血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D在乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中的臨床意義

趙云霞，崔芳芹

（蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，蚌埠 233030）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D在乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中的臨床意義

趙云霞*，崔芳芹

（蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，蚌埠 233030）

目的 探討乳腺癌中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D（VEGF-D）對(duì)淋巴管生成的作用及其與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)120例乳腺癌組織中VEGF-D的免疫反應(yīng)性，同時(shí)以D2-40、podoplanin標(biāo)記微淋巴管，計(jì)數(shù)微淋巴管密度（LVD），分析其與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 乳腺癌組織中VEGF-D蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性率、LVD值均明顯高于乳腺纖維腺瘤組織；乳腺癌組織中VEGF-D蛋白免疫反應(yīng)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且LVD值與VEGF-D表達(dá)呈線性相關(guān)。結(jié)論 VEGF-D參與乳腺癌淋巴管生成，影響乳腺癌的預(yù)后。

乳腺癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D；微淋巴管密度

乳腺癌轉(zhuǎn)移以淋巴轉(zhuǎn)移為主，是乳腺癌進(jìn)展中較早發(fā)生的事件。乳腺癌的淋巴道侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人預(yù)后不良的重要因素，因此抗淋巴道轉(zhuǎn)移成為乳腺癌治療的新方向。腫瘤新生淋巴管在淋巴轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［1-3］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D（vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D）與其受體結(jié)合，通過酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)淋巴道內(nèi)皮的增生和遷移［4］。有研究表明VEGF-D可促進(jìn)瘤內(nèi)淋巴管的生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5］。Podoplanin是目前較特異的淋巴管標(biāo)記物之一，D2-40特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，而不表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此目前被認(rèn)為是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物。腫瘤微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LVD）可反映腫瘤淋巴管的生成，是腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移獨(dú)立的危險(xiǎn)因子［6］。為揭示VEGF-D在乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，本研究觀察了乳腺癌中VEGFD的反應(yīng)性和LVD變化及其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

材料和方法

1 標(biāo)本

收集2008年6月至2012年6月間蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科）存檔的手術(shù)切除的乳腺癌石蠟標(biāo)本120例。術(shù)前患者未接受放、化療及內(nèi)分泌治療，所有標(biāo)本再次復(fù)查確認(rèn)。患者年齡31～85歲，平均年齡53歲（中位年齡50歲）。標(biāo)本中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌98例，其他22例。病理分級(jí)：Ⅰ級(jí) 18例；Ⅱ級(jí)78例；Ⅲ級(jí) 24例。參照TNM分期［7］，將標(biāo)本按腫瘤大小分為3組：最大直徑≤2.0cm者12例，直徑為2.0～5.0cm者88例，最大直徑＞5.0cm者20例。76例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，44例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另隨機(jī)選取同期乳腺纖維腺瘤標(biāo)本30例作為對(duì)照。

2 試劑和方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚4μm），分別行HE染色和S-P法免疫組織化學(xué)染色，用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。兔抗人VEGF-D、鼠抗人D2-40單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，鼠抗人podoplanin單克隆抗體購(gòu)自上海晶美生物技術(shù)有限公司，工作濃度分別為1：500、1：70和1：200。

3 結(jié)果判斷

VEGF-D在乳腺癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)。用染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞比例兩個(gè)指標(biāo)評(píng)定VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)水平。按染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色0分，著色弱1分，著色清晰為2分，著色強(qiáng)3分。按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率評(píng)分：無(wú)細(xì)胞著色0分，著色細(xì)胞0～10%1分，10%～30%2分，30%～50%3分，50%以上4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例相加，0～2分為陰性，3分（＋），4～5分（＋＋），6分（＋＋＋），7分（＋＋＋＋）。

D2-40、Podoplanin免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物均定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，以胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。本研究中D2-40、podoplanin標(biāo)記均以表達(dá)陽(yáng)性的淋巴管作為有意義的淋巴管，以此計(jì)算LVD值。淋巴管密度計(jì)數(shù)的方法參照文獻(xiàn)［8］：先于低倍鏡（×10物鏡）下確定3個(gè)淋巴管數(shù)目最多的熱點(diǎn)，然后在高倍鏡（×40物鏡）下計(jì)數(shù)，每個(gè)熱點(diǎn)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野的淋巴管數(shù)目，最終取3個(gè)熱點(diǎn)格5個(gè)高倍鏡下淋巴管平均數(shù)目作為腫瘤LVD值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，LVD值兩種不同檢測(cè)方法間的比較采用t檢驗(yàn)，VEGF-D免疫反應(yīng)性與臨床病理指標(biāo)間關(guān)系的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)，VEGF-D免疫反應(yīng)性與LVD值間關(guān)系的比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

1 乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應(yīng)性增強(qiáng)

VEGF-D免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色的顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1）。乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應(yīng)性陽(yáng)性率（82.50%）明顯高于同期乳腺纖維腺瘤組織（23.33%）。

圖1　VEGF-D免疫反應(yīng)性在乳腺癌組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的定位。比例尺，100μmFig.1　Localization of VEGF-D immunoreactivity in the cytoplasm of the mammary carcinoma tissue.Scale bar，100μm

2 乳腺癌組織中LVD增加

D2-40、podoplanin標(biāo)記陽(yáng)性的淋巴管管壁由單層內(nèi)皮細(xì)胞排列而成，壁薄，管腔具有不規(guī)則形態(tài)，管腔中無(wú)紅細(xì)胞。在癌周組織中淋巴管豐富，壁薄管腔大；中心區(qū)淋巴管少且管腔狹窄或呈條索狀。以癌周組織中的淋巴管數(shù)目計(jì)數(shù)淋巴管密度，結(jié)果顯示，癌周組織中D2-40陽(yáng)性標(biāo)記（圖2A，圖2B）的LVD值（28.32±6.63）和podoplanin標(biāo)記陽(yáng)性（圖2C，圖2D）的LVD值（27.88±6.19）明顯高于同期乳腺纖維腺瘤組織，兩者同時(shí)陽(yáng)性的LVD值26.66 ±6.56。D2-40、podoplanin標(biāo)記淋巴管數(shù)目的陽(yáng)性率具有一致性（表1）。

圖2　乳腺癌癌旁組織淋巴管的D2-40（A和B）和podoplanin（C和D）免疫組織化學(xué)標(biāo)記。比例尺，100μmFig.2　D2-40（A and B）and podoplanin（C and D）immunohistochemical labelling of lymphatic vessels in the tissue adjacent to the breast carcinoma.Scale bar，100μm

表1　乳腺癌癌旁組織中　D2-40與　Podoplanin標(biāo)記的微淋巴管密度Table 1　D2-40-and podoplanin-labelled LVD in the tissue adjacent to the breast carcinoma

3 乳腺癌中VEGF-D免疫反應(yīng)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)

76例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應(yīng)陽(yáng)性率為88.16%，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，VEGF-D免疫反應(yīng)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與腫瘤病理類型、腫瘤分級(jí)及大小等其他多個(gè)病理指標(biāo)間無(wú)相關(guān)性（表2）。

4 VEGF-D免疫反應(yīng)性與LVD值的關(guān)系

120例乳腺癌患者中，99例VEGF-D免疫反應(yīng)陽(yáng)性病例中LVD值為28.66±4.90，高于陰性組的LVD值17.24±5.07，兩者之間呈線性相關(guān)（表3）。

表2　VEGF-D免疫反應(yīng)性與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Table 2　Correlation between VEGF-D-immunoreactivity and clinicopathological features in breast carcinoma

表3　乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應(yīng)性與LVD值的關(guān)系Table 3　Relationship between VEGF-D-immunoreactivity and LVD in breast carcinoma

討　論

長(zhǎng)期以來(lái)人們?cè)噲D阻斷腫瘤的血道轉(zhuǎn)移以改善腫瘤預(yù)后，但效果并不理想。而臨床觀察證實(shí)，淋巴轉(zhuǎn)移是多種腫瘤發(fā)展過程中的早期事件。淋巴轉(zhuǎn)移也是決定乳腺癌分期和治療方案的關(guān)鍵因素之一，是影響乳腺癌療效和預(yù)后的重要因素。因此阻斷腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移成為改善腫瘤預(yù)后的可能途徑。D2-40目前被認(rèn)為是特異性較強(qiáng)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，它在成熟的淋巴管上不表達(dá)，但在多種腫瘤新生淋巴管內(nèi)皮呈免疫反應(yīng)陽(yáng)性［9］，例如，在胃癌［10］、前列腺癌、和腎癌［11］等腫瘤的淋巴管內(nèi)皮都呈D2-40免疫反應(yīng)陽(yáng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，D2-40標(biāo)記的乳腺癌組織中的微淋巴管在癌周區(qū)域管腔大，密度高，而癌中心區(qū)僅為裂隙狀或條索狀微淋巴管結(jié)構(gòu)，且數(shù)量少。由此提示，腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移可能是通過癌周的新生淋巴管實(shí)現(xiàn)的。Podoplanin亦被認(rèn)為是較特異的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物之一，是檢測(cè)腫瘤內(nèi)部新生的淋巴管較可靠的指標(biāo)［12］。本研究中采用D2-40和podoplanin標(biāo)記同一乳腺癌組織中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞并分別計(jì)數(shù)LVD值，發(fā)現(xiàn)兩者免疫反應(yīng)性相似，用兩種方法標(biāo)記乳腺癌組織測(cè)得的LVD值相近，且都與對(duì)照組有顯著差異。因此認(rèn)為兩種標(biāo)記物在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)無(wú)差異，均能客觀地反應(yīng)腫瘤組織內(nèi)部淋巴管新生情況，均為可靠的特異性的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［13］。

近來(lái)的研究表明，腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移并非是被動(dòng)的，而是一個(gè)主動(dòng)過程。某些因子刺激會(huì)促進(jìn)淋巴管的生成，而新生淋巴管是導(dǎo)致淋巴轉(zhuǎn)移的先決條件［14］。目前研究最多的促淋巴轉(zhuǎn)移的因子就是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-C和VEGF-D及其受體。VEGF-D及其受體在直腸癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤中被認(rèn)為與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且被認(rèn)為是腫瘤獨(dú)立的預(yù)后不良指標(biāo)［13，15，16］，但對(duì)乳腺癌的預(yù)后價(jià)值仍存在較大爭(zhēng)議。目前研究表明，VEGF-D通過旁分泌和自分泌的形式發(fā)揮作用，腫瘤細(xì)胞合成和分泌的VEGF-D可誘導(dǎo)其受體 VEGFR-3表達(dá)，進(jìn)而活化CRB2／ERX1／2及PI3K／AKT信號(hào)通路，觸發(fā)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及淋巴管新生，為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供條件。前期研究已證實(shí)VEGF-3在乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移中具有作用，是乳腺癌淋巴管生成的重要誘導(dǎo)因子［17］。本研究結(jié)果顯示，VEGF-D在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著增高，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且VEGF-D免疫反應(yīng)陽(yáng)性的乳腺癌組織中LVD值顯著高于陰性組，由此推斷在乳腺癌組織中VEGF-D合成和分泌增多，與其受體結(jié)合后通過相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使腫瘤內(nèi)部淋巴管的生成，導(dǎo)致淋巴轉(zhuǎn)移，而淋巴轉(zhuǎn)移是乳腺癌預(yù)后的重要影響因素，因此認(rèn)為VEGF-D的高表達(dá)與乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)［18，19］。由此可見，VEGF-D在乳腺癌的淋巴管生成中具有重要作用，影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為乳腺癌重要的預(yù)后指標(biāo)。

乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移往往發(fā)生較早且預(yù)后差，因此抗淋巴轉(zhuǎn)移治療是乳腺癌治療的重要方向。本研究結(jié)果提示腺癌組織中的D2-40、podoplanin和VEGFD的表達(dá)可以初步評(píng)估腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，為乳腺癌患者的下一步臨床治療提供參考，且 VEGF-D所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為乳腺癌靶向治療的新路徑。

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The clinical significance of vascular endothelial growth factor-D in lymphatic metastasis of breast cancer

Zhao Yunxia*,Cui Fangqin
（Department of Physiopathology，Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

Objective To investigate the role of vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)in the lymphangiogenesis of breast cancer and to evaluate its relationship with the clinicopathological characteristics and prognosis.Methods The S-P immunohistochemical method was used to detect VEGF-D immunoreactivity in 120 cases of breast cancer,and lymphatic endothelial cells were marked with D2-40 and podoplanin simultaneously.Lymphatic vessel density(LVD)was then counted,and its relationship with the clinical pathological parameters and prognosis of breast cancer was analyzed.Results Both the positive rates of VEGF-D and LVD were significantly higher in breast cancer than in breast fibro-adenoma tissue.VEGF-D immunoreactivity was positively associated with the lymph node metastasis of breast cancer.LVD was linearly correlated with the expression of VEGF-D.Conclusion VEGF-D affects breast cancer prognosis through facilitating lymphangiogenesis.

Breast cancer；vascular endothelial growth factor-D；lymphatic vessel density

R73-37

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.011

2015-11-21

2016-10-08

安徽省教育廳高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目（KJ2015B106by，KJ2016A867）

趙云霞，女（1977年），漢族，講師

（To whom correspondence should be addressed）：zhyx201312＠163.com