10 min；

4)向轉(zhuǎn)膜器的操作板上倒入少量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，從陽(yáng)極面到陰極面將濾紙、PVDF膜、SDS-PAGE膠按照濾紙-濾紙-PVDF膜-SDS-PAGE膠-濾紙-濾紙的順序疊加起來(lái)，每加一層時(shí)用玻璃棒趕出氣泡，并加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，保持電流恒定為280 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為100 min；

5)電轉(zhuǎn)完成后，PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TBST的封閉液中4 °C輕搖3 h；

6)一抗抗血清以1∶5 000稀釋于封閉液中4 ℃過(guò)夜；

7)用適量TBST洗膜3次，每次輕搖10 min；

8)Goat Anti Rabbit IgG [HRP]以1∶5 000稀釋于封閉液中，4 ℃輕搖3 h；

9)TBST洗膜3次，每次輕搖10 min；TBS洗膜1次，10 min；

10)加入發(fā)色液(9 mL TBS，1 mL 4-氯-1-萘酚，6 μL 30%H2O2)暗室中發(fā)色約40 min，到適當(dāng)程度以水終止。

完成以后，將有條帶的PVDF膜進(jìn)行灰度掃描，確定在翻譯水平上冷激蛋白基因Csp2039的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷激蛋白Csp2039在重組菌中的表達(dá)和純化

重組菌株pET22b+Csp2039/BL21(DE3)于20 ℃經(jīng)IPTG(為1 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)24 h，高壓細(xì)胞破碎后不同細(xì)胞組分分別與5×SDS上樣緩沖液混合煮沸，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯c未誘導(dǎo)對(duì)照相比較，重組菌株于分子量約7 kDa處出現(xiàn)了明顯條帶，與預(yù)測(cè)的Csp2039)分子量(6.5 kDa)基本一致。本研究將純化后的蛋白作為抗原送至GenScript公司(南京)進(jìn)行多克隆抗體的制備，經(jīng)檢測(cè)后確定為冷激蛋白Csp2039的有效多克隆抗體，制備好的抗體用于Western blotting，檢測(cè)冷激蛋白Csp2039不同脅迫條件下在翻譯水平上的表達(dá)情況。

圖1 Csp2039蛋白電泳圖

2.2 對(duì)溫度的應(yīng)答特征

冷激蛋白基因Csp2039的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平基本上是被低溫誘導(dǎo)的。

qRT-PCR(圖2)表明，菌株G的冷激蛋白基因Csp2039的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上于6 h時(shí)顯著被低溫(0 ℃，10 ℃)誘導(dǎo)，相對(duì)表達(dá)量最大，其中0 ℃時(shí)，其表達(dá)呈極顯著性差異，約為對(duì)照的8.0倍；在之后的6 h表達(dá)量逐漸下降，于12 h反而被顯著抑制。在高溫(30 ℃)時(shí)，Csp2039基因的表達(dá)先被抑制，在隨后的6 h顯著升高，表達(dá)量約為對(duì)照組的2.3倍；在之后的6 h中表達(dá)量又逐漸下降。

Western blot結(jié)果(圖3a)經(jīng)灰度掃描后分析極表明(圖3b)，冷激蛋白基因Csp2039在蛋白水平上的表達(dá)于6 h時(shí)被低溫(0 ℃，10 ℃)顯著誘導(dǎo)，被高溫(30 ℃)抑制，但應(yīng)答速度相對(duì)于轉(zhuǎn)錄水平滯后。在低溫(0 ℃，10 ℃)脅迫下，2 h時(shí)Csp2039蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯變化；當(dāng)溫度脅迫6 h時(shí)，蛋白Csp2039在低溫脅迫下的表達(dá)達(dá)到最大值，分別約為對(duì)照組的1.7倍(0 ℃)和1.9倍(10 ℃)。高溫(30 ℃)脅迫下，2 h時(shí)蛋白Csp2039的表達(dá)量也沒(méi)有明顯變化，6 h和12 h時(shí)的表達(dá)被抑制。

圖2 Csp2039基因?qū)囟让{迫的應(yīng)答特征

圖3 溫度脅迫下Csp2039蛋白的表達(dá)分析

2.3 對(duì)鹽度的應(yīng)答特征

qRT-PCR(圖4)表明，低鹽(0)條件下，基因Csp2039的表達(dá)在6 h時(shí)被顯著抑制；在鹽度為15的條件下，基因Csp2039的表達(dá)均被誘導(dǎo)，并在12 h達(dá)到最大，約為對(duì)照組的2.8倍。高鹽(90，120)時(shí)基因Csp2039的表達(dá)在2 h時(shí)被顯著抑制。

Western blot結(jié)果(圖5a)經(jīng)灰度掃描后分析表明(圖5b)，在低鹽(0)脅迫下，Csp2039蛋白的表達(dá)均被誘導(dǎo)，在12 h時(shí)達(dá)到最大；在鹽度為15的脅迫下，Csp2039蛋白的表達(dá)量顯著升高，并于2 h達(dá)到最大，約為對(duì)照組的3.8倍；在高鹽(90)脅迫下，Csp2039蛋白的表達(dá)量在2 h被抑制，然后顯著上升，于12 h時(shí)達(dá)到最大值，約為對(duì)照組的3.1倍；高鹽(120)時(shí)Csp2039蛋白的表達(dá)在6 h和12 h抑制程度不明顯?；駽sp2039在翻譯水平與轉(zhuǎn)錄水平對(duì)鹽度脅迫的應(yīng)答特征并不完全一致。

圖4 Csp2039基因?qū)}度脅迫的應(yīng)答特征

圖5 鹽度脅迫下Csp2039蛋白的表達(dá)分析

2.4 對(duì)溫度/鹽度的應(yīng)答特征

qRT-PCR(圖6)表明，在溫度/鹽度協(xié)同脅迫條件下，溫度為0 ℃時(shí)，無(wú)論鹽度高低，冷激蛋白基因Csp2039在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)均顯著上升，并且低鹽度(15)時(shí)其相對(duì)表達(dá)量要高于高鹽度(90)的，并于2 h時(shí)達(dá)到最大值，分別約為對(duì)照組的4.3倍和2.8倍；高溫(30 ℃)時(shí)，除在2 h低鹽(15)情況下基因Csp2039的表達(dá)稍被誘導(dǎo)，其余條件下Csp2039基因的表達(dá)均顯著被抑制。

Western blot(圖7a)經(jīng)灰度掃描后分析表明(圖7b)，低溫(0 ℃)脅迫下，當(dāng)鹽度為15時(shí)，Csp2039蛋白的表達(dá)于12 h時(shí)達(dá)到最大，約為對(duì)照組的1.7倍；當(dāng)鹽度為90時(shí)，Csp2039蛋白的表達(dá)被抑制。而在高溫(30 ℃)脅迫下，當(dāng)鹽度為15時(shí)于6 h Csp2039蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大，約為對(duì)照組的2.7倍，之后下降，12 h表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.7倍；當(dāng)鹽度為90時(shí)，Csp2039蛋白的表達(dá)量在2 h時(shí)升高，6 h時(shí)顯著下降，12 h時(shí)無(wú)明顯變化。在溫鹽協(xié)同脅迫作用下，基因Csp2039在翻譯水平與轉(zhuǎn)錄水平的應(yīng)答也不完全一致。

圖6 冷激蛋白Csp2039基因?qū)囟塞}度協(xié)同脅迫的應(yīng)答特征

圖7 溫鹽脅迫下Csp2039蛋白的表達(dá)分析

3 討 論

由于極地生態(tài)系統(tǒng)具有獨(dú)特性，因此為微生物在極端環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制研究提供了豐富的資源。南極細(xì)菌Psychrobactersp. G分離于南極喬治王島西南部海域中，該菌屬于適冷菌最明顯的特征是：菌株最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃,溫度高于30 ℃時(shí)菌株則停止生長(zhǎng)[23]。本研究從南極適冷菌Psychrobactersp. G中克隆得到了Csp2039基因。研究表明，冷激蛋白Csp2039與冷激蛋白CspA家族蛋白的同源性很高，存在與單鏈核苷酸結(jié)合相關(guān)的保守區(qū)RNP1和RNP2區(qū)[18]。本文針對(duì)極地微生物冷激基因能夠在低溫下正常表達(dá)產(chǎn)生冷激蛋白這一適應(yīng)機(jī)制展開(kāi)研究。

qRT-PCR和Western blot研究表明，溫度變化對(duì)Csp2039基因的表達(dá)有著較大的影響，其表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上均被低溫(0 ℃，10 ℃)誘導(dǎo)，這表明該基因?yàn)榈湫偷睦浼さ鞍谆?。?duì)基因Csp2039先前的研究中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上低溫(0 ℃)時(shí)于2，6，12 h 基因Csp2039的表達(dá)均被顯著誘導(dǎo)[18]，與本研究結(jié)果基本一致。低溫可誘導(dǎo)極地適冷菌冷激蛋白的表達(dá)以適應(yīng)外界溫度的變化[11,17]。已有研究發(fā)現(xiàn)，溫度從37 ℃下降到8 ℃時(shí)，大腸桿菌中CspA基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量顯著增加，在隨后的4 h內(nèi)表達(dá)量保持穩(wěn)定[16]。這些結(jié)果均表明CspA蛋白家族在微生物抵御低溫脅迫中起著重要的作用。

將從北極細(xì)菌PolaribacterirgensiiKOPRI 22228中克隆出的CspA基因經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白序列含有2個(gè)在CspA蛋白中高度保守的RNA結(jié)合位點(diǎn)RNP1和RNP2[24-25]；且將CspA基因?qū)氲蜏孛舾械拇竽c桿菌Csp四重缺失型菌株BX04后，使該菌株獲得了低溫存活的能力，表明該CspA基因在菌株KOPRI 22228的低溫適應(yīng)性中起著重要的作用[24]。Schmid等[13]在對(duì)ListeriamonocytogenesEGD-e 的溫度脅迫中發(fā)現(xiàn)，在37 ℃時(shí)，冷激蛋白基因CspA的表達(dá)量很低，在4 ℃時(shí)表達(dá)量明顯升高，是37 ℃時(shí)的23倍，這說(shuō)明低溫誘導(dǎo)明顯增強(qiáng)了冷激蛋白的表達(dá)。Jung等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CspAPa基因沒(méi)有導(dǎo)入大腸桿菌中時(shí)，對(duì)含有質(zhì)粒pAED4的大腸桿菌進(jìn)行1次凍融實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)僅有不足2%的細(xì)胞存活；而將從北極細(xì)菌PsychromonasarticaKOPRI 22215中克隆到的CspAPa基因?qū)氪竽c桿菌后，使宿主的耐寒能力增強(qiáng)了10倍以上，經(jīng)1次凍融后發(fā)現(xiàn)有多于20%的細(xì)胞存活，表明CspAPa蛋白能有助于北極細(xì)菌適應(yīng)極地的低溫環(huán)境。以上研究結(jié)果均表明溫度脅迫時(shí)，冷激蛋白的表達(dá)量在被低溫誘導(dǎo)后增加，這與本文研究結(jié)果是基本一致的，即冷激蛋白的表達(dá)是被低溫誘導(dǎo)的，冷激蛋白有助于南極細(xì)菌適應(yīng)極地的低溫環(huán)境。

鹽度脅迫對(duì)基因Csp2039在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)的影響并不完全一致。在轉(zhuǎn)錄水平上，低鹽(0)脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)先受誘導(dǎo)然后被抑制，在鹽度為15的脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)均被誘導(dǎo)，高鹽(90，120)時(shí)基因Csp2039的表達(dá)只在6 h被抑制；而在蛋白水平上，在低鹽(0，15)脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)均被誘導(dǎo)，高鹽(90)脅迫下，Csp2039蛋白的表達(dá)先被抑制，然后逐漸升高。這說(shuō)明冷激蛋白可能在菌株G對(duì)滲透壓變化的適應(yīng)性中可能起著重要作用。Schmid等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向培養(yǎng)基BHI中加入3%的NaCl后，菌株ListeriamonocytogenesEGD-e的CspA基因的表達(dá)會(huì)顯著升高，即高鹽會(huì)促進(jìn)CspA基因的表達(dá)，這與本文的研究結(jié)果基本相同。對(duì)基因Csp2039先前的研究中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上低鹽(0，15)脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)除在12 h(0)鹽度外均被抑制，高鹽(90，120)時(shí)基因Csp2039的表達(dá)量在12 h升高[18]，表明低鹽抑制了冷激蛋白的表達(dá)，與本研究在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)鹽度脅迫的應(yīng)答特征并不完全一致。這些結(jié)果表明冷激蛋白在細(xì)胞對(duì)鹽度脅迫性中的作用目前仍沒(méi)有定論，可能原因是冷激蛋白的分子伴侶可以提高鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量，加快了鈉離子的運(yùn)輸，它們可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和翻譯的進(jìn)行，來(lái)參與細(xì)胞對(duì)滲透壓的適應(yīng)[13]。

盡管CspA基因作為典型的冷激蛋白基因，受低溫誘導(dǎo)，但本研究研究表明，該基因的表達(dá)在30 ℃、6 h時(shí)也被顯著誘導(dǎo)，這與Ivancic等的研究結(jié)果相類似，其研究也表明，大腸桿菌CspA基因在8～37 ℃溫度波動(dòng)范圍內(nèi)也可以被誘導(dǎo)[16]。通過(guò)對(duì)基因Csp2039在鹽度條件下的表達(dá)特征的研究表明，在轉(zhuǎn)錄水平上，低鹽(0，15)對(duì)其表達(dá)量有顯著的影響，在鹽度為15的脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)均被誘導(dǎo)，高鹽(90，120)時(shí)基因Csp2039的表達(dá)只在6 h被抑制；然而在翻譯水平上，在低鹽(0，15)脅迫下，基因Csp2039的表達(dá)均被誘導(dǎo)，高鹽 (90) 脅迫下，Csp2039蛋白的表達(dá)先被抑制，然后逐漸升高，這其中的機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。在轉(zhuǎn)錄水平上，溫度和鹽度分別脅迫時(shí)，溫度對(duì)Csp2039基因的誘導(dǎo)表達(dá)明顯高于鹽度對(duì)基因的誘導(dǎo)增加倍數(shù)表達(dá)，在溫鹽協(xié)同脅迫時(shí)，低溫占據(jù)了主導(dǎo)作用；而在翻譯水平上，鹽度對(duì)Csp2039蛋白表達(dá)的影響作用明顯高于溫度，其中的機(jī)理也需進(jìn)一步的研究。

多種環(huán)境壓力在自然條件下同時(shí)脅迫南極細(xì)菌的生長(zhǎng)，常見(jiàn)的有海水的鹽度變化伴隨著溫度變化[26]，因此本文對(duì)Csp2039基因在溫度/鹽度協(xié)同脅迫下的表達(dá)情況也進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上，溫度為0 ℃時(shí)，無(wú)論鹽度高低，基因Csp2039在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)均顯著上升；而高溫(30 ℃)時(shí)，除在2 h低鹽被誘導(dǎo)以外，其余條件下均顯著被抑制，Csp2039基因在溫度/鹽度協(xié)同脅迫時(shí)的表達(dá)情況與溫度協(xié)迫時(shí)的表達(dá)情況相似，表明在轉(zhuǎn)錄水平上Csp2039基因表達(dá)的變化更容易受溫度影響。而在翻譯水平上，低溫(0℃)時(shí)，低鹽(15)時(shí)，Csp2039蛋白的表達(dá)均被誘導(dǎo)，高鹽(90)時(shí)，Csp2039蛋白的表達(dá)量明顯被抑制；而高溫(30 ℃)時(shí)，該基因在鹽度15時(shí)6 h的表達(dá)量最大，鹽度90時(shí)于6 h蛋白表達(dá)顯著抑制，表明在翻譯水平上鹽度對(duì)Csp2039蛋白表達(dá)的影響作用大于溫度，這其中的機(jī)理仍需更深入的研究。對(duì)基因Csp2039先前的研究中發(fā)現(xiàn)[18]，在轉(zhuǎn)錄水平上基因Csp2039的表達(dá)均被抑制，這可能與不同的實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，在以后的實(shí)驗(yàn)中對(duì)溫鹽協(xié)同作用進(jìn)行研究時(shí)可采用正交試驗(yàn)進(jìn)行互交性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將更具說(shuō)服力。

[1] PEARCE D A. Climate change and the microbiology of the Antarctic Peninsula region[J]. Science Progress，2008，91(2): 203-217.

[2] ZENG Y X，CHEN B. Process and application prospects in the study on Antarctic cold-adapted microorganisms[J]. Chinese Journal of Polar Research，1999，11(2): 143-152. 曾胤新， 陳波. 南極低溫微生物研究及其應(yīng)用前景[J]. 極地研究，1999，11(2): 143-152.

[3] HUSTON A L，KRIEGER-BROCKETT B B，DEMING J W. Remarkably low temperature optima for extracellular enzyme activity from Arctic bacteria and sea ice[J]. Environmental Microbiology，2000，2(4)：383-388.

[4] CHINTALAPATI S，KIRAN M D，SHIVAJI S，et al. Role of membrane lipid fatty acids in cold adaptation[J]. Cellular and Molecular Biology，2004，50(5): 631-642.

[5] LIN X Z，BIAN J，HUANG X H. The application of cold shock protein in the polar cold adaptation microorganisms[J]. Chemistry of Life，2004，24(5): 406-408. 林學(xué)政，邊際，黃曉航. 冷激蛋白在極地微生物冷適應(yīng)中的應(yīng)用[J]. 生命的化學(xué)，2004，24(5): 406-408.

[6] BUDDE I，STEIL L，SCHARF C，et al. Adaptation ofBacillussubtilisto growth at low temperature: a combined transcriptomic and proteomic appraisal[J]. Microbiology，2006，152(3): 831-853.

[7] YAMANAKA K，F(xiàn)ANG L，INOUYE M. TheCspA family inEscherichiacoli: multiple gene duplication for stress adaptation[J]. Molecular Microbiology，1998，27: 247-255.

[8] XIN Y H，ZHOU Y G， DONG X Z. Biodiversity and cold adaptive mechanisms of psychrophiles[J]. Biodiversity Science，2013，21(4): 468-480. 辛玉華，周宇光，東秀珠. 低溫細(xì)菌與古菌的生物多樣性及其冷適應(yīng)機(jī)制[J]. 生物多樣性，2013，21(4): 468-480.

[9] PHADTARE S，ALSINA J，INOUYE M. Cold-shock response and cold-shock proteins[J]. Current Opinion in Microbiology， 1999， 2(2): 175-180.

[10] SCHINDLER T，GRAUMANN P L，PERL D，et al. The family of cold shock proteins ofBacillussubtills. Stability and dynamicsinvitroandinvivo[J]. Journal of Biological Chemistry，1999，274(6): 3407-3413.

[11] BERGER F，MORELLET N，MENU F，et al. Cold shock and cold acclimation proteins in the psychrotrophic bacteriumArthrobacterglobiformisSI55[J]. Journal of Bacteriology，1996，178: 2999-3007.

[12] PANICKER G，MOJIB N，NAKATSUJI T，et al. Occurrence and distribution ofcapBin Antarctic microorganisms and study of its structure and regulation in the Antarctic biodegradativePseudomonassp. 30/3[J]. Extremophiles，2010，14(2):171-183.

[13] SCHMID B，KLUMPP J，RAIMANN E，et al. Role of cold shock proteins in growth ofListeriamonocytogenesunder cold and osmotic stress conditions[J]. Applied and Environmental Microbiology，2009，75: 1621-1627.

[14] MOJIB N，ANDERSEN D T，BEJ A K. Structure and function of a cold shock domain fold protein， CspD，inJanthinobacteriumsp. Ant5-2 from East Antarctica[J]. FEMS Microbiology Letters，2011，319(2): 106-114.

[15] ETCHEGARAY J P，JONES P G，INOUYE M. Differential thermoregulation of two highly homologous cold-shock genes，CspA andCspB，ofEscherichiacoli[J]. Genes to Cells，1996，1:171-178.

[16] IVANCIC T，JAMNIK P, STOPAR D. Cold shock CspA and CspB protein production during periodic temperature cycling inEscherichiacoli[J]. BMC Research Notes，2013，6:248.

[17] KAWAMOTO J，KURIHARA T，KITAGAWA M，et al. Proteomic studies of an Antarctic cold-adapted bacterium，ShewanellalivingstonensisAc10，for global identification of cold inducible proteins[J]. Extremopiles，2007，11(6): 819-826.

[18] SONG W Z，LIN X Z，HUANG X H. Characterization and expression analysis of three old shock protein(Csp) genes under different stress conditions in the Antarctic bacteriumPsychrobactersp. G[J]. Polar Biology，2012，35:1515-1524.

[19] LIN X Z，CUI S S，XU G Y. Cloning and heterologous expression of two cold-active lipases from the Antarctic bacteriumPsychrobactersp. G[J]. Polar Research，2010，29: 421-429.

[20] CHE S，SONG W Z，LIN X Z. Response of heat-shock protein (HSP) genes to temperature and salinity stress in the Antarctic psychrotrophic bacteriumPsychrobactersp. G[J]. Current Microbiology， 2013，67(5): 601-608.

[21] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods，2001，25(4): 402-408.

[22] JENSEN E. The basics of western blotting[J]. The Anatomical Record，2012，295(3): 369-371.

[23] SONG W Z， CHE S，LIN X Z. Cloning and characteristic analysis of universal stress protein(USP) gene of Antarctic bacteriumPsychrobactersp. G in response to stress treatments[J]. Advances in Marine Science，2013，31(1)：145-152. 宋維志，車帥，林學(xué)政. 南極適冷菌Psychrobactersp. G普遍脅迫蛋白(USP)基因的克隆及其脅迫條件下的應(yīng)答特征分析[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展，2013，31(1)：145-152.

[24] UH J H，JUNG Y H，LEE Y K, et al. Rescue of a cold-sensitive mutant at low temperature by cold shock proteins fromPolaribacterirgensiiKOPRI22228[J]. Journal of Microbiology，2010，48(6): 798-802.

[25] JUNG Y H，YI J Y，JUNG H J，et al. Overexpression of cold shock protein A ofPsychromonasarcticaKOPRI 22215 confers cold-resistance[J]. Protein Journal，2010，29(2): 136-142.

[26] THOMAS D N，DIECKMANN G S. Antarctic Sea ice-a habitat for extremophiles[J]. Science，2002， 295(5555): 641-644.

Received: April 8, 2015

Expression Characteristics of Cold Shock Protein Gene Csp2039 of the Antarctic Psychrotrophic Bacterium Psychrobacter sp. G

LI Yang1,2, CHE Shuai1,2,WANG Zhen1,2, LIN Xue-zheng1,2

(1.TheFirstInstituteofOceanography，SOA， Qingdao 266061， China；2.KeyLabofMarineBioactiveSubstances，SOA， Qingdao 266061， China)

To clarify the adaption mechanism of microorganisms in the severe environment of Antarctica, a cold shock protein geneCsp2039 was cloned from the Antarctic psychrotrophic bacterium Psychrobacter sp. G. qRT-PCR and Western blot were used to investigate the expression characteristics ofCsp2039 under different temperature/salinity stresses at the level of both transcriptional and translational. At the transcriptional level, qRT-PCR showed that the expression ofCsp2039 gene was significantly affected by the temperature shift and remarkably enhanced at 6 h by low temperature (0 ℃, 10 ℃), and high temperature (30 ℃). Under low salinity (0) stress, the expression ofCsp2039 gene was first induced, and then was suppressed; at the salinity of 15, the gene expressions were all increased at different times (2, 6 and 12 h); At high salinity (90, 120), the expression was enhanced at 6 h. Under the combined temperature and salinity stress, the expression ofCsp2039 gene was significantly increased at low temperature (0 ℃) regardless of salinity; on the contrary, the expression ofCsp2039 gene was inhibited by high temperature (30 ℃) except at 2 h. In the translational pattern, Western blot indicated that the expression of Csp2039 protein was remarkably enhanced by low temperature (0℃, 10 ℃), and obviously inhibited by high temperature (30 ℃). Under the low salinity (0, 15) stress, the expression of Csp2039 protein was enhanced; at the high salinity (90, 120), the expression ofCsp2039 gene was gradually increased after being suppressed. Under the combined temperature and salinity stresses, at low temperature (0 ℃), the expression of Csp2039 protein was improved under the salinity of 15 while decreased under the salinity of 90; however, at the high temperature (30 ℃), it had a high expression at 6 h under the salinity of 15 while a low expression at 6 h under the salinity of 90. In summary, the expression ofCsp2039 gene was more likely to be affected by temperature at the transcriptional level; and while in the translational pattern, the influence of salinity onCsp2039 gene was greater than that of temperature; the response time at the translational level ofCsp2039 gene was later than that in the transcriptional level.

Psychrobacter; cold shock protein geneCsp2039; qRT-PCR; Western blot; expression analysis

2015-04-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目——南極適冷菌Psychrobactersp. G溫度與鹽度脅迫下基因表達(dá)譜分析及冷/熱激基因應(yīng)答機(jī)制研究(41176174);南北極環(huán)境綜合考察與評(píng)估專項(xiàng)——北極海域海洋生物和生態(tài)考察(CHINARE2015-03-05)

李 陽(yáng)(1990-)，女，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事極地微生物學(xué)方面研究. E-mail: liyang@fio.org.cn*

林學(xué)政(1971-)，男，山東棲霞人，研究員，博士，主要從事海洋極端環(huán)境微生物學(xué)方面研究. E-mail: linxz@fio.org.cn

(王佳實(shí) 編輯)

Q751

A

1671-6647(2016)01-0085-10

10.3969/j.issn.1671-6647.2016.01.008