DNA調(diào)控的銀納米簇的合成及應(yīng)用進(jìn)展

梁國(guó)海， 周小明

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

?

DNA調(diào)控的銀納米簇的合成及應(yīng)用進(jìn)展

梁國(guó)海， 周小明*

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

熒光銀納米簇具有獨(dú)特的物理及化學(xué)性質(zhì)，憑借合成簡(jiǎn)便、熒光強(qiáng)度大、量子產(chǎn)率高、抗光漂白能力強(qiáng)、熒光發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)及生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在生物檢測(cè)、成像分析等領(lǐng)域受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注. 文章基于DNA調(diào)控?zé)晒忏y納米簇的合成方法研究，綜述了關(guān)于DNA序列、長(zhǎng)度、二級(jí)結(jié)構(gòu)等對(duì)銀納米簇?zé)晒庑再|(zhì)的影響規(guī)律，并詳細(xì)介紹熒光銀納米簇在分析檢測(cè)和生物成像應(yīng)用方面的最新進(jìn)展. 相信隨著熒光納米簇材料的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)逐步凸顯，該領(lǐng)域的研究將吸引更廣泛的關(guān)注，并推動(dòng)相關(guān)交叉學(xué)科的進(jìn)展.

銀納米簇; 熒光; DNA; 檢測(cè)

先進(jìn)的光學(xué)納米探針對(duì)于生物組織的光學(xué)成像、疾病的診斷和治療具有巨大的促進(jìn)作用[1-4]. 熒光納米簇由于其獨(dú)特的光電學(xué)及化學(xué)性質(zhì)，近年來(lái)在生物檢測(cè)和成像分析領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注. 熒光納米簇(如Au、Ag和Cu)由數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)原子構(gòu)成，直徑通常小于2 nm，由于尺寸接近電子的費(fèi)米能級(jí)，能帶發(fā)生分裂，并且自由電子受納米簇的空間限制產(chǎn)生不連續(xù)的電子能級(jí)躍遷，通過(guò)電子轉(zhuǎn)換呈現(xiàn)出不同于原子和納米顆粒的光電學(xué)和化學(xué)性質(zhì)[5]. 目前此類(lèi)材料已發(fā)展為一類(lèi)新型的熒光物質(zhì). 其中，銀納米簇(Silver Nanoclusters，AgNCs)具有易于合成、熒光量子產(chǎn)率高、熒光發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，并已成為納米簇領(lǐng)域里發(fā)展前景最好的材料之一. 與有機(jī)熒光分子相比，AgNCs兼具抗光漂白性強(qiáng)、生物相容性好等特點(diǎn)，在分析檢測(cè)、生物成像、生物標(biāo)記等方面被廣泛研究.

目前AgNCs的合成主要采取模板輔助合成方法，用作模板的分子包括：聚合物(聚乙烯亞胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚酰胺-胺樹(shù)狀分子等)、DNA、多肽和蛋白[6]. 其中，由于DNA設(shè)計(jì)靈活、合成方便，為最常用的AgNCs合成模板. 并且隨著大量的合成工作的開(kāi)展，人們發(fā)現(xiàn)DNA的長(zhǎng)度及序列對(duì)于AgNCs的性質(zhì)有顯著影響，通過(guò)設(shè)計(jì)特定序列的DNA作為模板分子可合成穩(wěn)定性差異明顯、可發(fā)射不同波長(zhǎng)熒光的AgNCs(圖1)[7].

圖1 AgNCs的形成以及合成條件對(duì)其熒光性質(zhì)的影響[7]

本文主要總結(jié)不同DNA模板合成AgNCs的方法以及不同DNA模板對(duì)AgNCs發(fā)光性能影響的規(guī)律，綜述了AgNCs在生物分析、成像等方面的最新進(jìn)展.

1 DNA調(diào)控的銀納米簇的合成

1.1 單鏈DNA合成AgNCs

2004年，PETTY等[8]利用含有12個(gè)堿基的單鏈DNA(5’-AGGTCGCCGCCC-3’)合成了DNA-AgNCs. 研究發(fā)現(xiàn)Ag+傾向于優(yōu)先與雜環(huán)堿基結(jié)合，而不是DNA的磷酸骨架. AgNCs結(jié)合在胞嘧啶(Cytosine，C)的N3位置，當(dāng)其尺寸足夠小時(shí)，DNA-AgNCs將表現(xiàn)出較好的熒光性質(zhì). 每條DNA鏈上結(jié)合的Ag+個(gè)數(shù)從1到4不等，導(dǎo)致其熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度的差異. RITCHIE等[9]采用含12個(gè)胞嘧啶的DNA鏈(5’-CCCCCCCCCCCC-3’)為模板制備高熒光亮度的AgNCs，得到的納米簇可在485、525以及665 nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生多個(gè)熒光發(fā)射峰，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，紅色熒光(665 nm)將逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光(500 nm)，并且此轉(zhuǎn)變過(guò)程可通過(guò)加入還原劑逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明之前的轉(zhuǎn)變是一個(gè)氧化過(guò)程. 之后，RICHARDS等[10]為了考察C堿基位置及數(shù)量對(duì)納米簇?zé)晒庑阅艿挠绊?，選擇5種不同序列的DNA為模板合成AgNCs，得到了5種不同熒光性能(波長(zhǎng)為485～705 nm，從藍(lán)光到近紅外熒光)的DNA-AgNCs，他們通過(guò)一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)推斷DNA 5’和3’端三聯(lián)胞嘧啶(CCC)的存在有利于穩(wěn)定DNA-AgNCs，而DNA骨架內(nèi)部3個(gè)C-G堿基對(duì)和2個(gè)T-A堿基對(duì)的存在不利于C- Ag+-C的形成.

此外，人們研究了具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA(如發(fā)夾結(jié)構(gòu)，i-motify，G-四鏈體結(jié)構(gòu))在合成AgNCs方面的應(yīng)用. GWINN課題組[11]利用具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的C-環(huán)合成了DNA-AgNCs. 他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)以具有C-環(huán)或G-環(huán)的發(fā)夾型DNA合成AgNCs時(shí)，納米簇表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光；然而以包含A-環(huán)或T-環(huán)的DNA作為模板時(shí)，AgNCs在可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍熒光很弱. 且當(dāng)發(fā)夾環(huán)中C堿基的數(shù)量從3增加到12時(shí)，在全C-環(huán)中AgNCs能夠形成，當(dāng)環(huán)中包含7個(gè)C堿基時(shí)，生成的DNA-AgNCs熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，當(dāng)C堿基超過(guò)7個(gè)時(shí)熒光無(wú)明顯增強(qiáng). 隨著DNA長(zhǎng)度增加，DNA-AgNCs的最大發(fā)射波長(zhǎng)將不斷紅移. CHOI等[12]分別以發(fā)夾型DNA(5’-CGCGCCCCCCCCC-CCCCGCG-3’)和直鏈DNA(C12)為模板合成AgNCs，前者熒光強(qiáng)度比后者高9倍. 在此基礎(chǔ)上，O’NEILL等[13]巧妙設(shè)計(jì)了發(fā)夾型DNA序列，使其可結(jié)合至DNA自組裝納米管上，從而實(shí)現(xiàn)AgNCs在DNA納米管上的有序可控分布.

i-motify DNA是富含胞嘧啶，并通過(guò)C-C+形成堿基夾層的核酸結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)有利于AgNCs的形成. SENGUPTA等[14]利用含有C4 i-motify的 DNA序列(TA2C4)4和(C4A2)3C4為模板合成了發(fā)射紅色和綠色熒光的AgNCs，它們分別在弱酸性或弱堿性溶液中具有最強(qiáng)的熒光亮度. 此結(jié)果證明了DNA序列和合成條件顯著影響此類(lèi)納米簇的結(jié)構(gòu)和性質(zhì).

G-四鏈體由富含鳥(niǎo)嘌呤G的核苷酸構(gòu)成，在一定的離子強(qiáng)度和酸堿環(huán)境中可形成穩(wěn)定的、高度有序的四鏈體結(jié)構(gòu). AI等[15]通過(guò)特定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)序列(AS1411)合成了雙發(fā)射的DNA-AgNCs，并證明了AS1411保留其自身的G-四鏈體結(jié)構(gòu). 正是由于這種分子間G-四鏈體結(jié)構(gòu)高度的穩(wěn)定性，發(fā)射紅色熒光的DNA-AgNCs顯示出了高度的熱穩(wěn)定性.

LI等[16]基于大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)DNA-AgNCs的結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)具有如下影響規(guī)律：(1)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定Ag+與DNA模板的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋焊籆卷曲單鏈DNA >i-motif>雙鏈DNA>G-quadruplex.(2)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定AgNCs的熒光穩(wěn)定性，以結(jié)合常數(shù)最高的富C卷曲單鏈(40.2×105mol/L)合成AgNCs的熒光穩(wěn)定性高(>300 h)；而以結(jié)合常數(shù)較低的DNA(0.64×105mol/L)合成DNA-AgNCs的熒光穩(wěn)定性僅為55 h.

1.2 雙鏈DNA合成AgNCs

和單鏈DNA相比，雙鏈DNA(dsDNA)具有更加剛性的結(jié)構(gòu)和更加明確的構(gòu)象，為設(shè)計(jì)AgNCs特定的結(jié)合位點(diǎn)提供了可能. 然而完全互補(bǔ)的dsDNA不能為AgNCs的鍵合提供足夠的空間，加入Ag+后幾乎沒(méi)有熒光. 因此dsDNA缺陷是形成dsDNA-AgNCs的必要條件[7]，如含有錯(cuò)配堿基的DNA(mismtach)、空缺位點(diǎn)堿基(AP)、空位位點(diǎn)堿基(Gap)或者凸起位點(diǎn)堿基(Bulge).

堿基錯(cuò)配是一種常見(jiàn)的DNA缺陷. dsDNA上堿基的錯(cuò)配提供了Ag+的結(jié)合位點(diǎn)，有利于AgNCs在雙鏈DNA上的形成. 通過(guò)在G-C位置上引入單一錯(cuò)配堿基對(duì)，HUANG等[17]以dsDNA為模板合成了熒光AgNCs(圖2)，他們發(fā)現(xiàn)與錯(cuò)配DNA的相互作用降低了AgNCs的熒光強(qiáng)度，并且錯(cuò)配位置上包含T和A堿基的DNA鏈引起AgNCs熒光強(qiáng)度降低的幅度明顯高于包含G和C堿基的DNA鏈.

圖2 通過(guò)堿基錯(cuò)配位點(diǎn)調(diào)控AgNCs在dsDNA上的形成和結(jié)合位置[17]

Figure 2 Schematic representation of the site-specific DNA-programmed growth of fluorescent AgNCs for DNA detection[17]

在dsDNA上設(shè)計(jì)凸起的富C環(huán)，是人為控制AgNCs結(jié)合位點(diǎn)的有效途徑. 例如，GUO等[18]構(gòu)建了一段包含富C環(huán)凸起的dsDNA模板，并成功得到發(fā)射明亮黃色熒光的AgNCs，并發(fā)現(xiàn)納米簇的熒光亮度對(duì)相鄰DNA序列十分敏感，甚至可起到識(shí)別單堿基錯(cuò)配的功能(圖3).

圖3 以富C凸起環(huán)為模板合成AgNCs及其對(duì)相鄰堿基的識(shí)別作用[18]

Figure 3 The generation of silver nanodots sometimes is sensitive to a single mutated nucleotide in a double stranded DNA[18]

另一種常見(jiàn)的DNA缺陷是脫嘧啶位點(diǎn)，這一現(xiàn)象在移除DNA上損傷或錯(cuò)誤堿基的過(guò)程中，通過(guò)DNA糖基化酶自發(fā)快速發(fā)生. DNA骨架中靠近AgNCs鍵合位點(diǎn)的側(cè)翼堿基能夠引起DNA-AgNCs熒光特性的變化. 研究人員以存在脫嘧啶位點(diǎn)的dsDNA為模板合成了熒光AgNCs[19]，如果在空缺位側(cè)翼兩端都是堿基G，那么AgNCs的熒光很強(qiáng)；反之如果側(cè)翼一端或兩端不是堿基G，那么觀察不到DNA-AgNCs熒光發(fā)射現(xiàn)象. 研究表明，合成的AgNCs的尺寸與Ag+濃度無(wú)關(guān)，熒光強(qiáng)度強(qiáng)烈依賴于DNA中堿基堆積方向[20].

1.3 DNA調(diào)控AgNCs熒光特性的趨勢(shì)

以DNA為模板合成得到的AgNCs具有高熒光量子產(chǎn)率的優(yōu)勢(shì)，并且通過(guò)簡(jiǎn)單改變DNA的序列及長(zhǎng)度，可使AgNCs的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在可見(jiàn)至近紅外區(qū)域調(diào)控(表1).

盡管缺少傳統(tǒng)方法指導(dǎo)DNA-AgNCs的準(zhǔn)確合成，但根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)DNA-AgNCs的熒光性質(zhì)受DNA模板的序列、長(zhǎng)度和環(huán)境因素(如溫度、pH、離子強(qiáng)度等)的影響顯著，并逐漸總結(jié)出以下規(guī)律：(1)由于胞嘧啶C和Ag+的高親和力，富C單鏈DNA有助于DNA-AgNCs的合成；(2)隨著DNA鏈長(zhǎng)度增加，DNA-AgNCs量子產(chǎn)率和穩(wěn)定性增強(qiáng)，且最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)有紅移趨勢(shì)；(3)與DNA結(jié)合的AgNCs原子數(shù)影響DNA-AgNCs的熒光性質(zhì)，且當(dāng)Ag+數(shù)量少于6，這種影響會(huì)更明顯.

表1 DNA模板序列及合成的DNA-AgNCs的熒光性質(zhì)

這些由實(shí)驗(yàn)觀察得到的趨勢(shì)為新型DNA-AgNCs的設(shè)計(jì)與合成提供了參考，但如前所述，關(guān)于DNA模板的序列、長(zhǎng)度和構(gòu)型對(duì)AgNCs熒光性質(zhì)的影響，目前仍缺乏更多可靠的規(guī)律，因此往往需要研究者通過(guò)大量的探索性及條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)才能得到熒光強(qiáng)度和發(fā)光波長(zhǎng)合適的DNA-AgNCs.

2 DNA-AgNCs在分析檢測(cè)中的應(yīng)用

由于DNA-AgNCs具有強(qiáng)烈的熒光亮度并且其熒光強(qiáng)度受到DNA序列、結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素顯著影響的特點(diǎn)，近年來(lái)，DNA-AgNCs已經(jīng)成為一種新型的熒光納米探針，用于對(duì)重金屬離子、有機(jī)小分子、DNA和蛋白的檢測(cè)，并進(jìn)一步應(yīng)用于生物成像.

2.1 重金屬離子的檢測(cè)

通過(guò)熒光法檢測(cè)重金屬離子一般采用有機(jī)小分子探針，但有機(jī)熒光分子探針的設(shè)計(jì)合成過(guò)程較為復(fù)雜，容易污染環(huán)境，且對(duì)人體有害. 而DNA-AgNCs的合成過(guò)程十分簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保、無(wú)生物毒性，因此可更好地應(yīng)用于環(huán)境中重金屬離子的檢測(cè)，并且具有在生物體內(nèi)檢測(cè)金屬離子的應(yīng)用潛力.

重金屬離子，特別是Hg2+和Cu2+，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)身體健康和生態(tài)環(huán)境. 例如，Hg2+與DNA有強(qiáng)烈的鍵合作用，可造成大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷. 基于Hg2+與Ag+之間的5d10-4d10作用導(dǎo)致AgNCs熒光淬滅的原理[31]，DNA-AgNCs可用于檢測(cè)Hg2+. Hg2+的存在削弱了AgNCs與DNA模板之間的相互作用，導(dǎo)致納米簇?zé)晒獯銣?，例如，VOSCH等[25]開(kāi)發(fā)了一種以5’-CCCTTCCTTCCTTCCAACCAACCC-3’(DNATAr2)結(jié)合的AgNCs(DNATAr2-AgNCs)進(jìn)行高靈敏、高選擇性檢測(cè)Hg2+的方法. DNATAr2-AgNCs的最大發(fā)射波長(zhǎng)為607 nm，量子產(chǎn)率為61%，對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為0.9 nmol/L. 在2.5～50 nmol/L范圍內(nèi)，熒光淬滅比 (IF0-IF)/IF0與Hg2+的濃度呈現(xiàn)出非常好的線性關(guān)系. 此外，他們發(fā)現(xiàn)DNA-AgNCs的熒光可在Cu2+的存在下顯著增強(qiáng)，據(jù)此建立了針對(duì)Cu2+的熒光“點(diǎn)亮”(Turn on)型檢測(cè)方法，檢測(cè)限為8 nmol/L，并成功對(duì)池塘水和土壤中的Cu2+實(shí)施定量檢測(cè)[32]. SU等[33]則利用DNA-Cu/AgNCs和3-MPA(巰基丙酸)發(fā)展了一種間接檢測(cè)Cu2+的方法，檢測(cè)限為2.7 nmol/L. MPA減弱了DNA與Cu/AgNCs的結(jié)合，導(dǎo)致熒光淬滅. Cu2+的加入加速了MPA氧化形成二硫化物，從而使DNA-Cu/AgNCs的熒光恢復(fù). 隨著Cu2+濃度由5 nmol/L增加到200 nmol/L，熒光強(qiáng)度隨之增加. 在其它高濃度(50 μmol/L)金屬離子(Zn2+、Cd2+、Pb2+、Mg2+、Mn2+、Sr2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、Ca2+等)的存在下，這種探針可對(duì)Cu2+選擇性響應(yīng).

2.2 有機(jī)小分子的檢測(cè)

有機(jī)小分子與DNA之間的特定相互作用，引起DNA構(gòu)像發(fā)生變化，從而導(dǎo)致DNA-AgNCs熒光改變，根據(jù)此原理，人們?cè)O(shè)計(jì)了一系列可對(duì)特定小分子進(jìn)行高靈敏度定量檢測(cè)的方案. 例如，以5’-AACCCCTAACCCCT-3’為模板合成的DNA-AgNCs可用于檢測(cè)ATP[34]. DNA-AgNCs具有非常好的熒光特性，熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長(zhǎng)與溶液pH和ATP濃度有關(guān). 當(dāng)pH為3.0和11.0時(shí)，ATP濃度對(duì)DNA-AgNCs的熒光具有顯著影響. pH為3.0時(shí)，隨著ATP濃度由10 μmol/L增加到50 μmol/L，發(fā)射波長(zhǎng)從525 nm移至585 nm；pH為11.0時(shí)，隨著ATP濃度增加，DNA-AgNCs在510 nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng). 基于可卡因和適配體之間強(qiáng)烈的作用力，ZHOU等[35]合成了DNA-AgNCs用于檢測(cè)可卡因，檢測(cè)限為0.1 μmol/L. 2個(gè)DNA片段與可卡因結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，使熒光AgNCs得以形成. 為了提高可卡因檢測(cè)的靈敏度(2 nmol/L)，研究者進(jìn)一步采用了剪切酶輔助的信號(hào)放大方法[36]，在可卡因存在時(shí)，剪切酶將DNA切成2個(gè)短序列，從而輔助熒光AgNCs的形成. 生物巰基化合物(Biothiols)，如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)對(duì)于維持細(xì)胞功能和人體生理機(jī)能具有重要意義，體內(nèi)巰基化合物濃度的改變與多種疾病的發(fā)生相關(guān)[37]，因此準(zhǔn)確檢測(cè)此類(lèi)化合物具有顯著的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)價(jià)值. HAN等[38]發(fā)現(xiàn)生物巰基化合物可顯著淬滅DNA-AgNCs的熒光，因此以DNA-AgNCs為探針，他們成功對(duì)人血清中的生物巰基化合物進(jìn)行定量檢測(cè).

2.3 核酸檢測(cè)

核酸檢測(cè)對(duì)于疾病診斷、致病菌識(shí)別、基因治療等領(lǐng)域均有重要意義，隨著AgNCs合成技術(shù)的不斷提高，近年來(lái)人們提出多種基于AgNCs的核酸檢測(cè)方法. YEH等[39]在2010年首先發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)光暗淡的DNA-AgNCs與富G或富T的DNA足夠接近時(shí)，其熒光將大幅提升(圖4A)，其中，當(dāng)與富G增強(qiáng)序列接近時(shí)，納米簇的熒光可提升500倍，并且熒光提升比例受納米簇的合成模板DNA的序列及長(zhǎng)度影響顯著[40]，他們稱這種結(jié)合富G增強(qiáng)序列實(shí)現(xiàn)熒光響應(yīng)的探針為“納米簇信標(biāo)”(NanoCluster Beacon，NCB)，通過(guò)NCB他們實(shí)現(xiàn)了對(duì)流感病毒DNA的熒光“點(diǎn)亮”型檢測(cè)[39].

圖4 “納米簇信標(biāo)”結(jié)構(gòu)及其對(duì)MicroRNA的檢測(cè)

之后，YEH等[41]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NCB與目標(biāo)DNA的結(jié)合形式和位置甚至可影響納米簇的熒光發(fā)射波長(zhǎng)(最大發(fā)射波長(zhǎng)可移動(dòng)60～70 nm)，據(jù)此他們通過(guò)簡(jiǎn)單觀察AgNCs熒光顏色的改變實(shí)現(xiàn)了DNA單堿基突變的識(shí)別. ZHANG等[42]則把NCB與Exo III酶切放大技術(shù)相結(jié)合，顯著提高了檢測(cè)DNA的靈敏度. ZHANG等[43]首先以發(fā)夾DNA為模板合成DNA-AgNCs探針，并通過(guò)NCB探針對(duì)MicroRNA的特異性進(jìn)行檢測(cè). 該發(fā)夾DNA可特異性識(shí)別并結(jié)合MicroRNA，當(dāng)發(fā)夾打開(kāi)時(shí)，一段富G引物DNA可與DNA-AgNCs結(jié)合，引發(fā)鏈置換擴(kuò)增，并使DNA-AgNCs熒光大幅提高，根據(jù)熒光強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)MicroRNA(miR-16-3p和miR-19b-5p)定量檢測(cè)(圖4B).

除NCB探針外，人們通過(guò)結(jié)合有機(jī)淬滅基團(tuán)或納米材料，構(gòu)建了一系列對(duì)核酸響應(yīng)的DNA-AgNCs探針. 例如，ENKIN等[44]通過(guò)探針DNA分別與DNA-AgNCs和淬滅基團(tuán)修飾的DNA交聯(lián)，使AgNCs與淬滅基團(tuán)靠近，從而使熒光淬滅；當(dāng)樣品中出現(xiàn)目標(biāo)DNA時(shí)，目標(biāo)DNA與探針DNA交聯(lián)，使AgNCs與淬滅基團(tuán)分離，熒光得以恢復(fù). 根據(jù)上述原理，他們對(duì)Werner綜合癥和HIV的核酸進(jìn)行了熒光“點(diǎn)亮”型檢測(cè)(圖5A). 最近，QI等[45]以抗腫瘤藥物mitoxantrone(MTX)淬滅DNA-AgNCs，然后通過(guò)HIV反式激活反應(yīng)區(qū)域(TAR)RNA或Rev應(yīng)答因子(RRE)RNA“搶奪”MTX，使DNA-AgNCs熒光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)TAR RNA和RRE RNA的定量檢測(cè). 利用氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO)強(qiáng)烈淬滅DNA-AgNCs熒光的特性，TAO等[46]和LIU等[47]分別構(gòu)建了GO負(fù)載DNA-AgNCs的探針，當(dāng)加入目標(biāo)DNA或蛋白時(shí)，DNA-AgNCs與目標(biāo)結(jié)合，從而脫離GO表面，其熒光得到恢復(fù)，根據(jù)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸或蛋白的定量檢測(cè)(圖5B). 該方法充分應(yīng)用了DNA合成AgNCs并吸附在GO表面的性質(zhì)，無(wú)需對(duì)DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，檢測(cè)成本有效降低.

圖5 “點(diǎn)亮”型DNA-AgNCs探針對(duì)核酸及蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)

另外，結(jié)合信號(hào)放大技術(shù)，以DNA-AgNCs為檢測(cè)探針可以構(gòu)建高靈敏度的核酸檢測(cè)方法. 例如，LIU等[48]采用等溫循環(huán)放大技術(shù)對(duì)miRNA進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，僅在目標(biāo)miRNA存在時(shí)等溫循環(huán)擴(kuò)增才能發(fā)生，再以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板合成AgNCs，以AgNCs的熒光信號(hào)作為定量檢測(cè)信號(hào)，對(duì)miRNA的檢測(cè)限可達(dá)10-18mol/L. YE等[49]則把滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling Circle Amplification，RCA)技術(shù)與NCB探針相結(jié)合，通過(guò)RCA產(chǎn)物分別與DNA-AgNCs和富G增強(qiáng)鏈配對(duì)結(jié)合，使AgNCs與富G增強(qiáng)鏈靠近，熒光亮度顯著提升，此方法對(duì)DNA的檢測(cè)范圍為6～300 pmol/L，檢測(cè)限低至0.84 pmol/L.

2.4 蛋白質(zhì)檢測(cè)

蛋白質(zhì)在細(xì)胞分裂，信號(hào)和凋亡方面發(fā)揮著重

要作用[50-51]. 許多重要的蛋白的濃度非常低(通常是nmol/L或更低水平)，這使得生物樣品中蛋白的檢測(cè)非常具有挑戰(zhàn)性. 除抗體外，特定構(gòu)型的適配體(小分子DNA和RNA)與蛋白之間具有特異性的鍵合能力[52]. 利用適配體合成的DNA-AgNCs可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高靈敏、高選擇性檢測(cè)[53-55]. SHARMA等[22]報(bào)道了一種利用適配體功能化的DNA-AgNCs進(jìn)行凝血酶檢測(cè)的方法. 加入凝血酶時(shí)，凝血酶與DNA-AgNCs模板中的核酸適配體片段DNA特異性結(jié)合，AgNCs的微環(huán)境被改變，引起熒光淬滅，該方法檢測(cè)限達(dá)到1 nmol/L. 此外，研究還構(gòu)建了“點(diǎn)亮”模式進(jìn)行凝血酶熒光檢測(cè)[56]，該方法有效消除了背景信號(hào)的干擾，對(duì)凝血酶的檢測(cè)更靈敏、選擇性更好.

3 生物成像

與傳統(tǒng)的成像方式相比，利用超小尺寸的熒光納米簇進(jìn)行成像具有很多優(yōu)勢(shì)，如熒光發(fā)射性質(zhì)優(yōu)越、良好的生物相容性、檢測(cè)靈敏度高等. 這些優(yōu)勢(shì)使得金屬納米簇逐漸成為更有價(jià)值的生物成像和熒光探針的替代物. 目前，金屬納米簇在生物成像方面的應(yīng)用已有大量研究，其中DNA-AgNCs具有合成簡(jiǎn)便以及性質(zhì)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，在生物成像方面具有明顯的應(yīng)用價(jià)值. LI[54]以AS1411適配體為模板合成了對(duì)MCF-7細(xì)胞核特異性標(biāo)記的DNA-AgNCs. AS1411通過(guò)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)可與核仁素(nucleolin)高效結(jié)合，從而攜帶AgNCs進(jìn)入MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞)(圖6A). 研究發(fā)現(xiàn)適配體AS1411中T5片段和成核序列的存在對(duì)AgNCs的熒光發(fā)射性能具有重要作用. 此外，AS1411-AgNCs復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)腫瘤細(xì)胞的活力比AS1411具有更顯著的抑制作用. 除AS1411外，DNA序列Sgc8c同樣可用于細(xì)胞識(shí)別，通過(guò)高效結(jié)合細(xì)胞膜表面分泌物PTK7，可對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞(人急性淋巴白血病細(xì)胞)進(jìn)行特異性識(shí)別和結(jié)合. SUN[53]以CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞的適配體Sgc8c為DNA模板合成了AgNCs. 功能化的AgNCs對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞具有顯著的靶向結(jié)合效果，進(jìn)入細(xì)胞后可到達(dá)細(xì)胞核. 他們利用流式細(xì)胞儀和共聚焦熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè). YIN等[57]也開(kāi)展了以Sgc8c為模板合成AgNCs并對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別的研究工作，他們系統(tǒng)地分析了連接富C序列(用于合成并結(jié)合AgNCs)和Sgc8c序列(靶向作用)的堿基類(lèi)型和數(shù)量對(duì)納米簇?zé)晒饬炼鹊挠绊懀l(fā)現(xiàn)以6個(gè)腺嘌呤作為連接序列時(shí)，熒光亮度最高. 之后，他們把NCB技術(shù)引入到生物成像應(yīng)用當(dāng)中，設(shè)計(jì)了一段結(jié)構(gòu)巧妙的DNA序列用于合成AgNCs，該DNA還包含Sgc8c序列和富G增強(qiáng)序列，當(dāng)Sgc8c通過(guò)形成G-四鏈體結(jié)合至CCRF-CEM細(xì)胞表面時(shí)，DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，富G增強(qiáng)序列與AgNCs靠近，使熒光大幅增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的熒光“點(diǎn)亮”檢測(cè)(圖6B)[58].

圖6 DNA-AgNCs在細(xì)胞識(shí)別和標(biāo)記中的應(yīng)用

4 結(jié)論與展望

以DNA為模板合成的熒光AgNCs具有顯著的性能優(yōu)勢(shì)：熒光發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)(可見(jiàn)光-近紅外)、熒光量子產(chǎn)率高、生物相容性好，還可通過(guò)設(shè)計(jì)DNA序列賦予AgNCs不同功能. 人們利用DNA-AgNCs成功對(duì)重金屬離子、有機(jī)小分子、核酸、蛋白以及細(xì)胞等不同生物和環(huán)境樣品進(jìn)行分析的結(jié)果顯示DNA-AgNCs在傳感分析和細(xì)胞成像領(lǐng)域具有顯著的應(yīng)用潛力.

然而，根據(jù)大量的文獻(xiàn)結(jié)果，目前仍然存在以下幾方面問(wèn)題阻礙著DNA-AgNCs相關(guān)材料的研究和應(yīng)用：(1)合成成本較高. 以DNA為模板合成AgNCs時(shí)，一般需要DNA的濃度為mmol量級(jí)，因此合成成本高于半導(dǎo)體量子點(diǎn)、碳量子點(diǎn)、金納米簇等熒光材料，不適合大量制備；(2)關(guān)于DNA序列與AgNCs熒光發(fā)射波長(zhǎng)和亮度之間的關(guān)系還不明確；(3)DNA-AgNCs的結(jié)構(gòu)還未被精確解析，因此其結(jié)構(gòu)與熒光性質(zhì)之間的關(guān)系也未有明確的結(jié)論；(4)在某些條件下DNA-AgNCs的穩(wěn)定性較差. 如高鹽濃度、高溫或者在pH小于5.0或大于8.0時(shí)，結(jié)構(gòu)和熒光性質(zhì)容易發(fā)生顯著改變，這是阻礙DNA-AgNCs在檢測(cè)和生物標(biāo)記方面廣泛應(yīng)用的最重要因素.

為了解決上述存在的問(wèn)題，并進(jìn)一步提升DNA-AgNCs的應(yīng)用價(jià)值，需要在相關(guān)領(lǐng)域開(kāi)展更深入的研究. 例如，基于DNA-Cu/AgNCs和DNA-Au/AgNCs具有更高熒光亮度和穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可考慮以DNA為模板構(gòu)建摻雜不同金屬元素的AgNCs，有望獲得熒光亮度與穩(wěn)定性有進(jìn)一步提升的納米簇；而在合成時(shí)引入其它與Ag+具有高親和力的分子，使其結(jié)合至AgNCs表面，同樣是提升納米簇穩(wěn)定性的有價(jià)值的研究方向. 最后，通過(guò)借鑒在核酸研究領(lǐng)域已取得的成果，設(shè)計(jì)巧妙的DNA序列作為模板合成AgNCs，DNA-AgNCs及相關(guān)材料有望完成更多分析檢測(cè)、成像標(biāo)記甚至疾病治療的任務(wù).

[1] ROSI N L,MIRKIN C. A nanostructures in biodiagnostics[J]. Chemical Reviews,2005,105(4):1547-1562.

[2] MICHALET X,PINAUD F F,BENTOLILA L A,et al. Quantum dots for live cells,in vivo imaging,and diagnostics[J]. Science,2005,307(5709):538-544.

[3] WANG F,LIU X. Recent advances in the chemistry of lanthanide-doped upconversion nanocrystals[J]. Chemical Society Reviews,2009,38(4):976-989.

[4] 詹求強(qiáng),張欣,李心,等. 幾種先進(jìn)的光學(xué)納米探針在光學(xué)生物診療中的應(yīng)用[J]. 激光生物學(xué)報(bào),2015,24(3):207-219.

ZHAN Q Q,ZHANG X,Li X,et al. Using some nanoparticles as optical probes for optical bioimaging[J]. Acta Laser Biology Sinica,2015,24(3):207-219.

[5] ZHENG J,ZHOU C,YU M,et al. Different sized luminescent gold nanoparticles[J]. Nanoscale,2012,4(14):4073-4083.

[6] CHOI S,DICKSON R M,YU J. Developing luminescent silver nanodots for biological applications[J]. Chemical Society Reviews,2012,41(5):1867-1891.

[7] YUAN Z,CHEN Y C,LI H W,et al. Fluorescent silver nanoclusters stabilized by DNA scaffolds[J]. Chemical Communications,2014,50(69):9800-9815.

[8] PETTY J T,ZHENG J,HUD N V,et al. DNA-templated Ag nanocluster formation[J]. Journal of the American Chemical Society,2004,126(16):5207-5212.

[9] RITCHIE C M,JOHNSEN K R,KISER J R,et al. Ag nanocluster formation using a cytosine oligonucleotide template[J]. The Journal of Physical Chemistry C,2007,111(1):175-181.

[10]RICHARDS C I,CHOI S,HSIANG J C,et al. Oligonucleotide-stabilized Ag nanocluster fluorophores[J]. Journal of the American Chemical Society,2008,130(15):5038-5039.

[11]GWINN E G,O’NEILL P R,GUERRERO A J,et al. Sequence-dependent fluorescence of DNA-hosted silver nanoclusters[J]. Advanced Materials,2008,20(2):279-283.

[12]CHOI S,YU J,PATEL S A,et al. Tailoring silver nanodots for intracellular staining[J]. Photochemical & Photobiological Sciences,2011,10(1):109-115.

[13]O’NEILL P R,YOUNG K,SCHIFFELS D,et al. Few-atom fluorescent silver clusters assemble at programmed sites on DNA nanotubes[J]. Nano Letters,2012,12(11):5464-5469.

[14]SENGUPTA B,SPRINGER K,BUCKMAN J G,et al. DNA Templates for fluorescent silver clusters and I-Motif folding[J]. The Journal of Physical Chemistry C,2009,113(45):19518-19524.

[15]AI J,GUO W,LI B,et al. DNA G-quadruplex-templated formation of the fluorescent silver nanocluster and its application to bioimaging[J]. Talanta,2012,88:450-455.

[16]LI W,LIU L,FU Y,et al. Effects of polymorphic DNA on the fluorescent properties of silver nanoclusters[J]. Photochemical & Photobiological Sciences,2013,12(10):1864-1872.

[17]HUANG Z,PU F,HU D,et al. Site-specific DNA-programmed growth of fluorescent and functional silver nanoclusters[J]. Chemistry:A European Journal,2011,17(13):3774-3780.

[18]GUO W,YUAN J,DONG Q,et al. Highly sequence-dependent formation of fluorescent silver nanoclusters in hybridized DNA duplexes for single nucleotide mutation identification[J]. Journal of the American Chemical Society,2010,132(3):932-934.

[19]KUN M,QINGHUA C,GUIYING L,et al. DNA abasic site-directed formation of fluorescent silver nanoclusters for selective nucleobase recognition[J]. Nanotechnology,2011,22(30):Art 305502,6pp.

[20]MA K,SHAO Y,CUI Q,et al. Base-stacking-determined fluorescence emission of DNA abasic site-templated silver nanoclusters[J]. Langmuir,2012,28(43):15313-15322.

[21]CHOI S,YU J,PATEL S A,et al. Tailoring silver nano-dots for intracellular staining[J]. Photochemical & Photobiological Sciences,2011,10(1):109-115.

[22]SHARMA J,YEH H C,YOO H,et al. Silver nanocluster aptamers:in situ generation of intrinsically fluorescent recognition ligands for protein detection[J]. Chemical Communications,2011,47(8):2294-2296.

[23]Zhao T T,Chen Q Y,Zeng C,et al. Multi-DNA-Ag nanoclusters:reassembly mechanism and sensing the change of HIF in cells[J]. Journal of Materials Chemistry B,2013,1(36):4678-4683.

[24]VOSCH T,ANTOKU Y,HSIANG J C,et al. Strongly emissive individual DNA-encapsulated Ag nanoclusters as single-molecule fluorophores[J]. The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007,104(31):12616-12621.

[25]LAN G Y,CHEN W Y,CHANG H T. Control of synthesis and optical properties of DNA templated silver nanoclusters by varying DNA length and sequence[J]. RSC Advances,2011,1(5):802-807.

[26]PETTY J T,FAN C,STORY S P,et al. DNA encapsulation of 10 silver atoms producing a bright,modulatable,near-infrared-emitting cluster[J]. The Journal of Physical Chemistry Letters,2010,1(17):2524-2529.

[27]PETTY J T,STORY S P,HSIANG J C,et al. DNA-templated molecular silver fluorophores[J]. The Journal of Physical Chemistry Letters,2013,4(7):1148-1155.

[28]PETTY J T,FAN C,STORY S P,et al. Optically enhanced,near-IR,silver cluster emission altered by single base changes in the DNA template[J]. Journal of Physical Chemistry B,2011,115(24):7996-8003.

[29]O’NEILL P R,VELAZQUEZ L R,DUNN D G,et al. Hairpins with poly-C loops stabilize four types of fluorescent Agn:DNA[J]. Journal of Physical Chemistry C,2009,113(11):4229-4233.

[30]SCHULTZ D,GARDNER K,OEMRAWSINGH S S R,et al. Evidence for rod-shaped DNA-stabilized silver nanocluster emitters[J]. Advanced Materials,2013,25(20):2797-2803.

[31]YUAN X,YEOW T J,ZHANG Q,et al. Highly luminescent Ag+nanoclusters for Hg2+ion detection[J]. Nanoscale,2012,4(6):1968-1971.

[32]LAN G Y,HUANG C C,CHANG H T. Silver nanoclusters as fluorescent probes for selective and sensitive detection of copper ions[J]. Chemical Communications,2010,46(8):1257-1259.

[33]SU Y T,LAN G Y,CHEN W Y,et al. Detection of copper ions through recovery of the fluorescence of DNA-templated copper/silver nanoclusters in the presence of mercaptopropionic acid.[J]. Analytical Chemistry,2010,82(20):8566-8572.

[34]LEE J D,CANG J,CHEN Y C,et al. Detection of adenosine 5′-triphosphate by fluorescence variation of oligonucleotide-templated silver nanoclusters[J]. Biosensors & Bioelectronics,2014,58:266-271.

[35]ZHOU Z,DU Y,DONG S. DNA-Ag nanoclusters as fluorescence probe for turn-on aptamer sensor of small molecules[J]. Biosensors and Bioelectronics,2011,28(1):33-37.

[36]ZHANG K,WANG K,ZHU X,et al. Label-free and ultrasensitive fluorescence detection of cocaine based on a strategy that utilizes DNA-templated silver nanoclusters and the nicking endonuclease-assisted signal amplification method[J]. Chemical Communications,2014,50(2):180-182.

[37]ZHU J,SONG X,GAO L,et al. A highly selective sensor of cysteine with tunable sensitivity and detection window based on dual-emission Ag nanoclusters[J]. Biosensors & Bioelectronics,2014,53:71-75.

[38]HAN B,WANG E. Oligonucleotide-stabilized fluorescent silver nanoclusters for sensitive detection of biothiols in biological fluids[J]. Biosensors and Bioelectronics,2011,26(5):2585-2589.

[39]YEH H C,SHARMA J,HAN J J,et al. A DNA-silver nanocluster probe that fluoresces upon hybridization[J]. Nano Letters,2010,10(8):3106-3110.

[40]OBLIOSCA J M,BABIN M C,LIU C,et al. A complementary palette of nanocluster beacons[J]. ACS Nano,2014,8(10):10150-10160.

[41]YEH H C,SHARMA J,SHIH I M,et al. A fluorescence light-up Ag nanocluster probe that discriminates single-nucleotide variants by emission color[J]. Journal of the American Chemical Society,2012,134(28):11550-11558.

[42]ZHANG L,ZHU J,ZHOU Z,et al. A new approach to light up DNA/Ag nanocluster-based beacons for bioanalysis[J]. Chemical Science,2013,4(10):4004-4010.

[43]ZHANG J,LI C,ZHI X,et al. Hairpin DNA-templated silver nanoclusters as novel beacons in strand displacement amplification for microRNA detection[J]. Analytical Chemistry,2016,88(2):1294-1302.

[44]ENKIN N,WANG F,SHARON E,et al. Multiplexed analysis of genes using nucleic acid-stabilized silver-nanocluster quantum dots[J]. ACS Nano,2014,8(11):11666-11673.

[45]QI L,HUO Y,WANG H,et al. Fluorescent DNA-protected silver nanoclusters for ligand-HIV RNA interaction assay[J]. Analytical Chemistry,2015,87(21):11078-11083.

[46]TAO Y,LIN Y,HUANG Z,et al. DNA-templated silver nanoclusters-graphene oxide nanohybrid materials:a platform for label-free and sensitive fluorescence turn-on detection of multiple nucleic acid targets[J]. Analyst,2012,137(11):2588-2592.

[47]LIU X,WANG F,AIZEN R,et al. Graphene oxide/nucleic-acid-stabilized silver nanoclusters:functional hybrid materials for optical aptamer sensing and multiplexed analysis of pathogenic DNAs[J]. Journal of the American Chemical Society,2013,135(32):11832-11839.

[48]LIU Y Q,ZHANG M,YIN B C,et al. Attomolar ultrasensitive microRNA detection by DNA-scaffolded silver-nanocluster probe based on isothermal amplification[J]. Analytical Chemistry,2012,84(12):5165-5169.

[49]YE T,CHEN J,LIU Y,et al. Periodic fluorescent silver clusters assembled by rolling circle amplification and their sensor application[J]. ACS Applied Materials & Interfaces,2014,6(18):16091-16096.

[50]HEMERT M J V,STEENSMA H Y,HEUSDEN G P H V. 14-3-3 proteins:key regulators of cell division,signalling and apoptosis[J]. Bioessays News & Reviews in Molecular Cellular & Developmental Biology,2001,23(10):936-946.

[51]CULURGIONI S,MAPELLI M. Going vertical:functional role and working principles of the protein Inscuteable in asymmetric cell divisions[J]. Cellular & Molecular Life Sciences Cmls,2013,70(21):4039-4046.

[52]ILIUK A B,HU L,TAO W A. Aptamer in bioanalytical applications[J]. Analytical Chemistry,2011,83(12):4440-4452.

[53]SUN Z,WANG Y,WEI Y,et al. Ag cluster-aptamer hybrid:specifically marking the nucleus of live cells[J]. Chemical Communications,2011,47(43):11960-11962.

[54]LI J,ZHONG X,CHENG F,et al. One-pot synthesis of aptamer-functionalized silver nanoclusters for cell-type-specific imaging[J]. Analytical Chemistry,2012,84(9):4140-4146.

[55]YIN J,HE X,WANG K,et al. One-step engineering of silver nanoclusters-aptamer assemblies as luminescent labels to target tumor cells[J]. Nanoscale,2012,4(1):110-112.

[56]LI J,ZHONG X,ZHANG H,et al. Binding-induced fluo-rescence turn-on assay using aptamer-functionalized silver nanocluster DNA probes[J]. Analytical Chemistry,2012,84(12):5170-5174.

[57]YIN J,HE X,WANG K,et al. One-step engineering of silver nanoclusters-aptamer assemblies as luminescent labels to target tumor cells[J]. Nanoscale,2012,4(1):110-112.

[58]YIN J,HE X,WANG K,et al. Label-free and turn-on aptamer strategy for cancer cells detection based on a DNA-silver nanocluster fluorescence upon recognition-induced hybridization[J]. Analytical Chemistry,2013,85(24):12011-12019.

【中文責(zé)編：成文 英文責(zé)編：李海航】

Review: Synthesis and Biological Applications of DNA-Protected Silver Nanoclusters

LIANG Guohai, ZHOU Xiaoming*

(MOE Key Laboratory of Laser Life Science, College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Fluorescent silver nanoclusters are finding ever-expanding roles as probes and biolabels due to their extraordinary physical and chemical characteristics, including facile synthesis, good quantum yields, high photostability, tunable fluorescence emission, and good biocompatibility. Great efforts have been devoted to the exploration of creating DNA templated silver nanoclusters (DNA-AgNCs) in recent years. This review focuses on the recent advances in the synthesis of DNA-AgNCs, and explores the connection between the chemical/photophysical properties of DNA-AgNCs and the sequence, length, and secondary structure of DNA scaffolds. After that, some successful examples of using DNA-AgNCs in biological detection and imaging will be presented. It is expected that the rapidly growing interest in metal nanocluster-based biomedical applications will certainly not only stimulate research in this highly active field, but also inspire broader concerns across various disciplines.

fluorescent silver nanoclusters; fluorescence; DNA; biological detection

2016-05-03 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21475048)； 廣東省自然科學(xué)杰出青年科學(xué)基金(2014A030306008)；廣東省特支計(jì)劃(2014TQ01R559); 華南師范大學(xué)青年教師科研培育基金項(xiàng)目(671074)

O611.4

A

1000-5463(2016)06-0073-10

*通訊作者:周小明，特聘研究員，Email:zhouxm@scnu.edu.cn.