碳源和鹽度對好氧反硝化細菌脫氮特性的影響

廖紹安， 黃捷暢， 王安利*， 高方舟， 相晨曦， 羅年滔， 李永鋒， 藍宗堅

(1. 華南師范大學生命科學學院， 廣州 510631； 2. 廣東水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室， 廣州 510631；3. 廣東普通高校生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室， 廣州 510631； 4. 清遠市水產(chǎn)研究所， 清遠 511500)

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碳源和鹽度對好氧反硝化細菌脫氮特性的影響

廖紹安1,2,3， 黃捷暢1,2,3， 王安利1,2,3*， 高方舟1,2,3， 相晨曦1,2,3， 羅年滔4， 李永鋒4， 藍宗堅4

(1. 華南師范大學生命科學學院， 廣州 510631； 2. 廣東水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室， 廣州 510631；3. 廣東普通高校生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室， 廣州 510631； 4. 清遠市水產(chǎn)研究所， 清遠 511500)

采用16S rDNA序列分析對菌株LZX301進行了初步鑒定，在150 r/m搖瓶好氧培養(yǎng)，探討了碳源及鹽度對菌株好氧反硝化特性的影響. 結(jié)果表明，該菌株16S rDNA序列與PseudomonasstutzeriATTC 17594(AY905607.1)等3株施氏假單胞菌序列相似度為99%，系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示菌株LZX301與P.stutzeri的關(guān)系比同屬的P.aeruginosa和P.putida更近，因此初步確定菌株LZX301為P.stutzeri. 培養(yǎng)液初始含7 mg/L亞硝酸鹽和28 mg/L硝酸鹽、C/N比為10∶1條件下，以葡萄糖、乙酸鈉和蔗糖為碳源時無機氮去除率分別為79.1%、67.9%和38.8%，氨氮積累量分別為1.978、1.224、0.727 mg/L. 以葡萄糖為唯一碳源時，在5‰、15‰、25‰等3個鹽度下無機氮總?cè)コ史謩e為73.2%、85.8%和78.7%，其中硝酸鹽去除率分別為89.8%、86.1%和76.5%，亞硝酸鹽去除率分別為36.2%、94.7%和96.4%，氨氮質(zhì)量濃度分別為2.117、0.691、0.595 mg/L. 研究結(jié)果表明菌株LZX301在鹽度5‰～25‰ 范圍內(nèi)具有較強的好氧反硝化能力，以葡萄糖為碳源脫氮效果最好，對該菌株的應(yīng)用具有指導意義.

好氧反硝化； 脫氮； 碳源； 鹽度； 假單胞菌

日益嚴重的氮污染是最重要的環(huán)境問題之一，反硝化作為主要的脫氮途徑長期以來被深入研究.傳統(tǒng)上認為在厭氧或缺氧條件下反硝化才會發(fā)生，ROBERTSON等[1]首次發(fā)現(xiàn)具有好氧反硝化能力的Thiosphaerapantotropha改變了這一認識. 好氧反硝化菌在溶解氧較高水平下也具有較高的反硝化活性，可以實現(xiàn)硝化過程和好氧反硝化菌代謝在時空上有效耦合，為提高脫氮效率提供新思路和新工藝，因此,好氧反硝化菌的研究得到了較高重視. 目前已從不同環(huán)境中分離獲得了多種好氧反硝化菌，主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)和微小菌屬(Microvirgula)[2-3]. 碳源在細菌生長、呼吸作用和反硝化代謝中提供電子供體必不可少，其種類和碳氮比(C/N比)對脫氮有極為重要的影響；另外，鹽度也是影響反硝化效率的重要因素[4-5].

本研究對源于對蝦養(yǎng)殖池中的一株好氧反硝化菌LZX301的16S rDNA進行了同源性分析，并研究了碳源和鹽度對其脫氮性能的影響，為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中氮污染控制提供必要的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

實驗菌株來源于對蝦淡化養(yǎng)殖池生物膜，為本實驗室保存菌株，編號為LZX301，具有較強的好氧反硝化能力.

1.2 菌株活化培養(yǎng)

基本培養(yǎng)基：醋酸鈉(1.64 g)，葡萄糖(5.4 g)，NH4Cl(1.07 g)，NaNO3(0.85 g)，K2HPO4(1.4 g)，KH2PO4(2.7 g)，pH 7.6，人工海水(鹽度10‰)1 000 mL，115 ℃滅菌30 min.

取超低溫冰箱保存的菌株LZX301在LB瓊脂平板培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后，挑取菌落接種到基本培養(yǎng)基中液體純培養(yǎng)24 h.

1.3 菌株16S rDNA序列分析

用1.5 mL小離心管收集24 h培養(yǎng)的菌液，12 000 r/m離心2 min，棄上清液，收集菌體. 使用TAKARA細菌基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA，操作按照說明書進行. 電泳檢測提取的基因組DNA.

所采用的細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[6]由上海生工生物工程有限公司合成，對16S rDNA進行PCR擴增. 擴增體系：2× Premix Taq (Ex TaqTMVersion，TaKaRa公司) 25 μL，引物各0.5 μmol/L，模板1 μL，滅菌去離子水補至50 μL. 采用PE2400 PCR擴增儀，反應(yīng)程序為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存. PCR產(chǎn)物以含0.15 mg/L溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad Gel Doe 2000)記錄結(jié)果. 用Microcon-PCR Purification Kit(Millipore)純化擴增產(chǎn)物，由上海生工生物有限公司采用ABI 377 DNA測序儀完成測序. 測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫GenBank采用BLASTN程序進行同源性檢索. 在NCBI上搜索參考序列，利用軟件MEGA 6對菌株LZX301及參考序列進行遺傳關(guān)系分析，采用Neighbour-joint法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 搖瓶培養(yǎng)

不同碳源培養(yǎng)基制備. 培養(yǎng)基基本組分：NaNO30.17 g，NaNO20.035 g，K2HPO41.4 g，KH2PO42.7 g，pH 7.6，人工海水(鹽度10‰)1 000 mL. 基本培養(yǎng)基配制3份，各份按C/N比均為10∶1分別加入葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉等3種碳源，配制不同碳源培養(yǎng)基. 調(diào)節(jié)pH 7.6，各碳源培養(yǎng)基分裝250 mL各3瓶，115 ℃滅菌30 min.

不同鹽度培養(yǎng)基制備. 培養(yǎng)基基本組分：NaNO30.17 g，NaNO20.035 g，K2HPO41.4 g，KH2PO42.7 g，pH 7.6，葡萄糖0.875 g. 人工海水鹽度設(shè)置3個梯度，分別為5‰、15‰、25‰. 調(diào)節(jié)pH 7.6，每個鹽度的培養(yǎng)基分裝250 mL各3瓶，115 ℃滅菌30 min.

將LZX301液體培養(yǎng)物離心去上清液，用鹽度為10‰的無菌海水重懸浮，制備濃度約為5.0×108cells/mL的菌懸液. 每瓶液體培養(yǎng)基接入制備好的菌懸液5 mL，32 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r/min.

1.5 樣品分析方法及儀器

定時取樣，用上海元析UV-5500PC紫外可見分光光度計在波長600 nm下檢測OD600，氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法測定[7]，亞硝酸鹽濃度和硝酸鹽濃度分別采用N- (1-萘基)-乙二胺分光光度法和鋅鎘還原法測定(GB/T 12763.4-2007)[8]，鹽度采用折射儀ATAGO MASTER-S/Mill α測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株16S rDNA序列分析

對菌株LZX301的16S rDNA擴增和測序，得到1 488個堿基的部分片段序列, 提交GenBank的登記號為KX685271. Blast比對結(jié)果顯示，該菌株與多株施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)菌株16S rDNA序列相似性均達99%，表1列出了菌株LZX301與其中3株的相似度結(jié)果. 16S rDNA 序列分析可以作為細菌鑒定的手段，利用該方法90%以上的可以鑒定到屬，65%～83%的可以鑒定到種[9]. 一般情況下16S rDNA 序列相似度高于99%被認為是同一個種[10].

表1 菌株LZX301的16S rDNA部分序列同源檢索結(jié)果

根據(jù)BLAST結(jié)果[11]，確認LZX301菌株屬于Pseudomonas屬，從γ-Proteobacteria類群中搜索與LZX301相似或相近的參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1). 菌株LZX301與高相似度的P.stuzeriDQ1、P.stuzeriA1501和P.stuzeriATTC 17594歸為同類，且可信度達到100%；而與同屬的P.aeruginosa和P.putida親緣關(guān)系較遠. 因此，初步認定菌株LZX301為P.stuzeri.

目前已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化菌中屬水平上假單胞菌的最多，其中又以施氏假單胞菌為主[2,12]，如P.stutzeriSU2[13]、P.stutzeriYZN-001[14]、P.stutzeriTR2[15]、P.stutzeriPCN-1[16]、P.stutzeriKTB[17]、P.stuzeriC3[18]和P.stutzeriYG-24[19].

圖1 基于菌株LZX301的16S rDNA部分序列與參考序列用N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 1 Phylogenetic tree constructed by the Neighbour Joining method on the basis of partial 16S rDNA sequence of the strain LZX301 and the reference strains

2.2 不同碳源對菌株LZX301脫氮特性的影響

圖2 葡萄糖、蔗糖和乙酸鈉為碳源時培養(yǎng)液中菌體濃度、氨氮濃度、亞硝酸鹽濃度和硝酸鹽濃度的變化

Figure 2 Concentrations of strain LZX301,ammonia,nitrite and nitrate using glucose,sucrose,and sodium acetate as the carbon source

2.3 不同鹽度對菌株LZ301脫氮特性的影響

圖3 不同鹽度培養(yǎng)液中菌體濃度以及氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽質(zhì)量濃度的變化

3 結(jié)論

在水環(huán)境氮污染治理中反硝化菌發(fā)揮著極為重要的作用，篩選高效反硝化菌是科研工作者的一項重要任務(wù)；另外，反硝化代謝需要利用碳源作為還原劑異化還原高價態(tài)的氮，不同的反硝化菌對碳源的需求存在差異，因此，比較不同碳源對反硝化菌脫氮特征的影響可以為反硝化菌的應(yīng)用提供極為重要的指導. 本文對菌株LZX301的研究分析，得到以下結(jié)論：

(1)經(jīng)16S rDNA序列的相似性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定好氧反硝化細菌菌株LZX301為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri).

(2)碳源和鹽度對其生長和脫氮特性的影響實驗結(jié)果表明，在C/N比為10∶1、無機氮為亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮時，葡萄糖為碳源時菌株LZX301的脫氮效果最好、乙酸鈉次之、蔗糖最差，且有輕微的氨氮積累. 在以葡萄糖為唯一碳源時，鹽度5‰～25‰范圍內(nèi)，48 h LZX301的無機氮去除率介于73.2%～85.8%，具有較高的脫氮活性，但是也出現(xiàn)氨氮積累.

施氏假單胞菌(P.stutzeri)是常見的好氧反硝化菌，已報道的好氧反硝化菌屬于該種的菌株最多. 從本文的研究結(jié)果來看，實驗菌株LZX301可用于中低鹽度廢水，特別是海水養(yǎng)殖水體的脫氮修復(fù)或是海水養(yǎng)殖廢水的凈化.

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【中文責編：莊曉瓊 英文責編：李海航】

Effect of Carbon Source and Salinity on Nitrogen Removal of An Aerobic Denitrifier

LIAO Shaoan1,2,3， HUANG Jiechang1,2,3， WANG Anli1,2,3*， Gao Fangzhou1,2,3， XIANG Chenxi1,2,3， LUO Niantao4，LI Yongfeng4， LAN Zongjian4

(1. School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China;2. Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education, Guangzhou 510631, China;3. Key Laboratory of Safe and Healthy Aquaculture in Guangdong Province, Guangzhou 510631, China;4. Qingyuan Fisheries Research Institute, Qingyuan 511500, China)

The aerobic denitrifying bacterium strain LZX301 was analyzed using 16S rDNA sequence. The similarity of 16S rDNA sequences between the aerobic denitrifying bacterium strain LZX301 andPseudomonasstutzeriaccessed in GenBank was 99%, and phylogenetic analysis showed that the strain, formed a monophyletic clade with members ofP.stutzeri, less closely related toP.aeruginosaorP.putida, which indicated that the strain LZX301 be assigned as the type strain ofP.stutzeri. The tests were conducted to study the effect of carbon sources and salinity on the nitrogen removal efficiency when the initial concentrations were 7 mg/L nitrite nitrogen and 28 mg/L nitrate nitrogen in the liquid media with C/N ratio 10, shaking speed at 150 r/min. The inorganic nitrogen removal efficiency was 79.1%,67.9% and 38.8%, and ammonium accumulation was observed to 1.978, 1.224 and 0.727 mg/L for glucose, sodium acetate and sucrose, respectively, which revealed glucose was the most efficient carbon source. With glucose as sole carbon source, nitrate nitrogen removal efficiency was 89.8%，86.1% and 76.5%，nitrite nitrogen removal efficiency was 36.2%, 94.7% and 96.4%, and the accumulated ammonium nitrogen was at 2.117, 0.691 and 0.595 mg/L at salinities of 5‰, 15‰ and 25‰, respectively, which revealed the strain LZX301 had good ability in removing inorganic nitrogen at salinities of 5‰-25‰. These results implied great potential of the strain LZX301 in practical applications.

aerobic denitrification； nitrogen removal； carbon source； salinity； Pseudomonas

2016-03-15 《華南師范大學學報(自然科學版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學基金項目(31472302,31172432)；廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201401B01)；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(A201001H02)

Q93

A

1000-5463(2016)06-0030-07

*通訊作者:王安利，教授，Email:wangalok@163.com.