洪勝輝,倪利鋒,王芊芊,陳曉娟,劉迪文
(1.浙江大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江杭州 310058; 2.杭州師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)
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試驗(yàn)研究
還原型谷胱甘肽(GSH)在小鼠體外受精中的作用初探
洪勝輝1,倪利鋒2,王芊芊1,陳曉娟1,劉迪文1
(1.浙江大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江杭州 310058; 2.杭州師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)
為研究還原型谷胱甘肽(GSH)在小鼠體外受精中的作用,試驗(yàn)選用C57BL/6J小鼠(雄鼠12周齡,雌鼠4周齡)、ICR受體鼠(8-10周齡)。GSH添加濃度分別為終濃度0、1 mmol/L、2 mmol/L,每組超排雌鼠5只,轉(zhuǎn)基因小鼠凈化試驗(yàn)每個(gè)品系超排雌鼠10只。結(jié)果顯示,在受精液(HTF)中添加GSH 1 mmol/L時(shí),小鼠體外受精效果最好,受精率達(dá)70.8%,胚胎形狀正常,未受精單細(xì)胞與異形胚較少,胚胎移植平均妊娠率達(dá)93.5%。
還原型谷胱甘肽;體外受精;受精率;產(chǎn)仔率;小鼠
還原型谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸以肽鍵形式縮合而成的三肽化合物,是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑,能把體內(nèi)的有害毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)排出體外。GSH對(duì)巰基酶具有激活作用,在生物氧化、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、保護(hù)血紅蛋白過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
哺乳動(dòng)物的精子細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化作用非常敏感,極易導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)損傷,降低精子的運(yùn)動(dòng)能力和新陳代謝。研究表明,在冷凍稀釋液中添加一定濃度的GSH能顯著增強(qiáng)牛、羊冷凍解凍精子的活力及精子質(zhì)膜、頂體膜和DNA的完整性[1-2];提高牛卵母細(xì)胞體外受精率和胚胎發(fā)育率[3]。盡管國(guó)內(nèi)有很多報(bào)道證明GSH能提高精子活力,但其研究都以牛、羊?yàn)閷?duì)象,在小鼠上鮮有報(bào)道,筆者在日常小鼠凈化實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)在小鼠體外受精液中添加GSH,探索到最適合小鼠體外受精的GSH添加量,大大提高了小鼠體外受精率和小鼠凈化效率,現(xiàn)報(bào)告如下,供參考。
1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠(雄鼠12周齡、雌鼠4周齡)、ICR受體鼠(8-10周齡)購(gòu)自上海某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物屏障中,待凈化轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)于隔離待凈化區(qū)域。
1.2 供試試劑 孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)自寧波某制藥有限公司。精子獲能液(c-TYH)和受精液(HTF)由本中心配制,所用成分均購(gòu)自sigma公司。GSH、M2培養(yǎng)液、礦物油購(gòu)自sigma公司。
1.3 超排和取卵 每只小鼠腹腔注射PMSG 5 IU,間隔48 h后腹腔注射HCG 5IU。注射HCG后15 h左右取卵,將卵團(tuán)細(xì)胞移入預(yù)先平衡的200 μL 受精液微滴中培養(yǎng)。GSH用HTF稀釋,添加濃度分別為終濃度0 、1 mmol/L、2 mmol/L的受精液,每組超排C57BL/6J 雌鼠5只。轉(zhuǎn)基因小鼠凈化試驗(yàn)每個(gè)品系超排C57BL/6J雌鼠10只。
1.4 體外受精 將C57BL/6J及轉(zhuǎn)基因雄鼠 脫頸椎處死,取附睪尾精子,精子團(tuán)移入精子獲能液c-TYH中,置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.5 h后,鏡檢精子活力和密度,輕柔吸取微滴邊緣的精子懸液加至含卵母細(xì)胞團(tuán)的受精滴中,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后洗卵,移入HTF中培養(yǎng)過(guò)夜。次日記錄2細(xì)胞胚胎數(shù)、未受精卵數(shù)、異常卵數(shù)和取卵總數(shù),統(tǒng)計(jì)受精率和異常卵比例,同時(shí)觀察胚胎細(xì)胞形態(tài)。
2.1 最佳GSH濃度確定 C57BL/6J小鼠體外受精添加GSH試驗(yàn)結(jié)果,詳見(jiàn)表1。
由表1可見(jiàn),HTF中未添加GSH時(shí),小鼠體外受精率較低,且異形胚胎數(shù)較多。添加2 mmol/L GSH 時(shí),小鼠體外受精率較高,近50% 2-cell胚胎透明帶內(nèi)插入較多精子,胚胎似毛茸茸“小球“,這類胚胎移植成活率較低。結(jié)合體外受精率及胚胎形態(tài),確定GSH添加量為1 mmol/L 時(shí),小鼠體外受精率較高、異形胚較少,試驗(yàn)結(jié)果最佳。
2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠凈化結(jié)果 詳見(jiàn)表2。
表1 確定GSH 最佳濃度添加量的試驗(yàn)結(jié)果
表2 轉(zhuǎn)基因小鼠體外受精及產(chǎn)仔結(jié)果
由表2可見(jiàn),添加1 mmol/L GSH后,小鼠平均體外受精率由58.9%提高到73.6%,平均每只供體獲得的2-cell胚胎數(shù)由12.9例提高到18.2例。且移植受體的平均妊娠率及平均胚胎移植產(chǎn)仔率無(wú)顯著差異,在相同凈化條件下,可以減少超排供體的數(shù)量,從而節(jié)約成本,提高供體利用率。
在養(yǎng)殖業(yè)中,GSH最早被添加于牛、羊精子冷凍稀釋液中以提高冷凍精子的質(zhì)量和受精率。多項(xiàng)研究表明,在冷凍稀釋液中添加GSH后的冷凍精子復(fù)蘇后體外受精率高于未添加組。有關(guān)研究認(rèn)為GSH是通過(guò)清除精細(xì)胞中的ROS 和減少精細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶泄露來(lái)達(dá)到保護(hù)精細(xì)胞免受過(guò)多氧化物質(zhì)損害的目的[1,2,4]。研究表明,GSH能促進(jìn)卵母細(xì)胞體外受精胚胎發(fā)育,減少ROS,提高抗氧化作用。同時(shí),GSH還可增加胚胎對(duì)溫度升高的耐受性,對(duì)移植后胚胎的存活和發(fā)育有著重要作用。
本研究結(jié)果表明,在小鼠體外受精液中添加適量GSH能明顯提高小鼠體外受精率,當(dāng)GSH添加量為1 mmol/L 時(shí),效果最佳,與Takeo T.等(2001)[5]研究結(jié)果基本一致。通過(guò)添加GSH,可明顯提高小鼠體外受精效率和小鼠的生物凈化效率,減少小鼠的超排量,節(jié)約成本,切實(shí)貫徹實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用中的“3R”原則。
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2016-08-16
洪勝輝(1986-),男,碩士,初級(jí)實(shí)驗(yàn)員,主要研究方向?yàn)榉N資凈化與保存。
S865.1+30.3
A
1005-7307(2016)06-0001-002