82株甲真菌病致病菌分布及藥敏結果分析

何文婧 高志琴 徐紅 譚靜文 蔡晴 楊虹 楊連娟

(1.上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200050；2.上海市長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍真菌病重點實驗室，上海 200003)

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·短篇論著·

82株甲真菌病致病菌分布及藥敏結果分析

何文婧1高志琴1徐紅2譚靜文1蔡晴1楊虹1楊連娟1

(1.上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200050；2.上海市長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍真菌病重點實驗室，上海 200003)

抗真菌藥；體外敏感性試驗；甲真菌?。患t色毛癬菌

甲真菌病是甲及其周圍組織的真菌感染，是皮膚科最常見的甲病，占甲病的50%。致病真菌包括皮膚癬菌、念珠菌等酵母菌及非皮膚癬菌性霉菌等。其中，紅色毛癬菌是最常見的致病菌，約占90%[1]。本文對我院2014年11月～2015年1月皮膚科門診甲真菌病患者的菌種分布和體外藥敏試驗做一回顧性分析，為臨床診斷治療提供用藥依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

受試者為我院皮膚科門診2014年11月～2015年1月就診的甲真菌病患者，臨床表現典型者予以真菌直接鏡檢和真菌培養(yǎng)以明確診斷。登記年齡和性別等一般資料。

1.2 實驗室檢查

刮取病甲甲屑做真菌直接鏡檢并同步進行真菌培養(yǎng)。

真菌直接鏡檢 取甲屑置于載玻片上；加1滴15%KOH溶液，蓋上蓋玻片；放置片刻或酒精燈火焰微加熱，即在火焰上快速過火2～3次不應沸騰；輕壓蓋玻片；冷卻后先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)、特征、位置、大小和排列等。

真菌培養(yǎng)鑒定 甲屑標本接種在含有50 μg/mL氯霉素和500 μg/mL的放線菌酮的沙堡斜面培養(yǎng)基 (SDA)上，每個樣本接種2管，置于25～28℃培養(yǎng)14 d。絲狀真菌通過菌落形態(tài)和小培養(yǎng)顯微鏡下特征鑒定；念珠菌通過轉種科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基或API20CAUX測試板條鑒定。

1.3 體外藥敏試驗

抗真菌藥物 咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、聯苯芐唑和特比萘芬為原藥藥粉，均來自Selleck Chemicals公司 (咪康唑批號S253601，酮康唑批號S135302，氟康唑批號02，伊曲康唑批號S247603，聯苯芐唑批號S185402，特比萘芬批號S172501)，藥物純度達99.9%。各藥物濃度范圍為：氟康唑0.125～64 μg/mL；伊曲康唑、酮康唑、聯苯芐唑和咪康唑0.03～16 μg/mL；特比萘芬0.007 8～4 μg/mL。

質控菌株 須癬毛癬菌ATCC MYA 4439和近平滑念珠菌ATCC 22019，均來源于第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院皮膚科惠贈。

試驗方法 皮膚癬菌參考改良的絲狀真菌M38-A2方案[2]，念珠菌參考M27-A3方案[3]。用試管倍比稀釋法制備藥物稀釋液10個濃度梯度，分別加入96孔板的1～10列，每孔均為0.1 mL，第11列為生長對照，只含有0.1 mL RPMI-1640，不含抗真菌藥物，第12列作陰性對照，均為0.2 mL的RPMI-1640。將純化的菌種培養(yǎng)成熟后制備菌懸液，應用比濁儀結合血細胞計數板肉眼計數，RPMI-1640稀釋，最終將絲狀真菌調整菌懸液濃度至 (1～5)×104CFU/mL，念珠菌調整至 (1～5)×103CFU/mL。將制備好的菌懸液接種至藥敏板上第1～11列，每孔均為0.1 mL。絲狀真菌28℃、念珠菌35℃溫箱靜止孵育培養(yǎng)。絲狀真菌96 h、念珠菌24 h開始觀察結果，用肉眼觀察結合酶標儀測OD值判定終點，與陽性對照孔比較，咪康唑、聯苯芐唑、酮康唑、氟康唑和特比萘芬取80%的生長抑制作為終點判定，伊曲康唑取100%的生長抑制為終點判定。每株受試菌株均重復實驗2次，結果平行。

2 結 果

2.1 一般資料

102例臨床懷疑甲真菌病患者中，真菌鏡檢陽性率61.8% (63/102)，培養(yǎng)陽性率80.4% (82/102)。真菌培養(yǎng)陽性患者中，男∶女=1∶1.73；患者發(fā)病年齡4～77歲，平均 (46±15.3)歲；指甲∶趾甲=1∶1.1。50歲以上的老年人指甲感染更常見，指甲∶趾甲=2.25∶1 (見表1)。

2.2 菌種分布

共分離到82株真菌，其中皮膚癬菌60例 (73.2%)，念珠菌屬21例 (25.6%)，非皮膚癬菌霉菌1例 (1.2%)(見表2)。

2.3 體外藥敏試驗

82株臨床分離株對咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、聯苯芐唑和特比萘芬的MIC濃度范圍與幾何均數情況 (見表3)。皮膚癬菌對咪康唑、酮康唑、氟康唑、聯苯芐唑和特比萘芬?guī)缀尉鶖递^低，提示敏感性較好，但是也有個別菌株在藥物工作濃度范圍內不敏感。根據M27-S4[4]念珠菌的敏感性折點判定結果，80%以上的近平滑念珠菌對咪康唑、酮康唑、聯苯芐唑和特比萘芬敏感，4株對氟康唑耐藥，3株對伊曲康唑中度敏感；70%以上的白念珠菌對酮康唑和聯苯芐唑的敏感；1株熱帶念珠菌除對聯苯芐唑耐藥外，對其他試驗菌株都敏感。1株毛霉菌對所有實驗藥物均不敏感。

表1 82例甲真菌病患者年齡段和性別分布

表2 甲真菌病患者82株分離株菌種分布

表3 常見抗真菌藥物對82株甲真菌病臨床分離株的體外藥敏結果 (μg/mL)

3 討 論

甲真菌病的發(fā)病率逐年增高，在老年人中更常見。我們研究發(fā)現50歲以上的老年人占調查人數的47.57%，與Dorko[5]報道的一致。女性的發(fā)病率明顯高于男性，尤其在40～49歲年齡段，男女構成比是1∶5.5，可能和女性更注重外表美觀而就診意愿高于男性有關。

我國各地綜合的病原學調查中顯示皮膚癬菌約占65%～70%，酵母菌約占10%～30%，主要分布在南方溫暖潮濕地區(qū)[6]。我們的研究結果顯示皮膚癬菌占73.2%，念珠菌屬占25.6%，與文獻結果相符。

隨著抗真菌藥物在臨床上的廣泛應用，念珠菌感染的耐藥也日趨升高，尤其是唑類抗真菌藥物常是臨床經驗性治療的首選藥物。因此，對臨床分離株進行菌種鑒定和體外藥敏試驗有助于臨床醫(yī)師了解念珠菌對抗真菌藥物的敏感情況和選擇用藥。我們的藥敏結果顯示，絕大部分紅色毛癬菌和須癬毛癬菌對臨床常用的抗真菌藥物的MIC值幾何均數較低，提示敏感。氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬和聯苯芐唑對須癬毛癬菌的MIC值范圍與之前文獻報道的結果幾乎相同[2]。我們分離到的酵母菌主要為白念珠菌和近平滑念珠菌，各為10株 (12.2%)。10株白念珠菌中，各有5株對氟康唑和伊曲康唑耐藥，與文獻報道的氟康唑 (54.1%)和伊曲康唑 (53.4%)耐藥情況一致[7]，這可能與臨床長期廣泛使用氟康唑和伊曲康唑有關[8]。白念珠菌和近平滑念珠菌對特比萘芬的敏感性分別為20% (2/10)和80% (8/10)，與文獻報道的4.9%和87.5%相近[9]。

藥敏試驗采用酶標儀與肉眼共同判讀結果，具有較好的一致性。利用酶標儀讀取結果可以提高靈敏度與精確度，使結果更加客觀準確，減少主觀視覺的誤差[10-11]，可行性高，可提高效率。治療前了解致病真菌的菌種和體外藥敏情況有助于臨床醫(yī)師參考用藥。

[1] 宋為民,金海生,周軼清.甲真菌病病甲形態(tài)學特征與致病真菌種類關系的研究[J].中華皮膚科雜志,2000,3(5):321-323.

[2] 胡小平,萬喆,李若瑜.應用CLSI M38-A2方案測定趾間型毛癬菌對抗真菌藥物敏感性[J].中國真菌學雜志,2011,6(3):149-152.

[3] Clinical and Laboratory Standards Institute.(CLSI).Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts[S].3rd ed.Wayne:Clinical and Laboratory Standards Institute;2008.(Approved standard.M27-A3).

[4] Clinical and Laboratory Standards Institute.(CLSI).Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;fourth informational supplement[S].Wayne:Clinical and Laboratory Standards Institute;2012.(Document M27-S4).

[5] Dorko E,Jautova J,Tkacikova L,et al.The frequency ofCandidaspecies in onychomycosis[J].Folia Microbiol,2002,47(6):727-731.[6] 中華醫(yī)學會皮膚性病學分會,中國中西醫(yī)結合學會皮膚性病專業(yè)委員會,中國醫(yī)師協(xié)會皮膚科醫(yī)師分會.中國甲真菌病診療指南[J].中國真菌學雜志,2015，10(2):118-124.

[7] 趙景,耿玉蘭,趙帥,等.294株白念珠菌藥物敏感試驗及耐藥性分析[J].中國真菌學雜志,2013,8(5):289-290.

[8] 景偉芳,李春莉,王惠平.白念珠菌506株對氟康唑和伊曲康唑的體外藥敏試驗[J].中國皮膚性病學雜志,2011,25(1):30-32.

[9] 黎小東,宋衛(wèi)忠,李平,等.生殖系統(tǒng)念珠菌感染的菌型及其體外藥敏分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2012,33(3):347-349.

[10] Meletiadis J,Mouton JW,Meis JF,et al.Comparison of spectrophotometric and visual readings of NCCLS method and evaluation of a colorimetric method based on reduction of a soluble tetrazolium salt,2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-[(sulfenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium-hydroxide],for antifungal susceptibility testing ofAspergillusspecies[J].J Clin Microbiol,2001,39(12):4256-4263.

[11] Espinel-Ingroff A,Barchiesi F,Cuenca-Estrella M,et al.Comparison of visual 24-hour and spectrophotometric 48-hour MICs to CLSI reference microdilution MICs of fluconazole,itraconazole,posaconazole,and voriconazole forCandidaspp.:a collaborative study[J].J Clin Microbiol,2005,43(9):4535-4540.

[本文編輯] 施 慧

何文婧，女 (漢族)，本科，技師.E-mail:hewenjing19901228@163.com

楊連娟,E-mail:lianjuan_yang@aliyun.com

R 756.4

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1673-3827(2016)11-0289-03

2016-05-18