磁固相萃取與納米金比色法聯(lián)合檢測(cè)蛋清中的溶菌酶

賈 麗， 馬向東， 姚 欣， 王 宇

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

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磁固相萃取與納米金比色法聯(lián)合檢測(cè)蛋清中的溶菌酶

賈 麗*， 馬向東， 姚 欣， 王 宇

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

基于檸檬酸根包覆的納米金(AuNPs)比色法對(duì)溶菌酶(LZ)進(jìn)行快速測(cè)定. 當(dāng)有LZ存在時(shí)，由于LZ與AuNPs的相互作用導(dǎo)致分散性良好的AuNPs發(fā)生聚集，從而使AuNPs溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色. AuNPs溶液在625 nm和525 nm的吸光度比率(A625/A525)與LZ濃度在10～100 nmol/L范圍內(nèi)有很好的線性相關(guān)關(guān)系，因此LZ的含量可以通過裸眼觀測(cè)AuNPs溶液的顏色變化或用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行快速測(cè)定，LZ的最低檢測(cè)限為10 nmol/L. 將所建立的AuNPs比色法與磁固相萃取技術(shù)相結(jié)合對(duì)蛋清中LZ的含量進(jìn)行了測(cè)定.

比色檢測(cè)； 納米金； 溶菌酶； 磁固相萃取

溶菌酶(LZ)作為一種堿性水解酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織和分泌物、蛋清以及牛奶中[1-3]. LZ除了具有水解活性，還表現(xiàn)出其它如抗菌、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等功能[4-6]. 據(jù)研究報(bào)道，LZ已經(jīng)應(yīng)用于傷口治療[7]、抑制腫瘤生長(zhǎng)[5]等方面. LZ作為抗菌劑和食品防腐劑，能夠有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)，因此也被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[4,8-9]. 由于LZ在食品工業(yè)和醫(yī)療行業(yè)具有非常廣泛的應(yīng)用，因此LZ檢測(cè)技術(shù)獲得了越來越多的關(guān)注.

目前，LZ檢測(cè)方法包括微生物學(xué)測(cè)定法[10]、液相色譜法[11-12]、免疫分析法[11,13]、毛細(xì)管電泳法[14]、毛細(xì)管電色譜法[15]和電化學(xué)方法[16]等. 盡管這些檢測(cè)方法能夠有效檢測(cè)LZ，但是，這些方法需要相應(yīng)的大型儀器設(shè)備或者比較麻煩的操作過程. 因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速又不需要大型儀器設(shè)備的LZ檢測(cè)方法非常必要.

通過觀察顏色的變化對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的比色法是一種理想的快速檢測(cè)方法. 近些年來，納米金(AuNPs)由于其與距離相關(guān)的光學(xué)特性而受到廣泛關(guān)注，當(dāng)溶液中AuNPs粒子之間的距離大于自身的平均粒徑時(shí)，溶液呈現(xiàn)紅色；當(dāng)粒子間距離接近或者小于自身平均粒徑時(shí)，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色[17]. AuNPs比色法就是通過待測(cè)物質(zhì)直接或者間接與AuNPs相互作用而發(fā)生顏色的改變來達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)物的方法，這種方法不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備. 此外，由于AuNPs具有較高的吸光系數(shù)，因此能夠檢測(cè)出較低含量的待測(cè)物. AuNPs比色法已經(jīng)被應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境污染物[18-19]、抗生素殘留[20]、三聚氰胺[21]、蛋白[22-23]等.

已有文獻(xiàn)報(bào)道AuNPs比色法被應(yīng)用于LZ的檢測(cè).HUANG等[24]報(bào)道了一種五肽(Cys-Ala-Leu-Asn-Asn)包覆的AuNPs作為比色探針，在LZ存在的條件下會(huì)發(fā)生聚集，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)LZ的目的；CHEN等[25]制備了人血紅白蛋白(HSA)修飾AuNPs，帶正電的LZ通過靜電作用誘導(dǎo)帶負(fù)電的HSA修飾的AuNPs發(fā)生聚集，從而達(dá)到檢測(cè)LZ的目的. 這兩種方法雖然能夠檢測(cè)LZ，但是制備修飾AuNPs的過程非常耗時(shí). SU等[26]報(bào)道了帶負(fù)電的適配體通過靜電作用誘導(dǎo)帶正電的AuNPs發(fā)生聚集，溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色，加入LZ之后，由于LZ與適配體結(jié)合，使得帶正電的AuNPs解聚，溶液恢復(fù)至紅色，基于該現(xiàn)象對(duì)LZ進(jìn)行檢測(cè). WANG等[27]報(bào)道了適配體能夠使AuNPs穩(wěn)定分散在高離子強(qiáng)度的鹽溶液中，但加入LZ之后，由于適配體與LZ的結(jié)合，使得AuNPs在高鹽溶液中發(fā)生聚集，溶液由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)LZ的目的，這兩種方法需要合成LZ的特異性適配體. 本文將檸檬酸根包覆的AuNPs作為比色探針對(duì)LZ進(jìn)行快速檢測(cè)，該方法不需要對(duì)AuNPs進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，同時(shí)，測(cè)定時(shí)無需加入其他的誘導(dǎo)劑.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

氯金酸(HAuCl44H2O)購于上海國藥；檸檬酸鈉(Na3C6H5O72H2O)購于廣東光華科技股份有限公司；硝酸(HNO3)購于洛陽化學(xué)試劑廠；十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)和二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O)購于廣州化學(xué)試劑廠；磷酸(H3PO4)購于天津大茂化學(xué)試劑廠；α-酪蛋白(α-Cas,Mw2.5×104,pI 4.2～4.7)、β-酪蛋白(β-cas,Mw2.4×104,pI 4.8～5.1)、κ-酪蛋白(κ-Cas,Mw1.9×104,pI 4.6～5.1)、α-乳白蛋白(α-Lac,Mw1.4×104,pI 4.4)、β-乳球蛋白(β-Lg,Mw1.8×104,pI 5.2)、細(xì)胞色素c(Cyc,Mw1.3×104,pI 10.2)、核糖核酸酶A(Rnase A,Mw1.37×104,pI 9.3)購于Sigma-Aldrich公司(Saint Louis, MO, USA)；LZ(Mw1.44×104,pI 11.1)、卵清蛋白(OVA,Mw4.43×104,pI 4.5)、伴清蛋白(Con A,Mw7.72×104,pI 6.0)購于廣州捷倍斯生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA,Mw6.7×104,pI 4.8)、牛血紅蛋白(BHb,Mw6.45×104,pI 6.8)購于上海伯奧生物科技有限公司. 雞蛋從超市購買. 實(shí)驗(yàn)用水來自英國Elga公司(ELGA, London, UK)超純水系統(tǒng).

1.2 主要儀器

微量分光光度計(jì)K5600(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)；透射電子顯微鏡(JEM-2100HR，日本JEOL公司)；粒徑分布測(cè)定儀(Zetasizer Nano ZS，英國Malvern公司).

1.3 AuNPs制備

AuNPs采用檸檬酸還原法制備[28]. 步驟：首先將100 mL HAuCl44H2O溶液(1 mmol/L)油浴加熱至沸騰，然后向其中加入5 mL Na3C6H5O7溶液(38.8 mmol/L)，溶液由無色轉(zhuǎn)變至酒紅色后，繼續(xù)加熱攪拌20 min，保持?jǐn)嚢枋谷芤豪鋮s至室溫，最后將制備好的AuNPs在4 ℃條件下保存待用.

1.4 比色法檢測(cè)LZ

1 mL AuNPs溶液在4 ℃離心(10 000 r/min)15 min去除無色的上清液，然后以1 mL磷酸緩沖液(PBS, 10 mmol/L，pH 10.0)進(jìn)行重懸. 依據(jù)HAISS等[29]報(bào)道的納米金濃度的測(cè)定方法，用紫外可見光譜法測(cè)得AuNPs的濃度為0.48 nmol/L. 100 nmol/L LZ的儲(chǔ)存液在20 mmol/L PBS溶液(pH 10.0)中制得. 將20 μL重懸的AuNPs溶液加入到80 μL LZ溶液中，在室溫條件下震蕩30 s，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度. 探究影響LZ檢測(cè)的條件，包括PBS溶液的濃度和pH，LZ同AuNPs孵育的時(shí)間以及AuNPs的量.

選擇α-Cas、β-Cas、κ-Cas、α-Lac、β-Lg、BSA、OVA、BHb、Con A、Rnase A、Cyc作為對(duì)比蛋白. 20 μL重懸的AuNPs溶液分別加入到80 μL的各種蛋白溶液中來研究AuNPs對(duì)LZ的選擇性，整個(gè)檢測(cè)過程如圖1所示.

圖1 AuNPs比色法檢測(cè)蛋白示意圖

Figure 1 Schematic illustration of colorimetric detection of proteins by AuNPs

1.5 雞蛋清的預(yù)處理

通過測(cè)定蛋清中的LZ含量來評(píng)價(jià)所建立的AuNPs比色法對(duì)真實(shí)樣品測(cè)定的可行性. 為了避免蛋清中其他組分的干擾，樣品用CHEN等[30]報(bào)道的方法進(jìn)行預(yù)處理. 步驟如下：首先用20 mmol/L PBS(pH 10.0)將雞蛋清進(jìn)行體積比1∶1的稀釋，并將稀釋的雞蛋清通過冰水浴攪拌6 h，之后在4 ℃離心(10 000 r/min)30 min，取上清液；其次用20 mmol/L PBS(pH 10.0)將上清液稀釋2倍，再向稀釋后含有LZ的上清液0.2 mL中加入0.4 mg的聚苯乙烯磺酸鈉修飾的磁粒(PSS-MNPs)進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)；然后用含有1.0 mol/L NaCl的PBS(20 mmol/L，pH 7.0)溶液將吸附到PSS-MNPs上的LZ洗脫下來，并用PBS(20 mmol/L，pH 10.0)溶液將洗脫下來的溶液稀釋1 000倍；最后，將20 μL重懸的AuNPs溶液加入到80 μL稀釋后的洗脫液中，孵育30 s之后進(jìn)行紫外可見檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs和AuNPs-LZ復(fù)合物的表征

AuNPs和AuNPs-LZ復(fù)合物用紫外可見吸收光譜、動(dòng)態(tài)光散射以及透射電子顯微鏡(TEM)分析進(jìn)行表征(圖2). 從TEM(圖2A)可以看出AuNPs是粒徑大約30 nm的球形顆粒；動(dòng)態(tài)光散射分析得到AuNPs的平均粒徑是30.4 nm，同TEM分析的結(jié)果吻合，由此表明AuNPs具有良好的分散性；由紫外可見吸收光譜圖(圖2B)可知，AuNPs的最大吸收峰在525nm，AuNPs-LZ復(fù)合物的最大吸收峰在625 nm，向長(zhǎng)波方向發(fā)生移動(dòng)，該結(jié)果表明LZ可誘導(dǎo)AuNPs發(fā)生聚集，聚集后的AuNPs的吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色(圖2C)，同TEM圖中AuNPs-LZ復(fù)合物的聚集狀態(tài)一致(圖2D). 動(dòng)態(tài)光散射分析聚集的AuNPs的平均尺寸為615.1 nm，進(jìn)一步表明LZ誘導(dǎo)了AuNPs的聚集.

圖2 AuNPs和AuNPs-LZ復(fù)合物的粒徑分布、TEM、紫外可見光譜及相片

Figure 2 Size distribution, TEM images, UV-vis spectra, corresponding photographs of well-dispersed AuNPs and AuNPs-LZ conjugates

2.2 LZ誘導(dǎo)AuNPs發(fā)生聚集的機(jī)制

將重懸的AuNPs(0.48 nmol/L，20 μL)溶液分別加入到不同濃度的LZ溶液(10～100 nmol/L，80 μL)中，其紫外可見圖譜及相對(duì)應(yīng)的照片如圖3所示，檢測(cè)溶液為20 mmol/L PBS(pH 10.0)，孵育時(shí)間為30 s，從c到h，LZ分別為0、10、30、50、70、100 nmol/L，LZ溶液體積為80 μL，AuNPs溶液體積為20 μL. 隨著LZ濃度的增加，AuNPs在525 nm處的吸收減小，在625 nm處增大，而且相對(duì)應(yīng)的照片表明溶液顏色由紅色逐漸變?yōu)樽仙?，最終變?yōu)樗{(lán)色. AuNPs表面有大量帶負(fù)電荷的檸檬酸根離子，會(huì)穩(wěn)定AuNPs防止其聚集[31]. LZ(pI 11.1)在pH 10.0 的PBS溶液中帶正電荷. 當(dāng)20 μL重懸的AuNPs溶液加入到80 μL LZ溶液中時(shí)，帶正電的LZ會(huì)通過靜電作用誘導(dǎo)帶負(fù)電的AuNPs發(fā)生聚集. 聚集的AuNPs的最大吸收峰將會(huì)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，因此溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色.

圖3 不同濃度LZ加入AuNPs溶液的紫外可見光譜及照片

Figure 3 UV-vis spectra and corresponding photographs of AuNPs solutions after addition of different concentrations of LZ

2.3 優(yōu)化比色法檢測(cè)LZ的實(shí)驗(yàn)條件

對(duì)AuNPs比色法檢測(cè)LZ的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行考察和優(yōu)化.

首先探討AuNPs與LZ孵育時(shí)間的影響(圖4)，檢測(cè)溶液為20 mmol/L PBS(pH 10.0)，LZ為100 nmol/L，LZ溶液體積為80 μL，AuNPs溶液體積為20 μL. 當(dāng)孵育時(shí)間為30 s時(shí)，A625/A525值達(dá)穩(wěn)定，進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間，A625/A525基本不變，由此表明LZ可通過靜電作用誘導(dǎo)AuNPs快速發(fā)生聚集，因此，孵育時(shí)間30 s作為隨后的實(shí)驗(yàn)條件.

圖4 孵育時(shí)間對(duì)AuNPs比色法檢測(cè)LZ的影響(n=3)

Figure 4 Effect of incubation time on the detection of LZ by AuNPs (n=3)

其次，探討檢測(cè)溶液的pH對(duì)比色法檢測(cè)LZ的影響(圖5)，檢測(cè)溶液為20 mmol/L PBS，孵育時(shí)間為30 s，LZ為100 nmol/L，LZ溶液體積為80 μL，AuNPs溶液體積為20 μL.A625/A525在溶液pH 4.0～10.0之間基本保持穩(wěn)定，當(dāng)溶液pH超過10.0時(shí)，A625/A525發(fā)生明顯下降. 這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明LZ通過靜電相互作用誘導(dǎo)AuNPs聚集，因?yàn)樵趐H 4.0～10.0之間AuNPs帶負(fù)電荷，而LZ帶正電荷. 為了提高AuNPs比色法對(duì)LZ檢測(cè)的選擇性，選擇pH 10.0作為檢測(cè)的條件，因?yàn)樵趐H 10.0的條件下，等電點(diǎn)小于10的蛋白會(huì)帶負(fù)電荷，因此可以消除這些蛋白對(duì)LZ的檢測(cè)干擾.

圖5 溶液pH對(duì)AuNPs比色法檢測(cè)LZ的影響(n=3)

然后，探討PBS(pH 10.0)溶液的濃度對(duì)比色法檢測(cè)LZ影響(圖6)，檢測(cè)溶液pH 10.0，孵育時(shí)間為30 s，AuNPs溶液體積為20 μL，PBS溶液(從i到m)分別為10、20、30、40和50 mmol/L.

圖6 PBS濃度對(duì)AuNPs比色檢測(cè)LZ的影響(n=3)

Figure 6 Effect of concentration of phosphate solution on the detection of LZ by AuNPs (n=3)

當(dāng)PBS低于20 mmol/L時(shí)，A625/A525沒有明顯的變化，但超過20 mmol/L時(shí)，A625/A525明顯增加，表明AuNPs會(huì)逐漸發(fā)生聚集，溶液由紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度的磷酸根離子會(huì)誘導(dǎo)AuNPs聚集. 因此，選擇20 mmol/L PBS(pH 10.0)作為檢測(cè)溶液.

最后，探討AuNPs的體積對(duì)比色法檢測(cè)LZ的影響(圖7)，檢測(cè)溶液為20 mmol/L PBS(pH 10.0)，孵育時(shí)間為30 s，總體積為100 μL，LZ為80 nmol/L. 在保證總體積100 μL、LZ為80 nmol/L的條件下，通過加入不同體積的AuNPs(0.48 nmol/L)來調(diào)節(jié)AuNPs的量. 當(dāng)AuNPs的體積超過20 μL時(shí)，A625/A525的比值達(dá)到穩(wěn)定. 因此，選擇20 μL AuNPs(0.48 nmol/L)作為AuNPs的加入量.

圖7 AuNPs的量對(duì)檢測(cè)LZ的影響(n=3)

2.4 AuNPs比色法對(duì)LZ檢測(cè)的選擇性

α-Cas、β-Cas、κ-Cas、α-Lac、β-Lg、BSA、OVA、BHb、Con A、Rnase A、Cyc作為對(duì)比蛋白來研究AuNPs對(duì)LZ檢測(cè)的選擇性(圖8)，檢測(cè)溶液為20 mmol/L PBS(pH 10.0)，孵育時(shí)間為30 s，各蛋白濃度為100 nmol/L，各蛋白溶液體積為80 μL；AuNPs溶液體積為20 μL，蛋白種類(1～13)包括空白、LZ、α-Cas、β-Cas、κ-Cas、α-Lac、β-Lg、BSA、OVA、BHb、Con A、Rnase A、Cyc等.

當(dāng)將AuNPs溶液(20 μL)加入到LZ溶液(100 nmol/L，80 μL)中時(shí)，AuNPs迅速發(fā)生聚集，顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，當(dāng)將AuNPs溶液加入到其他蛋白溶液時(shí)，AuNPs并沒有發(fā)生聚集，因此溶液顏色沒有發(fā)生變化，只有LZ導(dǎo)致A625/A525比值明顯增加，該結(jié)果表明AuNPs在堿性條件下(20 mmol/L PBS，pH 10.0)對(duì)LZ表現(xiàn)出一定的選擇性. 在pH 10.0的條件下，高等電點(diǎn)的LZ攜帶正電荷，Cyc基本不帶電荷，而其它低等電點(diǎn)的蛋白攜帶負(fù)電荷，AuNPs在該條件下攜帶負(fù)電荷，因此，依據(jù)靜電相互作用的機(jī)理，LZ會(huì)誘導(dǎo)檸檬酸根離子包覆的AuNPs發(fā)生聚集.

圖8 12種蛋白加入到AuNPs溶液后的吸光度比率及相應(yīng)照片(n=3)

Figure 8 Absorption ratios of AuNPs solutions after addition of 12 kinds of proteins and corresponding photographs (n=3)

2.5 LZ檢測(cè)的靈敏度

隨著LZ由10 nmol/L增加到100 nmol/L，AuNPs在625 nm處的吸光度逐漸增大(圖3)，在525 nm處吸光度明顯下降. 繪制吸光度比值(A625/A525)與LZ物質(zhì)的量濃度(c)的線性相關(guān)圖，得到線性方程A625/A525=0.009 0c+ 0.14 (R=0.994 5)，LZ的最低檢測(cè)限為10 nmol/L.

2.6 真實(shí)樣品檢測(cè)

將所建立的方法對(duì)雞蛋清中的LZ進(jìn)行了檢測(cè)(圖9)，檢測(cè)溶液為20 mmol/L PBS(pH 10.0)，孵育30 s，經(jīng)稀釋的蛋清提取液體積為80 μL，AuNPs溶液體積為20 μL.

由于AuNPs比色法對(duì)樣品基體的離子強(qiáng)度和pH非常敏感，因此，首先用PSS-MNPs作為吸附劑的磁固相萃取方法[30]對(duì)雞蛋清進(jìn)行了前處理，然后用所建立的AuNPs比色法對(duì)蛋清中的LZ進(jìn)行檢測(cè). 當(dāng)將AuNPs溶液(0.48 nmol/L，20L)加入處理后的蛋清溶液后，AuNPs溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色. 蛋清中LZ的濃度通過測(cè)定為0.21 mmol/L(即3.02 g/L)，所測(cè)得結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的蛋清中的LZ濃度基本一致[14].

圖9 AuNPs比色法檢測(cè)蛋清提取物紫外可見吸收光譜、照片

3 結(jié)論

采用30 nm AuNPs通過比色法對(duì)LZ進(jìn)行了快速檢測(cè). 帶正電的LZ能夠在堿性條件下(20 mmol/L PBS，pH 10.0)通過靜電作用誘導(dǎo)帶負(fù)電的AuNPs發(fā)生聚集，使其顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色. 在pH 10.0條件下，AuNPs對(duì)LZ表現(xiàn)出良好的選擇性. 通過與已報(bào)道[24-27]的AuNPs比色法檢測(cè)LZ進(jìn)行比較，如表1所示，該方法更加簡(jiǎn)單快速，無需對(duì)AuNPs進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，而且不需要加入其它的誘導(dǎo)劑. 該方法與磁固相萃取方法相結(jié)合成功用于檢測(cè)蛋清中的LZ.

表1 不同AuNPs比色法檢測(cè)LZ的對(duì)比

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【中文責(zé)編：成文 英文責(zé)編：李海航】

Colorimetric Detection of Lysozyme in Egg White Using Gold Nanoparticles in Combination with Magnetic Solid Phase Extraction

JIA Li*, MA Xiangdong, YAO Xin, WANG Yu

(Ministry of Education Key Laboratory of Laser Life Science & Institute of Laser Life Science,College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

A simple colorimetric method for rapid lysozyme (LZ) detection using citrate-capped gold nanoparticles without any further surface modification was developed in this work. The well-dispersed gold nanoparticles in aqueous solution were induced to aggregate in the presence of LZ, which led to a visible color change from red to blue. The concentration of LZ can be determined by monitoring with bare eye or a UV-vis spectrometer. The linearity was observed between the absorbance ratio (A625/A525) and the LZ concentration in the range of 10 to 100 nmol/L. The lowest detectable concentration of LZ was 10 nmol/L. The feasibility of the developed method was evaluated by determination of LZ in egg white in combination with magnetic solid phase extraction.

colorimetric detection; gold nanoparticles; lysozyme; magnetic solid phase extraction

2016-05-20 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21175048)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030311013)

O648

A

1000-5463(2016)06-0092-07

*通訊作者:賈麗，教授，Email: jiali@scnu.edu.cn.