海參蒸煮廢液多糖提取優(yōu)化研究*

衣 丹, 李 梅,張朝暉,耿元生, 姜玉寶

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061; 2. 江蘇大學(xué), 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3. 青島佳日隆海洋食品有限公司,山東 青島266700 )

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海參蒸煮廢液多糖提取優(yōu)化研究*

衣 丹1, 李 梅2,張朝暉1,耿元生3, 姜玉寶3

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061; 2. 江蘇大學(xué), 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3. 青島佳日隆海洋食品有限公司,山東 青島266700 )

從海參蒸煮廢液有效利用出發(fā)，采用胃蛋白酶提取廢液中海參多糖。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇酶解pH、酶解溫度、酶用量為自變量，酶解后多糖質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析法，研究各自變量交互作用對(duì)多糖提取的影響。確定最佳提取工藝條件為：酶解pH=1.50、酶解溫度47.00 ℃、酶用量2.00%，在此條件下提取海參多糖質(zhì)量濃度為2.31 g/L。經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇沉淀后回收海參多糖，總回收率為39.5%。

海參；蒸煮廢液；酶解；多糖；響應(yīng)面分析

海參屬于棘皮動(dòng)物門海參綱，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，近年來海參產(chǎn)量大大增加，隨之而來的是海參加工業(yè)的繁盛。在海參加工蒸煮步驟中會(huì)產(chǎn)生大量的廢液，而此廢液中存在可觀的多糖等營養(yǎng)成分。海參多糖是海參重要的活性成分之一，具有抗凝血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種活性[1-3]。目前鮮有從海參蒸煮廢液回收多糖詳細(xì)工藝的研究。本實(shí)驗(yàn)選取胃蛋白酶進(jìn)行酶解，通過單因素實(shí)驗(yàn)，并采用響應(yīng)面分析方法以多糖質(zhì)量濃度為響應(yīng)優(yōu)化值分析得到酶解工藝最優(yōu)條件，為蒸煮廢液海參多糖的提取、純化及其他相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。與從海參中尋找生物活性物質(zhì)，以及加工功能性食品和開發(fā)新藥相比，建立海參蒸煮廢液活性物質(zhì)回收方法是經(jīng)濟(jì)有效的。山東省是我國海參的主要生產(chǎn)區(qū)，從蒸煮廢液回收多糖對(duì)提高海參加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益、減少污染物排放具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

青島佳日隆海洋食品有限公司提供海參蒸煮廢液。Amresco 0685胃蛋白酶(1∶3 000)，0458胰蛋白酶(1∶250)。Sigma木瓜蛋白酶,D-葡萄糖，巖藻聚糖硫酸酯，D-葡萄糖醛酸，D-氨基葡萄糖。苯酚，考馬斯亮藍(lán)G-250，次甲基藍(lán)，咔唑，鹽酸，硫酸，硝酸，氫氧化鈉溶液，活性炭，過氧化氫，明膠，氯化鋇，硫酸鉀等均為分析純。

實(shí)驗(yàn)儀器包括：GSY-Ⅱ型不銹鋼電熱恒溫水浴鍋，北京醫(yī)療設(shè)備廠；HS1002型電子天平，余姚華勝天平有限公司；HJ-2A型雙頭磁力加熱攪拌器，常州國華電器有限公司；V-5000 型分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；PSH-25型酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GR22GⅡ型離心機(jī)，日立工機(jī)株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最適蛋白酶篩選和多糖提取實(shí)驗(yàn)流程

取適量過濾后海參蒸煮廢液于燒杯中攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值，將燒杯置于磁力加熱攪拌器上，調(diào)節(jié)到適合的溫度后，將稱取好的蛋白酶倒進(jìn)蒸煮廢液之中，酶解一段時(shí)間后終止反應(yīng)，靜置、過濾得多糖濾液(最適蛋白酶篩選步驟相同)。濾液加入體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇并充分搖勻，4 ℃靜置過夜后離心得海參多糖。

1.2.2 多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)

考察酶用量(0.80%，1.00%，1.20%，1.50%，1.80%，2.00%，2.50%)，酶解pH值(0.70，0.80，1.20，1.50，1.80，2.00)，酶解溫度(35.00，37.50，40.00，42.50，45.00，47.50，50.00，52.50，57.50，65.00 ℃)，酶解時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7，8 h)四個(gè)因素對(duì)海參多糖提取的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝[4-5]

依據(jù)多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和Design-Ewpert 8.0.5軟件，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，多糖質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，各條件的影響因子通過回歸分析確定，作圖分析后優(yōu)化最佳提取條件。

1.2.4 多糖質(zhì)量濃度測(cè)定及多糖得率的計(jì)算

多糖質(zhì)量濃度采用苯酚硫酸法測(cè)定[6]；巖藻聚糖質(zhì)量濃度采用次甲基藍(lán)比色法測(cè)定[7]；硫酸基質(zhì)量濃度采用明膠BaC12法測(cè)定[8]；糖醛酸采用9-氮雜芴比色法(咔唑比色法)測(cè)定[9]；氨基糖質(zhì)量濃度采用Elson-Morgan 法測(cè)定[10]。

多糖得率的計(jì)算公式如下：

多糖得率(%)=多糖回收量/(多糖質(zhì)量濃度×溶液體積)×100%,

(1)

式中，多糖回收量單位為g;多糖質(zhì)量濃度單位為g/mL;溶液體積單位為mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對(duì)海參多糖提取的影響

取相同量的海參蒸煮廢液，考察不同蛋白酶的酶解效果，進(jìn)行最適蛋白酶篩選，蛋白酶用量依據(jù)相關(guān)海參多糖提取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果由表1可見，海參蒸煮廢液經(jīng)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，以胃蛋白酶的酶解效果最佳，酶解后多糖質(zhì)量濃度達(dá)1.82 g/L。這與徐逯等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，所以選取胃蛋白酶進(jìn)行酶解條件優(yōu)化。

表1 蛋白酶種類對(duì)多糖提取的影響Table 1 Influence of different enzymatic proteases on polysaccharide yield

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶用量對(duì)海參多糖提取的影響

如圖1顯示， 隨著酶解時(shí)胃蛋白酶用量的增加，得到的多糖質(zhì)量濃度呈逐漸增加趨勢(shì)，而當(dāng)胃蛋白酶的用量超過1.8%時(shí)，多糖質(zhì)量濃度開始下降。這可能是因?yàn)榈孜锏臐舛冗_(dá)到飽和，再增加酶用量反而由于大分子之間的位阻等作用抑制了酶促反應(yīng)的進(jìn)行。所以選擇的最佳酶用量為1.80%。

圖1 酶用量對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響

2.2.2 pH值對(duì)海參多糖提取的影響

酶解時(shí)，pH值過低或過高都會(huì)影響胃蛋白酶的活性。在確定酶用量為1.8%條件下，考察在不同pH值對(duì)所得多糖質(zhì)量濃度的影響(圖2)。當(dāng)pH值在0.70～1.20變化時(shí)多糖的質(zhì)量濃度變化不大;pH值由1.20增至1.50時(shí)，多糖質(zhì)量濃度明顯增加;當(dāng)pH值達(dá)到1.50后，隨pH值的繼續(xù)增大，所得多糖質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)。當(dāng)超過最適pH值后胃蛋白酶的活性受到抑制，因此選擇pH值1.50為最佳的酶解pH。

圖2 pH值對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響

2.2.3 酶解溫度對(duì)海參多糖提取的影響

確定最佳酶用量、pH后，考察酶解溫度對(duì)所得多糖質(zhì)量濃度的影響，由圖3可見，在35.00～47.50 ℃酶解溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖質(zhì)量濃度逐漸上升，達(dá)到47.50 ℃后，升高酶解溫度，多糖的質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)。酶解溫度升高，酶催化速度加快，同時(shí)酶的穩(wěn)定性也遭到破壞，所以只有當(dāng)這兩種效應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)酶處于最佳催化狀態(tài)，即達(dá)到酶的最適酶解溫度。

圖3 酶解溫度對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)海參多糖提取的影響

隨著酶解的進(jìn)行，多糖質(zhì)量濃度隨時(shí)間的增加不斷增加。由圖4可知，酶解進(jìn)行到5 h之后多糖質(zhì)量濃度增加緩慢，6 h后趨于平穩(wěn)。在接下來的研究中采用最佳酶解時(shí)間6 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響

2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化工藝結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取酶解pH值(A)、酶解溫度(B)、酶用量(C)三因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)見表2。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，共設(shè)計(jì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，分為零點(diǎn)和析因點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)上，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面法分析因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Scheme and experimental results of response surface analysis

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果Table 4 Results of the significance test for the established regression coefficient model

采用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到海參多糖的提取與所選3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為

Y=2.27-0.070A-0.040B+0.033C-0.032AB+0.063AC-0.13BC-0.30A2-0.22B2-0.13C2，

(2)

式中，Y為海參多糖質(zhì)量濃度(g/L)；A為pH值；B為酶解溫度；C為酶用量。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析結(jié)果見表4，P=0.000 2<0.01表明模型高度顯著，模型的決定系數(shù)R2=0.985 1，表明該模型能解釋98.51%的實(shí)驗(yàn)，因此該模型擬合程度良好，可用此模型對(duì)多糖提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。表4中各因素對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響不同，其中酶解pH 值的影響最大，P值接近0.018 4<0.05，說明pH值對(duì)此次實(shí)驗(yàn)酶解所得海參多糖質(zhì)量濃度有較為顯著的影響。通過比較回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小判斷因子影響的主次為pH影響最大，其次是酶解溫度，酶用量影響最小。

根據(jù)回歸分析結(jié)果，作響應(yīng)面曲面圖，如圖5～圖7所示，可以直觀地看出交互作用對(duì)多糖提取的影響。

圖5 pH值和酶解溫度對(duì)多糖提取的影響

圖6 酶解pH值和酶用量對(duì)多糖提取的影響

圖7 酶解溫度和酶用量對(duì)多糖提取的影響

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型利用Design-Expert 8.0.5軟件分析得出海參多糖最優(yōu)提取條件為：酶解pH=1.47，酶解溫度46.82 ℃，酶用量1.94%。在此條件下，海參多糖質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值為2.28 g/L。 考慮到實(shí)際操作的便利， 將提取工藝參數(shù)稍作調(diào)整為：酶解pH=1.50，酶解溫度47.00 ℃，酶用量2.00%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，提取的海參多糖質(zhì)量濃度為2.31 g/L,與模型理論最大值2.28 g/L非常接近，說明模型可以較好地反映出海參多糖提取的條件，從而也說明了用響應(yīng)面法對(duì)海參多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Design-Expert 8.0.5軟件分析得出海參多糖最優(yōu)提取條件為：酶解pH=1.47，酶解溫度46.82 ℃，酶用量1.94%。在此條件下，海參多糖質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值為2.28 g/L。 考慮到實(shí)際操作的便利， 將提取工藝參數(shù)稍作調(diào)整為：酶解pH=1.50，酶解溫度47.00 ℃，酶用量2.00%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，提取的海參多糖濃度為2.31 g/L,與模型理論最大值2.28 g/L非常接近，說明模型可以較好的反映出海參多糖提取的條件，從而也說明了用響應(yīng)面法對(duì)海參多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

2.4 醇沉法回收海參多糖

選用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇過濾醇析多糖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%～50%變化時(shí)，多糖得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加上升明顯，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%之后，多糖得率趨向穩(wěn)定，最終選體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇進(jìn)行醇沉回收，海參多糖得率為39.5%。

圖8 醇沉體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響

2.5 純化提取后海參多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其組分分析

采用苯酚硫酸法測(cè)得沉淀回收后的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72.33%。其中硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為20.06%，糖醛酸為10.67%，巖藻糖為9.03%，氨基糖為4.68%。

3 討 論

蒸煮是海參加工的重要環(huán)節(jié)之一，蒸煮廢液中含有與海參相同的多糖成分，大量的海參加工蒸煮廢棄液排放，會(huì)給環(huán)境帶來一定的危害也會(huì)造成資源的浪費(fèi)。蛋白是影響海參多糖純度的主要雜質(zhì)[12]，因此在海參多糖提取時(shí)，需要采取堿法或酶法進(jìn)行處理去除蛋白[13-16]。堿溶液提取多糖時(shí)能破壞糖肽鍵但也會(huì)一定程度地降解糖鏈，相比之下酶法則能在不改變多糖鏈結(jié)構(gòu)的前提下降解蛋白，對(duì)多糖的提取十分有效。海參蒸煮廢液經(jīng)過胃蛋白酶水解后里面含有色素、蛋白、多肽等雜質(zhì)，去除雜質(zhì)分離多糖的方法有沉淀法、離子交換層析和凝膠層析[12]等，最常用的是沉淀法。本研究采用乙醇作為沉淀劑，向多糖溶液中加入乙醇達(dá)到一定濃度，多糖的水化膜遭到破壞而以鹽的形式聚集沉淀，實(shí)現(xiàn)多糖的分離[17]，且乙醇毒性低，后期回收可反復(fù)利用，有利于降低提取成本。

海參多糖中含有豐富的巖藻聚糖，還含有硫酸基、糖醛酸及氨基糖等多糖組分。硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)是決定硫酸多糖活性極為重要的指標(biāo)，硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定是研究硫酸多糖構(gòu)效關(guān)系的一個(gè)重要方面[18]。研究中蒸煮廢液經(jīng)過酶解處理后，氨基糖、糖醛酸、巖藻糖和硫酸基占總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.68%，9.03%，10.67%，20.06%，其中硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)20.06%，與目前已有的海參多糖硫酸基研究結(jié)果相似[17]，說明海參蒸煮后廢液中營養(yǎng)物質(zhì)與海參個(gè)體中營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相近，建立經(jīng)濟(jì)有效的海參蒸煮廢液多糖回收具有現(xiàn)實(shí)意義。

研究中采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化海參蒸煮廢液提取海參多糖工藝，采用胃蛋白酶進(jìn)行酶解，以酶解pH值、酶解溫度、酶用量為主要因素進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，建立了預(yù)測(cè)回歸方程：Y=2.27-0.070A-0.040B+0.033C-0.032AB+0.063AC-0.13BC-0.30A2-0.22B2-0.13C2，式中，Y為海參多糖的質(zhì)量濃度(g/L);A為pH值；B為酶解溫度；C為酶用量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酶解時(shí)pH值對(duì)多糖質(zhì)量濃度影響顯著，當(dāng)酶解pH=1.50、酶解溫度47.00 ℃、酶用量2.00%、酶解時(shí)間6 h時(shí)，所得糖質(zhì)量濃度為2.31 g/L，采用乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%醇沉法回收多糖，總回收率為39.5%。

本研究對(duì)海參多糖的提取工藝較為簡(jiǎn)便，歷時(shí)短，具有很強(qiáng)的操作性，可為建立經(jīng)濟(jì)有效的海參蒸煮廢液多糖回收工藝提供理論指導(dǎo)。

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Received: June 23, 2015

Optimization of Polysaccharide Extraction From Cooking Progress Waste Liquid of Sea Cucumber

YI Dan1, LI Mei2, ZHANG Zhao-hui1,GENG Yuan-sheng3,JIANG Yu-bao3

(1.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061; 2.JiangsuUniversity, Zhenjiang 212013;3.QingdaoJiarilongOceanFoodCo.,LTD, Qingdao 266700)

In order to multiply utilize the sea cucumber cooking process waste liquid, the enzymatic hydrolysis was adopted to recover the polysaccharide from the sea cucumber cooking process waste liquid with pepsin. On the basis of single-factor test, the pH, hydrolysis temperature and dosage of pepsin were selected as independent variable and polysaccharide yield as response value to study the effect of interactions of independent variable on polysaccharide extraction ) through Box-Benhnken center composite design and response surface methodology. The results indicated that the optimal extraction conditions were pH=1.5, hydrolysis temperature 47 ℃, dosage of pepsin 2.0%. Under these conditions, the polysaccharide yield was 2.31 g/L. The recovery rate was 39.5% after precipitated by 50% alcohol.

sea cucumber; cooking process waste liquid; enzymatic hydrolysis; polysaccharide; response surface analysis

2015-06-23

青島市科技開發(fā)項(xiàng)目——海參加工副產(chǎn)物提取純化及應(yīng)用研究(A201203)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目——菌群復(fù)配共發(fā)酵降解綠潮藻產(chǎn)生物丁醇研究(2012G14)

衣 丹(1974-)，女，山東棲霞人，副研究員，博士，主要從事海洋生物與開發(fā)方面研究.E-mail:yidan@fio.org.cn

(王佳實(shí) 編輯)

TQ95

A

1671-6647(2016)01-0106-08

10.3969/j.issn.1671-6647.2016.01.010