果蠅　Hsp83多克隆抗體的制備及鑒定

陳冬生，王雙，王劍，周利娟，陶小倩，孫福玲

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖 241000）

果蠅Hsp83多克隆抗體的制備及鑒定

陳冬生*，王雙，王劍，周利娟，陶小倩，孫福玲

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖 241000）

目的 制備和鑒定抗Hsp83蛋白的多克隆抗體。方法 利用PCR技術(shù)從果蠅cDNA中獲得hsp83基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將其轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）菌株中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利用Ni-NTA親和法純化重組蛋白；再將純化的蛋白免疫BALB／C小鼠制備多克隆抗體；利用免疫印跡法（Western blot）和免疫熒光染色法檢測多克隆抗體的特異性。結(jié)果 構(gòu)建的pET28ahsp83質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)了Hsp83融合蛋白，蛋白純化后作為抗原免疫小鼠，獲得了抗Hsp83的多克隆抗體。免疫印跡法和免疫熒光染色法檢測顯示，抗果蠅Hsp83多克隆抗體具有較高的特異性，并能檢測出內(nèi)源性Hsp83蛋白。果蠅卵巢免疫熒光染色顯示，Hsp83蛋白定位在卵巢細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)論 成功制備了小鼠抗Hsp83蛋白的特異性抗體，此工作為深入研究Hsp83蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

Hsp83蛋白；原核表達(dá)，多克隆抗體

熱休克蛋白90（Hsp90）是一類在進(jìn)化上高度保守的、原核和真核生物中普遍存在的分子伴侶蛋白，具有ATPase活性，主要參與蛋白的激活、蛋白質(zhì)的自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)的調(diào)控及多種信號傳遞過程［1-3］，在致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激損傷等過程中也發(fā)揮重要作用［4，5］。果蠅Hsp83蛋白由hsp83基因編碼，是哺乳動物熱休克蛋白Hsp90的同源物。果蠅hsp83基因定位于3號染色體上，是果蠅體內(nèi)唯一帶有一個內(nèi)含子的熱休克蛋白基因［6］。研究表明，果蠅Hsp83蛋白調(diào)控眾多的生物學(xué)過程，如參與果蠅胸、眼、翅膀、剛毛等器官的形態(tài)發(fā)生［7-9］；二聚化的Hsp83蛋白還可促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在活化和非活化狀態(tài)之間精確轉(zhuǎn)換，調(diào)控信號傳遞［10-12］；Hsp83蛋白還可以與翻譯抑制因子Cup相互作用，調(diào)控Osk、Grk和Nos蛋白質(zhì)的合成，從而調(diào)控果蠅的卵子發(fā)生［13］。此外，髙脂性食物會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，此反應(yīng)會誘導(dǎo)果蠅Hsp83蛋白高表達(dá)，從而防止氧化性損傷［14］。

本文采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備并純化了His-Hsp83融合蛋白，并將蛋白免疫小鼠獲得抗Hsp83蛋白的多克隆抗體；通過免疫印跡、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測該抗體的特異性。此工作將為更廣泛、深入地研究hsp83基因的生物學(xué)功能及其分子機制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

E．coli DH5ɑ、BL21（DE3）菌株與pET28a載體、野生型果蠅oregon、轉(zhuǎn)基因果蠅品系P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝均由本實驗室保存；果蠅hsp8308445突變體（bloomington庫，美國）；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶（TaKaRa公司，日本）；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；Ni-NTA層析試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和Western-blot顯影底物購自全式金生物有限公司；DAPI、兔GFP抗體、Alexa Fluor?488標(biāo)記羊抗兔IgG、Alexa Fluor?555標(biāo)記羊抗小鼠IgG（abcam公司，美國）；Vasa抗體由中科院動物所陳大華老師惠贈；完全弗氏佐劑、不完全佐劑（Sigma公司，德國）；實驗用BALB／C小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；其他試劑為國產(chǎn)分析純或分子生物學(xué)專用試劑。

2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

登陸果蠅flybase數(shù)據(jù)庫（http：／／flybase.org），獲取hsp83基因序列，設(shè)計一對引物，上游引物（5′-（劃線部分為BamH I酶切位點）；下游引物（5′-3′）（劃線部分為Xho I酶切位點）。以野生型果蠅cDNA為模板，擴增hsp83基因C端序列（582 bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I與XhoI雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳、切膠純化回收目的片段。純化后的目的片段與載體用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的平板上挑取單克隆并擴大培養(yǎng)，PCR鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒，送上海生工公司測序。

3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hsp83轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆接種于5 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，然后按1：25比例將過夜培養(yǎng)物接種于20ml培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600為0.6（約 2 h）時，取出 5 ml培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)前對照，向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.1mmol／L，25℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，誘導(dǎo)His-Hsp83融合蛋白表達(dá)。將10ml培養(yǎng)物，4 000 ×g室溫離心10min，棄上清，加His Binding buffer（含 PMSF1：100）對細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，離心后分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白可溶性。

4 重組蛋白的純化

將重組表達(dá)細(xì)菌進(jìn)行大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)與超聲破碎，離心后上清經(jīng)0.45孔徑濾膜過濾待用。取1.0ml Ni-NTA樹脂用binding buffer活化，然后加入過濾后的蛋白上清，經(jīng)washing buffer漂洗3次，用elution buffer洗脫，獲得高純度目的蛋白。

5 動物免疫及多克隆抗體的制備

選取5～6周健康BALB／C小鼠（體重約20～25g），采用斷尾法取血約200μl，用于制備免疫前的正常血清。將純化后的6×His-Hsp83融合蛋白溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中（濃度約0.2mg／ml），與等體積弗氏完全佐劑采用雙推法充分混勻（濃度約0.1mg／ml）。經(jīng)腹腔注射BALB／C小鼠，每只小鼠注射1ml（約100μg）。其后每2～3周免疫一次，抗原與等量不完全弗氏佐劑同上法混勻后免疫（抗原用量減半），一共免疫4次，最后心臟取血制備抗血清［15］。

6 多克隆抗體的Western blot分析

分別提取野生型果蠅oregon、轉(zhuǎn)基因果蠅P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝卵巢總蛋白及純化后蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜上，經(jīng)50 g／L脫脂牛奶封閉后，用小鼠Hsp83多克隆抗體（1：5000）孵育過夜，HRP標(biāo)記羊抗鼠單克隆抗體（1：5000）孵育3 h，暗室曝光顯色。

7 多克隆抗體的免疫熒光染色檢測

分別解剖野生型果蠅oregon、轉(zhuǎn)基因果蠅P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝及hsp8308445突變體果蠅的卵巢，40g／L甲醛固定30min，2 ml／L Triton-X 100透化處理1.5h，15g／L BSA封閉1h，分別加入免疫前血清（1：500）、小鼠Hsp83多克隆抗體（1：500）、兔Vasa抗體（1：4000）及GFP抗體（1：500）置于4℃孵育過夜；Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：1000）、Alexa Fluor?555標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1：1 000）室溫孵育3h，DAPI染色30min；進(jìn)行壓片觀察［16］。

結(jié) 果

1 pET28a-hsp83表達(dá)載體

按照圖1A所示的目標(biāo)重組質(zhì)粒的設(shè)計要求，將hsp83開放閱讀框序列置于6×His標(biāo)簽的下游，選取BamH I、Xho I作為插入位點。以野生型果蠅卵巢cDNA為模板擴增hsp83編碼區(qū)C端片段，長度為582 bp，符合理論值（圖1B）。將目的片段與 pET28a載體分別用BamH I、Xho I雙酶切后16℃連接12 h，轉(zhuǎn)化E．coli DH5ɑ菌株，菌落PCR選出陽性克隆。然后對陽性克隆進(jìn)行LB液體培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、BamH I與Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。結(jié)果如圖1C所示，重組質(zhì)粒切出兩條帶，一條是582 bp目的條帶，另一條是約5300 bp線性化的pET28a載體。此結(jié)果表明，目的條帶已正確插入到pET28a原核表達(dá)載體上。

圖1　pET28a-hsp83重組質(zhì)粒。A，pET28a-hsp83重組質(zhì)粒圖譜。B，PCR擴增　hsp83基因：M，DNA marker；1，hsp83基因 PCR擴增產(chǎn)物。C，pET28a-hsp83質(zhì)粒雙酶切鑒定（BamH I和 Xho I）：M，DNA Marker；1，陽性克隆雙酶切結(jié)果Fig.1　The recombinant plasmid of pET28a-hsp83.A，map of the recombinant plasmid.B，amplification of the hsp83 gene by PCR：M，DNA marker；1，PCR products of hsp83 gene amplification.C，identification of pET28a-hsp83 by double enzyme digestion（BamH I and Xho I）：M，DNA marker；1 result of double enzyme digestion of positive clones

2 原核表達(dá)與純化的Hsp83蛋白

用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，從IPTG濃度及培養(yǎng)溫度兩個方面對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。最終選用0.1mmol／L IPTG及25℃室溫進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，4h后，收集細(xì)菌，用細(xì)胞超聲粉碎儀裂解，4℃離心后，上清與沉淀分別用SDS-PAGE電泳分析。如圖2A所示，上清中有大量的Hsp83蛋白表達(dá)，沉淀中表達(dá)較低。用Ni-NTA樹脂親和純化的方法，純化上清液中的目標(biāo)蛋白，純化效果良好（圖2B）。

圖2　表達(dá)與純化的Hsp83融合蛋白。A，融合蛋白的SDS-PAGE分析：M，蛋白質(zhì)　marker；1，未誘導(dǎo)菌體總蛋白；2和3，IPTG誘導(dǎo)菌體總蛋白；4，誘導(dǎo)后沉淀；5，誘導(dǎo)后上清。B，融合蛋白的純化分析：M，蛋白質(zhì)marker；1，未純化上清；2，過Ni-NTA樹脂流下的上清（未結(jié)合的非目標(biāo)蛋白）；3，洗脫液Fig.2　The expression and purification of Hsp83 fusion protein.A.SDS-PAGE analysis of Hsp83 fusion protein：M，protein marker；1，total bacteria protein without IPTG induction；2 and 3，total bacteria protein after IPTG induction；4，the precipitation after induction；5，the supernatant after induction.B，purification of Hsp83 fusion protein：M，protein marker；1，the supernatant before purification；2，the supermatant flowing through the Ni-NTA resin（unbound non-target proteins）；3，the eluent

3 Hsp83抗體的特異性

將純化后的6×His-Hsp83融合蛋白（抗原蛋白）、野生型果蠅oregon及轉(zhuǎn)基因果蠅品系P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝的卵巢總蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，用制備的抗Hsp83血清進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果如圖3所示，第1、2泳道都有一條明顯的特異性主帶，其大小為25kDa，恰好等于6×His標(biāo)簽與Hsp83蛋白C端片段長度的總和，與預(yù)期相符。第3泳道為野生型果蠅卵巢的總蛋白，出現(xiàn)了唯一條帶，大小約為81kDa，與全長Hsp83大小一致，表明該多抗能很好地識別內(nèi)源性Hsp83蛋白，且具有很高的特異性。第4～6泳道為轉(zhuǎn)基因果蠅卵巢總蛋白（上樣量不同），都出現(xiàn)了兩條帶，其分子量為81 kDa和108 kDa，較小的為內(nèi)源性表達(dá)蛋白，與野生型大小相同；較大的為轉(zhuǎn)基因Hsp83-GFPHA融合蛋白，與預(yù)期符合。Western-blot結(jié)果從體外水平充分表明制備的多克隆抗體顯示了很高的特異性。

圖3　抗體特異性的Western blot分析。1和2，90ng和180ng體外原核表達(dá)的純化后融合蛋白；3，50ng野生型果蠅oregon卵巢總蛋白；4～6，50ng、100ng和200ng轉(zhuǎn)基因果蠅　P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝卵巢總蛋白Fig.3　Western blot analysis of antibody specificity.1 and 2，90ng and 180ng purified Hsp83 fusion protein；3，50ng total ovarian protein from wild-type Oregon；4 to 6，50ng，100ng and 200ng total ovarian protein from transgenic Drosophila P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝

為進(jìn)一步驗證制備的多克隆抗體的特異性，我們用抗Hsp83血清對果蠅卵巢進(jìn)行免疫熒光染色分析，共設(shè)計了3組實驗。第1組以野生型oregon卵巢為材料，用小鼠免疫前血清為陰性對照。結(jié)果如圖4A所示，野生型卵巢中Hsp83蛋白可被Hsp83多克隆抗體結(jié)合染色，并定位在果蠅卵巢細(xì)胞核（DAPI染色）周圍的胞質(zhì)中，而免疫前血清染色檢測不到熒光信號。第2組以野生型oregon與hsp83基因突變體（弱突變體）果蠅為材料，用抗 Hsp83血清進(jìn)行免疫染色，結(jié)果顯示，野生型卵巢細(xì)胞被強烈著色，hsp8308445為弱突變體，卵巢細(xì)胞中呈現(xiàn)為相對較弱的熒光染色效果，符合預(yù)期結(jié)果（圖4B）。第3組以野生型oregon和轉(zhuǎn)基因果蠅 P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝卵巢為實驗材料，轉(zhuǎn)基因品系表達(dá)Hsp83與GFPHA標(biāo)簽的融合蛋白，用兩種抗體（Hsp83抗體與GFP抗體）進(jìn)行紅、綠雙重染色。如圖4C所示，轉(zhuǎn)基因果蠅卵巢中兩種抗體的染色模式完全一致，疊加后為明顯的黃色，符合 Hsp83-GFPHA融合蛋白染色的預(yù)期目標(biāo)，而在野生型果蠅oregon卵巢中檢測不到GFP信號，也符合預(yù)期結(jié)果。免疫熒光染色的結(jié)果從體內(nèi)水平顯示了Hsp83多克隆抗體的有效性與特異性。

圖4　抗體特異性的免疫熒光染色分析。A，內(nèi)源性Hsp83在野生型果蠅　oregon卵巢中的定位；B，內(nèi)源性　Hsp83在野生型果蠅　oregon和hsp8308445突變體卵巢中的定位；C，轉(zhuǎn)基因果蠅 P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝卵巢中 Hsp83與 GFP蛋白的共定位；IgG-B，免疫前血清；比例尺，10μmFig.4　Analysis of antibody specificity by immunofluorescent staining.A，localization of endogenous Hsp83 protein in the ovary of the wild-type（oregon）；B，localization of endogenous Hsp83 protein in the ovaries of the wild-type and hsp8308445mutant flies；C，colocalization of Hsp83 and GFP protein in the ovaries of transgenic fly P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝）；IgG-B，serum IgG before immunization；scale bar，10μm

討 論

Hsp83蛋白包含兩個功能區(qū)域，一個是ATPase結(jié)構(gòu)域，另一個是HSP90結(jié)構(gòu)域。利用DNAStar軟件分析Hsp83蛋白質(zhì)的氨基酸序列，選擇C端富含親水性氨基酸的一段區(qū)域，對其相應(yīng)的基因編碼序列進(jìn)行 PCR擴增。然后，將該片段插入到pET28a原核表達(dá)載體6×His標(biāo)簽下游，得到N端標(biāo)簽的融合蛋白，利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在上清中。在用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時，為了提高蛋白的表達(dá)量，我們對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，IPTG濃度設(shè)置了5個梯度：0.01mmol／L、0.03mmol／L、0.1mmol／L、0.3mmol／L、1mmol／L，結(jié)果發(fā)現(xiàn) IPTG濃度在0.1mmol／L時，蛋白表達(dá)量相對最高。

在用Western-blot檢測時，我們先用原核表達(dá)純化的融合蛋白來檢測Hsp83抗體的最佳使用濃度，共設(shè)置了3個濃度梯度（1：1000、1：5 000和1：10 000），結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)Hsp83抗體稀釋5000倍時使用效果最佳。雖然直接用純化的蛋白抗原進(jìn)行檢測，具有很高的特異性，但不能排除6×His標(biāo)簽短肽的影響。所以我們使用了野生型果蠅oregon卵巢總蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果檢測出唯一條帶，且大小正確，從而證明了該抗體的特異性。同時，我們還使用了轉(zhuǎn)基因果蠅品系P｛hsp83P-hsp83-GFPHA｝的卵巢總蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果，出現(xiàn)了兩條帶，一條是內(nèi)源性目標(biāo)蛋白，一條是比內(nèi)源蛋白大的Hsp83-GFPHA轉(zhuǎn)基因融合蛋白，進(jìn)一步顯示了抗體的高效性與特異性。

在用免疫熒光染色檢測時，我們首先用野生型oregon卵巢為實驗材料，設(shè)置了一系列濃度梯度（1：100、1：500和1：1 000）來優(yōu)化抗體的使用濃度，發(fā)現(xiàn)抗體濃度在1：500時染色效果最好。接著我們設(shè)置了3組實驗檢測抗體的特異性。第1組用小鼠免疫前血清作為陰性對照，以排除血清的種源性導(dǎo)致的假陽性；第2組用hsp83基因的突變體作為陰性對照，以排除細(xì)胞內(nèi)非Hsp83蛋白可能導(dǎo)致的假陽性；第3組選用野生型果蠅作為GFP染色的陰性對照，通過融合蛋白Hsp83-GFPHA的雙染重疊的有無來檢測抗體的特異性，進(jìn)行進(jìn)一步的確證。

總之，本研究中制備的小鼠Hsp83抗體，在免疫印跡和免疫組織化學(xué)染色兩個方面都顯示出高效價、高特異性的優(yōu)點，為未來開展更多的體外（如免疫共沉淀等）及體內(nèi)（免疫電鏡等）研究提供了可能，也為進(jìn)一步研究Hsp83的功能及作用機制提供便利。

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Preparation and characterization of polyclonal antibody against Hsp83 of Drosophila

Chen Dongsheng*,Wang Shuang,Wang Jian,Zhou Lijuan,Tao Xiaoqian,Sun Fuling
（The College of Life Science，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China）

Objective To prepare and identify the polyclonal antibody against Drosophila Hsp83 protein.Methods The fragment of gene hsp83 was cloned from Drosophila cDNA library by PCR and then inserted into the expression vector pET28a to construct recombinant plasmids.Hsp83 fusion protein was expressed in BL21(DE3),purified by Ni-NTA affinity chromatography and then used to immunize BALB／C mice.The polyclonal antibody against Drosophila Hsp83 was gained from the mice serum.The specificity of the antibody was analyzed by Western blotting and immunofluorescent staining.Results The Hsp83 fusion protein was successfully expressed in BL21(DE3)from the pET28a-hsp83 plasmids constructed.The purified fusion protein as antigen immunized BALB／C mice and stimulated the generation of polyclonal antibody against Hsp83.The anti-Hsp83 antibody showed relatively high specificity in the western blot and immunofluorescent staining,and was able to detect endogenous Drosophila Hsp83 protein.In addition,Hsp83 was localized in the cytoplasm of ovarian cells by immunofluorescent staining.Conclusion The polyclonal antibody against Hsp83 with high specificity was successfully prepared,and this lays the foundation for further study of the functions of Hsp83 protein.

Hsp83 protein；prokaryotic expression；polyclonal antibody

Q786

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.014

2016-08-29

2016-10-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（31071266）；安徽省高校自然科學(xué)基金重點項目（KJ2015A082）；安師大研究生科研創(chuàng)新與實踐項目（2015cxsj172）；安徽高?？蒲衅脚_創(chuàng)新團(tuán)隊項目。

陳冬生，男（1973年），漢族，副教授

（To whom correspondence should be addressed）：dschgene＠163.com