雙環(huán)醇對大鼠口服他克莫司和阿托伐他汀后血漿藥代動力學(xué)的影響

王燕 扈金萍

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雙環(huán)醇對大鼠口服他克莫司和阿托伐他汀后血漿藥代動力學(xué)的影響

王燕 扈金萍

目的 研究雙環(huán)醇對大鼠口服他克莫司和阿托伐他汀后血漿藥代動力學(xué)的影響，為雙環(huán)醇與其他臨床藥物合理應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法 SD大鼠分為空白對照組和雙環(huán)醇組，分別口服給予0.5%羧甲基纖維素(CMC)和雙環(huán)醇200 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥7 d。實驗第8天兩組動物分別口服給予他克莫司(2 mg/kg)和阿托伐他汀(10 mg/kg)。應(yīng)用LC/MS/MS分析方法測定各組動物給藥后不同時間點(diǎn)的血藥濃度。采用WinNonLin軟件進(jìn)行非房室模型分析，計算血漿藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 空白對照組和雙環(huán)醇給藥組大鼠(200 mg·kg-1·d-1，7 d)口服他克莫司及阿托伐他汀后的血漿血藥峰濃度(Cmax)及藥時曲線下面積(AUC)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 雙環(huán)醇多次給藥后對合用藥物他克莫司和阿托伐他汀在大鼠體內(nèi)血漿藥代動力學(xué)無明顯影響。

雙環(huán)醇；他克莫司；阿托伐他??；藥代動力學(xué)；相互作用

聯(lián)合用藥是目前臨床協(xié)同治療或降低毒副作用的重要手段，但合用藥物間代謝性相互作用可導(dǎo)致血液或靶器官中藥物濃度降低或升高，在一定程度上改變藥物的安全性和療效[1]。

他克莫司和阿托伐他汀是目前臨床最常用的腎移植術(shù)后免疫抑制劑和他汀類降脂藥物，但在長期臨床應(yīng)用中，可出現(xiàn)肝損傷等不良反應(yīng)[2]，因此在免疫治療和降脂過程中常使用保肝藥治療藥物引起的肝損傷。雙環(huán)醇片(Bicyclol，商品名：百賽諾)是我國首個上市的治療肝臟炎癥的1.1類化學(xué)新藥。以往研究結(jié)果表明，雙環(huán)醇可預(yù)防和治療腎移植術(shù)后抗排斥藥物以及降脂藥引起的肝損傷[3]。應(yīng)用雙環(huán)醇進(jìn)行抗炎保肝治療的同時是否會影響合用藥物的代謝，是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。本研究擬觀察雙環(huán)醇多次給藥后對上述兩種藥物在大鼠體內(nèi)血藥濃度的影響，旨在降低臨床用藥風(fēng)險，避免因藥物代謝性相互作用而引起的不良反應(yīng)，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

資料和方法

一、材料

(一)藥物和試劑 雙環(huán)醇由北京協(xié)和藥廠提供，純度>99%；他克莫司(普樂可復(fù)膠囊)由華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)中心惠贈；阿托伐他汀鈣(批號：100590-200802)購自中國食品藥品檢定研究院；環(huán)孢素A(CAS：59865-13-3)購自百靈威公司；辛伐他汀(CAS：79902-63-9)購自美侖生物技術(shù)有限公司。甲醇和乙腈為色譜純(Fisher，美國)，其他試劑均為分析純。超純水由Milli-Q 純水儀制備(Millipore，MA，美國)。

(二)實驗動物 雄性SD大鼠，體重180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物許可證編號： SCXK(京)2012-0001。

(三)實驗儀器 美國AB公司API 4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，包括ESI源、自動進(jìn)樣器、質(zhì)譜泵及Analysist 1.5.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；島津LC-30AD液相色譜儀。

二、方法

(一)動物給藥及處理 雙環(huán)醇、他克莫司、阿托伐他汀分別用0.5% 羧甲基纖維素(CMC)配制成濃度為20 mg/mL、0.2 mg/mL、1 mg/mL混懸液，用于口服給藥。將20只SD大鼠分成兩組，每組10只，分別為空白對照組和雙環(huán)醇給藥組。雙環(huán)醇給藥組口服雙環(huán)醇 200 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥7 d，空白對照組給予同體積0.5% CMC。實驗第8天空白對照組和雙環(huán)醇給藥組大鼠分別口服給予他克莫司(2 mg/kg)和阿托伐他汀(10 mg/kg)。大鼠口服他克莫司后0、2、5、10、15、30、45 min、1、2、3、4、6、8、12、24 h各時間點(diǎn)自大鼠眼眶靜脈叢取血約300 μL，肝素抗凝后離心分離血漿備用；大鼠口服阿托伐他汀后0、5、10、20、30、45 min、1 h，1.5 h、2 h、3 h、4 h，6 h，8 h，12 h各時間點(diǎn)自大鼠眼眶靜脈叢取血約300 μL，肝素抗凝離心后，分離血漿備用。

(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 ①他克莫司：取大鼠空白血漿樣品50 μL，加入不同濃度他克莫司(0.0015，0.0025，0.005，0.025，0.05，0.125，0.25，0.5，1，1.5 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品各10 μL，再加入10 μL內(nèi)標(biāo)環(huán)孢素A(1.25 μg/mL)，混勻后加入乙腈180 μL沉淀蛋白，高速離心14000×5 min兩次，取上清液5 μL進(jìn)行LC/MS分析。②阿托伐他汀：取大鼠空白血漿樣品50 μL，加入不同濃度阿托伐他汀鈣(0.001， 0.0025，0.005，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品各10 μL，再加入10 μL內(nèi)標(biāo)辛伐他汀(1.25 μg/mL)混勻后加入乙腈180 μL沉淀蛋白，高速離心14000×5 min兩次，取上清液5 μL進(jìn)行LC/MS分析。

(三)血漿樣本處理 取他克莫司組血漿樣品50 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)環(huán)孢素A(1.25 μg/mL)，再加190 μL乙腈沉淀蛋白；取阿托伐他汀組血漿樣品50 μL加入10 μL內(nèi)標(biāo)辛伐他汀(1.25 μg/mL)，再加190 μL乙腈沉淀蛋白，高速離心14000×5 min兩次，取上清液進(jìn)樣10 μL。

(四)LC-MS檢測條件 ①他克莫司：色譜柱：CAPCELL PAK(2.1 mm×100 mm, 5 μm)，柱溫：40 ℃，流動相：甲醇：水(10 mM NH4Ac)=95∶5，流速：0.2 mL/min，SRM檢測：m/z 826.0→616.0(他克莫司)，m/z 1202.8→425.4(環(huán)孢素A)。②阿托伐他?。荷V柱：Zorbax SB-C18(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)；柱溫：25 ℃，流動相：乙腈(0.1%甲酸)∶水(0.1%甲酸)=70∶30，流速：0.2 mL/min，SRM檢測：m/z 559.4→440.2(阿托伐他汀)，m/z 419.9→199.4(辛伐他汀)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線

如表1所示，血漿中各藥物的響應(yīng)值和濃度線性關(guān)系良好，未見明顯雜質(zhì)干擾。

表1 大鼠血漿他克莫司(Tac)和阿托伐他汀(Ato)標(biāo)準(zhǔn)曲線

二、雙環(huán)醇多次給藥大鼠口服他克莫司后的血藥濃度經(jīng)時間變化

大鼠多次口服雙環(huán)醇(200 mg·kg-1·d-1，7 d)后口服他克莫司(2 mg/kg)，空白對照組和雙環(huán)醇給藥組相比，兩者的血漿Cmax分別為97.72±91.32 ng/mL和60.82±26.95 ng/mL，AUC(0-∞)分別為190.32±128.8 h·ng/mL和148.4±64.93 h·ng/mL。雖然雙環(huán)醇給藥后的 Cmax降低37.8%，AUC(0-∞)降低22.0%，但與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組動物的血藥濃度-時間曲線比較見圖1，藥代動力學(xué)參數(shù)見表2。

圖1 空白對照組和雙環(huán)醇給藥組大鼠口服他克莫司(2 mg/kg)后的血漿藥時曲線(n=5例)

參數(shù)Tac-對照組Tac-雙環(huán)醇組t1/2(h)7.14±2.117.57±2.42Tmax(h)1±1.120.5±0.18Cmax(ng/mL)97.72±91.3260.82±26.95AUC(0-t)(h·ng/mL)182.73±127.41138±57.23AUC(0-∞)(h·ng/mL)190.32±128.8148.4±64.93Vz(L/kg)148.43±102.22165.64±77.12CLz(L/h-1·kg-1)13.36±5.6915.32±5.38MRT(0-t)(h)4.51±0.374.64±0.69MRT(0-∞)(h)6.04±1.316.73±2.12

二、雙環(huán)醇多次給藥大鼠口服阿托伐他汀后血藥經(jīng)時間變化

大鼠多次口服雙環(huán)醇(200 mg·kg-1·d-1，7 d)后口服阿托伐他汀(10 mg/kg)，空白對照組和雙環(huán)醇給藥組相比，兩者的Cmax分別為302±157.43 ng/mL和256±111.27 ng/mL，AUC(0-∞)分別為341.63±174.35 h·ng/mL和311.03±38.68 h·ng/mL。雖然雙環(huán)醇給藥后的 Cmax降低15.2%，AUC(0-∞)降低8.96%，但兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組動物的血藥濃度-時間曲線比較見圖2，藥代動力學(xué)參數(shù)見表3。

圖2 空白對照組和雙環(huán)醇給藥組大鼠口服阿托伐他汀(10 mg/kg)后的血漿藥時曲線(n=5例)

參數(shù)Ato-對照組Ato-雙環(huán)醇組t1/2(h)1.54±0.132.14±0.24Tmax(h)0.32±0.250.17±0Cmax(ng/mL)302±157.43256±111.27AUC(0-t)(h·ng/mL)340.42±173.52305.33±38.83AUC(0-∞)(h·ng/mL)341.63±174.35311.03±38.68Vz(l/kg)78.10±33.77100.90±20.04Clz(l/h/kg)35.47±15.5932.57±4.18MRT(0-t)(h)1.46±0.312.15±0.39MRT(0-∞)(h)1.5±0.312.39±0.49

討 論

他克莫司是一種強(qiáng)效免疫抑制劑，作用強(qiáng)度約為CsA的10～100倍，且安全性較CsA好，已逐漸成為器官移植術(shù)后首選的免疫抑制劑。阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，通過競爭性抑制膽固醇合成限速酶HMG-CoA降低膽固醇和脂蛋白水平，是目前最常用的他汀類降脂藥。上述兩藥在長期臨床應(yīng)用中，可出現(xiàn)不同程度的肝損傷等不良反應(yīng)。因此在免疫治療和降脂過程常使用保肝藥進(jìn)行保肝治療。

雙環(huán)醇作為治療肝臟炎癥的1.1類化學(xué)新藥，可通過抑制肝損傷后炎性調(diào)控因子的表達(dá)和活性，抑制氧自由基和一氧化氮的生成，提高體內(nèi)抗氧化物如谷胱甘肽的水平，減輕炎癥和氧化及硝化損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡[4-5]，從而穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、改善線粒體功能及保護(hù)肝細(xì)胞核DNA的結(jié)構(gòu)和功能[6]，達(dá)到抗炎保肝的作用。目前雙環(huán)醇也越來越多的用于藥源性肝損傷的聯(lián)合治療，如雙環(huán)醇片可預(yù)防60歲以上腫瘤患者的化療藥物性肝損傷[7]，在常規(guī)保肝基礎(chǔ)上加用雙環(huán)醇可明顯減輕抗結(jié)核藥所致DILI的發(fā)生率及肝損傷程度[8]等。

臨床聯(lián)合用藥時，由于藥物間的代謝性相互作用可能引起藥物的血藥濃度改變，從而影響療效和毒性。既往體外實驗結(jié)果顯示[9]，雙環(huán)醇體外對二甲雙胍、非諾貝特、環(huán)孢素A和他克莫司在大鼠和人肝微粒體中的代謝無明顯影響，一定程度地反映了雙環(huán)醇與上述合用藥物的相互作用情況。雙環(huán)醇主要經(jīng)大鼠和人肝微粒體CYP3A代謝， 對CYP3A僅有微弱的誘導(dǎo)作用，不誘導(dǎo)其自身代謝。已知藥物代謝過程中，當(dāng)兩種或多種藥物經(jīng)同一代謝酶代謝時，藥物間則可能由于對藥酶的競爭而發(fā)生相互作用，致使血藥濃度發(fā)生改變。阿托伐他汀、他克莫司都是通過CYP3A4代謝[10]的臨床藥物，因此，本研究探討雙環(huán)醇對他克莫司、阿托伐他汀體內(nèi)血藥濃度的影響以及潛在的藥物相互作用具有顯著的臨床意義。

研究結(jié)果表明，雙環(huán)醇給藥組大鼠給予他克莫司(2 mg/kg)后，與空白對照組相比，他克莫司的Cmax降低37.8%，AUC(0-∞)降低22.0%，但兩組動物的Cmax和AUC(0-∞)差異均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義；雙環(huán)醇連續(xù)給藥7天后給予阿托伐他汀(10 mg/kg)，與空白對照組相比，阿托伐他汀的Cmax降低15.2%，AUC(0-∞)降低8.96%，但兩組動物的Cmax和AUC(0-∞)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示，雙環(huán)醇多次給藥未明顯影響他克莫司和阿托伐他汀在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，提示雙環(huán)醇與上述藥物合用時發(fā)生代謝性藥物相互作用的可能性較小。

綜上所述，大鼠多次口服雙環(huán)醇后對他克莫司和阿托伐他汀體內(nèi)血藥濃度無明顯影響，此結(jié)果可為臨床聯(lián)合用藥的有效性和安全性提供一定的參考依據(jù)。

[ 1 ] 黃宇星,劉二偉. 聯(lián)合用藥的藥物相互作用及研究方法.藥物評價與研究,2014,37:276-279.

[ 2 ] 孫雨平,史國兵,樊蓉,等.他克莫司致不良反應(yīng)67例文獻(xiàn)分析.醫(yī)藥導(dǎo)報,2014,33:1535-1537.

[ 3 ] 王艷飛,石紅娟,尹博英,等.雙環(huán)醇預(yù)防他汀類藥物肝損害的臨床療效觀察.實用心腦肺血管病雜志,2013, 21:132-133.

[ 4 ] Lou XE, Xu N, Yao HP, et al. Bicyclol attenuates pro-inflammatory cytokine and chemokine productions in CpG-DNA-stimulated L02 hepatocytes by inhibiting p65-NF-kappa B and p38-MAPK activation. Pharmazie,2010,65: 206-212.

[ 5 ] Yu YN, Chen H, Li Y. Effect of bicyclol on cisplatin-induced hepatotoxicity in the hepatocarcinoma 22 tumour-bearing mice. Basic Clin Pharmacol Toxicol,2009,104:300-305.

[ 6 ] Liu GT, Li Y, Wei HL, et al. Mechanism of protective action of bicyclol against CCl-induced liver injury in mice. Liver Int,2005,25: 872-879.

[ 7 ] Li X, Zhou J, Chen S, et al. Role of bicyclol in preventing chemotherapeutic agent-induced liver injury in patients over 60 years of age with cancer. J Int Med Res,2014,42:906-914.

[ 8 ] Chu NH, Li L, Zhang X, et al. Role of bicyclol in preventing drug-induced liver injury in tuberculosis patients with liver disease.Int J Tuberc Lung Dis,2015,19:475-480.

[ 9 ] 楊樹,趙曼曼,扈金萍,等.雙環(huán)醇對二甲雙胍、非諾貝特、環(huán)孢素A、他克莫司藥物體外代謝的影響.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2015,24:1500-1504.

[10] de Jonge H, de Loor H,Verbeke K, et al. Impact of CYP3A5 genotype on tacrolimus versus midazolam clearance in renal transplant recipients: new insights in CYP3A5-mediated drug metabolism. Pharmacogenomics,2013,14:1467-1480.

(本文編輯：易玲)

100050 北京 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及藥代/藥效研究北京市重點(diǎn)實驗室

扈金萍，Email：hujp@imm.ac.cn

2016-04-27)