過(guò)氧化物模擬酶在生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

侯 玥,馬 野,于源華

(長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130022)

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*通訊作者

過(guò)氧化物模擬酶在生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

侯 玥,馬 野,于源華*

(長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130022)

酶是自然界經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化而產(chǎn)生的生物催化劑，天然酶作為大分子蛋白具有催化效率高、專一性強(qiáng)、作用條件嚴(yán)格的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中。但同時(shí)它亦存在純化難、易失活、不易儲(chǔ)存和價(jià)格昂貴的問(wèn)題。設(shè)計(jì)一種像酶那樣具有高度催化功能和特異性的化合物，是科學(xué)界一直追求的目標(biāo)。近年來(lái)陸續(xù)有學(xué)者采用分子合成的方法，研究出一系列比天然酶更為簡(jiǎn)單的非蛋白質(zhì)小分子化合物，使其具有與天然酶相同功能，稱之為模擬酶(Enzyme mimic or Artificial enzyme)。本文對(duì)過(guò)氧化物模擬酶在生物檢測(cè)中的研究進(jìn)展作出綜述。

1 過(guò)氧化物酶模擬酶的種類

過(guò)氧化物酶(Peroxidase;POD,EC 1.11.1.x)是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中的活性物質(zhì)，分子量范圍35000-100000D。目前已知基因序列的過(guò)氧化物酶約有6000多種。

根據(jù)Kirby分類法，模擬酶可分為:A單純酶模型，它是以化學(xué)方法通過(guò)模擬天然酶活性進(jìn)行重建和改造酶活性；B機(jī)理酶模型，它是通過(guò)對(duì)酶作用機(jī)制的探索研究，進(jìn)而指導(dǎo)模擬酶的設(shè)計(jì)和合成；C單純合成酶樣化合物，它由一些化學(xué)合成的具有酶的催化功能的簡(jiǎn)單分子。

1970年第一個(gè)過(guò)氧化物酶模擬酶出現(xiàn)[1]，當(dāng)時(shí)主要側(cè)重于對(duì)水解金屬酶催化中心的模擬。1990年之后，主要對(duì)催化中心和協(xié)同作用進(jìn)行研究[2,3]。

含鐵的過(guò)氧化物酶(POD)是一類結(jié)構(gòu)相似、功能相同的酶，它們是通過(guò)二電子還原過(guò)程對(duì)底物H2O2進(jìn)行催化。同時(shí)POD還可以催化其它有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的過(guò)氧化物[4]。按照酶催化中心結(jié)構(gòu)的差異性，可將過(guò)氧化物酶模擬酶分為以含金屬卟啉為活性中心的卟啉絡(luò)合物模擬酶和納米材料模擬酶兩類[5-12]。

2 含金屬卟啉結(jié)構(gòu)的過(guò)氧化物酶模擬酶

過(guò)氧化氫測(cè)定(H2O2)是在臨床診斷中具有重要的意義。許多生理重要指標(biāo)(例如葡萄糖、尿酸、膽固醇等)的分析方法均與相應(yīng)的過(guò)氧化氫化學(xué)量的形成相關(guān)，并依過(guò)氧化氫化學(xué)量進(jìn)行計(jì)算。測(cè)量過(guò)氧化氫的最常見(jiàn)的方法依賴于過(guò)氧化氫的氧化作用，通過(guò)過(guò)氧化物酶(通常是辣根過(guò)氧化物酶，HRP)催化生產(chǎn)的有色物質(zhì)用于檢測(cè)光或電性能的變化[13]。 HRP作為生物催化劑具有較高的底物特異性和在溫和的條件下的高效率等優(yōu)點(diǎn)。但是，作為天然酶HRP是不穩(wěn)定的，在某些條件下很容易變性(例如，在強(qiáng)酸性和堿性條件下，高溫)或通過(guò)蛋白酶消化。此外多，制備，純化和天然酶的存儲(chǔ)通常費(fèi)時(shí)并且昂貴。為了克服生物催化劑的穩(wěn)定性和成本問(wèn)題，人們作出了努力的探索。目前已經(jīng)研究的過(guò)氧化物酶模擬物的候選者有血紅素[14,15]，卟啉[16]，分子印跡聚合物[17,18]，脫氧核酶[19,20]，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明已可部分或完全替代HRP。

HRP存所有含血紅素的蛋白質(zhì)中，它是第一個(gè)以酶活性形式被重新構(gòu)建的酶[21]。Howes等研究了血紅素氨基酸替代實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)替換血紅素的蛋白質(zhì)構(gòu)型是影響蛋白活性的重要因素[22,23]。

血紅素(Heme)是由原卟啉 (Protoporphyrin)和鐵離子所形成的配合物，具有重要的生理功能。以血紅素為輔基的蛋白稱為血紅素蛋白( Hemoproteins)，它是一類以血紅素為輔基的金屬蛋白質(zhì)的總稱，它由原卟啉與Fe2+離子組成，可完成一系列的催化反應(yīng)，包括從電荷遷移、小分子轉(zhuǎn)運(yùn)，到氧化還原反應(yīng)等[24,25]。因此，血紅素和卟啉結(jié)構(gòu)的無(wú)機(jī)模擬酶得到了廣泛的研究[26-28]。

黃應(yīng)平等[26]通過(guò)對(duì)血紅蛋白進(jìn)行研究，他們通過(guò)血紅蛋白對(duì)H2O2-4-AAP-氯代苯酚顯色體系的催化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證明，血紅蛋白測(cè)定H2O2具有高的較靈敏度，具有過(guò)氧化物模擬酶的功能。其實(shí)驗(yàn)測(cè)定H2O2濃度為1.12×10-5mmol/L時(shí)的重復(fù)性為2.1%。用血紅蛋白作為模擬酶替代過(guò)氧化物酶，與葡萄糖氧化酶組成偶聯(lián)催化反應(yīng)體系試劑，完成了對(duì)人血清中葡萄糖含量的測(cè)定，在葡萄糖濃度為5.44-11.0 mmol/L間的回收率為98%-106%。

席永清等[27]采用血紅蛋白作為模擬酶，以L-酪氨酸(L-Tyr)作為熒光底物，組成葡萄糖氧化酶組成偶聯(lián)催化反應(yīng)體系試劑，建立了一種新的測(cè)定果蔬中葡萄糖濃度的方法。H2O2濃度在6.3×10-5～3.1×10-1mmol/L范圍內(nèi)成線性，對(duì)濃度為3.16×10-3mmol/L H2O2進(jìn)行平行測(cè)定，精密度 (n=9) 3.83%。

由于酞菁類化合物母體具有與卟啉類似的結(jié)構(gòu)，因此它也具有過(guò)氧化物酶的功能。陳秋影等[28]對(duì)四磺基鐵酞菁(FeTSPc)作為過(guò)氧化物模擬酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究，他們以FeTSPc作為模擬酶，催化H2O2與L-酪氨酸的反應(yīng)，建立了測(cè)定H2O2和葡萄糖的酶動(dòng)力學(xué)方法。對(duì)人血清中葡萄糖的含量進(jìn)行了測(cè)定。他們將正常人葡萄糖濃度為3.9和5.5 mmol/L的血清稀釋10 000倍后進(jìn)行了測(cè)定，其回收率為94%-104.2%。平行6次測(cè)定的日內(nèi)CV值分別為4.7%和5.0%。

韓愛(ài)霞等[29]采用肌紅蛋白作為過(guò)氧化物酶模擬酶光度測(cè)定血液中葡萄糖，取得較好效果。肌紅蛋白(Mb)是一種小分子蛋白質(zhì)，價(jià)格POD低廉，可在較溫和條件下實(shí)驗(yàn)。將肌紅蛋白作為過(guò)氧化物酶模擬酶，催化過(guò)氧化氫氧化偶聯(lián)還原型色原N-乙基-N- (2-羥基-3-磺酸基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)和4-氨基安替比林(AAP)顯色反應(yīng)，可應(yīng)用于過(guò)氧化氫的測(cè)定。該體系與葡萄糖氧化酶(COD)催化體系偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了血液中葡萄糖含量的測(cè)定。在最佳條件下，過(guò)氧化氫的線性范圍為0～5×10-5mol/L；葡萄糖測(cè)定的線性范圍為1-17 mmol/L。將本法應(yīng)用在血清葡萄糖測(cè)定中，回收率平均達(dá)到96.4%。

3 納米材料模擬酶

納米級(jí)結(jié)構(gòu)材料簡(jiǎn)稱為納米材料，廣義上是指三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍超精細(xì)顆粒材料的總稱。根據(jù)2011年10月18日歐盟委員會(huì)通過(guò)的定義，納米材料是一種由基本顆粒組成的粉狀或團(tuán)塊狀天然或人工材料，這一基本顆粒的一個(gè)或多個(gè)三維尺寸在1納米至100納米之間，而且納米顆粒的總數(shù)量應(yīng)占整個(gè)顆?？倲?shù)中50%以上。納米材料由于尺寸效應(yīng)、比表面積大,表面活化中心多使物質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生了改變。

納米材料作為過(guò)氧化物酶模擬物的候選物質(zhì)，最近一直引發(fā)人們的極大研究興趣。自從2007年閻錫蘊(yùn)院士等首先發(fā)現(xiàn)Fe3O4磁性納米微粒(NPS)材料具有類似辣根過(guò)氧化物酶的催化特性以來(lái)[30]，隨繼其他的一些納米材料，包括黃金納米粒子[31,32]、硫化亞鐵納米片[33]、磁性鐵酸鈷納米顆粒[34]、氧化銅納米粒子[35]、四氧化三鈷納米顆粒[36]、碳納米材料[37,38]、多金屬氧酸鹽[39]、和RuO2NPs[40]均已發(fā)現(xiàn)具有過(guò)氧化物酶樣活性。納米材料作為過(guò)氧化物酶模擬物具有成本低，易于制備和高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境應(yīng)用[41,42]許多潛在的應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。

閻錫蘊(yùn)課題組2007年發(fā)現(xiàn)了磁性四氧化三鐵納米粒子(Fe3O4NPs)具有POD的催化活性,可完成對(duì)H2O2與3.3′,5.5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、重氮胺基苯(DAB)等催化反應(yīng),并生成相同的反應(yīng)產(chǎn)物,顯現(xiàn)出具有與辣根過(guò)氧化物酶相類似的催化功能。他們利用Fe3O4MNPs的這一特性，催化過(guò)氧化物酶底物2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)，建立了一個(gè)測(cè)定H2O2的比色方法。測(cè)定下限為3×10-3mmol/L，線性范圍5×10-3～1×10-1mmol/L。進(jìn)一步證實(shí)了Fe3O4MNPs具有過(guò)氧化物酶樣活性[43]。

唐雨榕等[7]采用聚丙烯酸修飾的NaYF4:Yb,Er納米粒子催化H2O2氧化TMB產(chǎn)生顯色反應(yīng)，應(yīng)用于尿酸檢測(cè),顯現(xiàn)出過(guò)氧化物模擬酶良好的催化活性。他們以TMB為研究底物，觀察了不同溫度和pH值對(duì)模擬酶活性的影響，并根據(jù)尿酸在尿酸氧化酶催化作用下產(chǎn)生H2O2的原理，將NaYF4:Yb,Er納米粒子和尿酸氧化酶組成酶偶聯(lián)試劑，建立了血尿酸濃度的比色法測(cè)定方法。在優(yōu)化的條件下，血尿酸檢測(cè)范圍為1.0×10-2～2.0×10-1mmol/L，檢出限為5.3×10-3mmol/L，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與臨床結(jié)果一致。

Su等[6]亦觀察到MFe2O4(M =鎂，鎳，銅)的磁性納米顆粒有類似過(guò)氧化物酶的催化活性。MFe2O4不僅能催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基氧化過(guò)氧化物酶底物產(chǎn)生顏色。他們利用鎳鐵磁性納米粒子作模擬酶檢測(cè)了葡萄糖濃度，檢測(cè)范圍為9.4×10-4～2.5×10-2mmol/L，檢出限為4.5×10-4mmol/L，并對(duì)尿樣中的葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)。

Jiang等[44]發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用的貴金屬納米團(tuán)簇得到了學(xué)者們的重視。他們報(bào)道了去鐵鐵蛋白配對(duì)的金簇(Au-Ft)能有效地通過(guò)催化H2O2而使TMB氧化，產(chǎn)生藍(lán)色的顯色反應(yīng)。與天然酶相比，Au-Ft表現(xiàn)出更高的活性和pH、溫度范圍，催化的反應(yīng)遵循典型的米氏動(dòng)力學(xué)。由Au-Ft動(dòng)力學(xué)參數(shù)表現(xiàn)出較低的Km值(0.097 mM)，用于TMB氧化中比活性超過(guò)比HRP。他們根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，將Au-Ft作為過(guò)氧化物模擬酶，進(jìn)行了葡萄糖的酶分光光度分析。該系統(tǒng)表現(xiàn)出可接受的重復(fù)性和高特異性。

Wang X X等[45]實(shí)驗(yàn)證明了牛血清白蛋白(BSA)穩(wěn)定的金團(tuán)簇具有高度的過(guò)氧化物酶樣活性。與自然酶相比較，BSA金團(tuán)簇具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性性，可以在很寬范圍內(nèi)的pH值和溫度中應(yīng)用。由于體積小，穩(wěn)定性好，在水溶液中比其他種類的納米粒子(如Fe3O4、FeS、氧化石墨烯等)作為過(guò)氧化物酶的模擬物有較高生物相容性，更適合生物分析。此外，他們利用BSA金團(tuán)簇作為過(guò)氧化物酶模擬物檢測(cè)了H2O2。他們所制備的BSA金團(tuán)簇催化過(guò)氧化物酶底物，使無(wú)色3.3′,5.5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)3,3,5,5-tetramethylbenzidine(TMB)H2O2的氧化成顯色的產(chǎn)品，并建立一個(gè)H2O2的比色檢測(cè)方法。通過(guò)這種方法檢測(cè)H2O2濃度最低可達(dá)2×10-8M，檢測(cè)的線性范圍從5×10-7到2×10-5M。更重要的是，開(kāi)發(fā)和制備的BSA金團(tuán)簇與黃嘌呤氧化酶(XOD)偶聯(lián)，可建立一個(gè)敏感的和有選擇性的黃嘌呤檢測(cè)方法。黃嘌呤對(duì)這種檢測(cè)方法的檢出限為5×10-7M，該方法已成功地應(yīng)用于尿液和人血清樣品的測(cè)定黃嘌呤。

Caiping Ding等[46]制備的鐵磁性納米粒子(Fe3S4MNPS)顯示了過(guò)氧化物酶樣活性。動(dòng)力學(xué)研究表明，其酶活性比其他磁性納米材料為基礎(chǔ)的模擬酶高很多。他們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)測(cè)定葡萄糖的光度分析法，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下形成過(guò)氧化氫，在Fe3S4MNPS作用下酶底物形成一個(gè)藍(lán)色的產(chǎn)物。葡萄糖可在2至100 μM的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)，檢出限為0.16 μM，并應(yīng)用于人血清中葡萄糖定量分析。這種模擬酶有很大的潛力，因?yàn)樗梢詰?yīng)用在其他氧化酶法中，而且在ELISA試劑盒中。

雙抗夾心ELISA法是最常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，其檢測(cè)基礎(chǔ)原理是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)。HRP標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。加入HRP標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的HRP量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入HRP反應(yīng)的底物后即會(huì)產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過(guò)比色法就可以測(cè)得所測(cè)定物質(zhì)的含量，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于HRP的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到較高的敏感度。

HRP是ELISA免疫檢測(cè)法中常用的工具酶． 但它作為一種天然酶，具有蛋白質(zhì)的特性，易變性、不易儲(chǔ)存和運(yùn)輸、使用成本較高。

Sushma Kumari等[47]采用縮二脲改性四酰胺鐵大環(huán)配體(Fe-TAML)，合成一個(gè)非常強(qiáng)大的小分子HRP模擬酶，它的功能與反應(yīng)速率與天然酶的HRP在水非常中接近，穩(wěn)定性(pH，離子強(qiáng)度)遠(yuǎn)超過(guò)天然酶。這種混合材料的催化活性約是天然HRP 1000倍，比迄今為止報(bào)道金屬/金屬氧化物納米顆粒HRP的模擬物高100倍。實(shí)驗(yàn)表明，使用這種混合材料的標(biāo)記抗體是可在ELISA類型的測(cè)定法中進(jìn)行檢測(cè)，最重要的是，其蛋白質(zhì)可以檢測(cè)到fmol水平。這代表它至少高10倍于已使用的作為HRP的模擬物報(bào)道金屬/金屬氧化物納米粒子，有較其它比色蛋白測(cè)定法更高的靈敏度。

普魯士藍(lán)(PB)Fe4[Fe(CN)6]3，作為第一代氧化酶電化學(xué)生物傳感器由于其優(yōu)異的電化學(xué)行為和良好的催化性能已被廣泛研究。然而，近年研究顯示納米普魯士藍(lán)作為過(guò)氧化物酶模擬物正受到關(guān)注。

Zhang W等[48]報(bào)告的普魯士藍(lán)納米粒子(Pb納米)具有催化活性的過(guò)氧化氫(H2O2)的功能，與H2O2親和力強(qiáng)，可使過(guò)氧化物酶底物2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)產(chǎn)生的著色產(chǎn)品。用PB納米粒子作為過(guò)氧化物酶模擬物，比色法可測(cè)定濃度在0.05-50.0 μM范圍的 H2O2，檢測(cè)限為0.031 μM。在葡萄糖溶液中通過(guò)葡萄糖氧化酶催化氧化反應(yīng)，偶聯(lián)過(guò)氧化物酶模擬物實(shí)現(xiàn)了靈敏的檢測(cè)葡萄糖濃度的比色法。葡萄糖的檢測(cè)限為低至0.03 μM，線性范圍為0.1-50 Μm，此方法已成功地應(yīng)用于人血清中葡萄糖含量的測(cè)定。與過(guò)氧化物酶模擬物其他納米材料相比，在H2O2和葡萄糖的檢測(cè)中，PB NPS可提供10-100倍或更高的靈敏度。檢測(cè)平臺(tái)開(kāi)發(fā)的重要性表現(xiàn)在醫(yī)學(xué)診斷中的巨大的應(yīng)用潛力。

4 小結(jié)

模擬酶由于具有價(jià)值便宜、不易失活、無(wú)需輔助因子等優(yōu)點(diǎn)，使其成為近期的研究熱點(diǎn)。雖然還處在應(yīng)用的初始期，尚有許多理論問(wèn)題待闡明，相信隨著實(shí)際應(yīng)用中技術(shù)和方法的改進(jìn)以及科學(xué)理論的完善，過(guò)氧化物模擬酶將在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有非常廣闊的應(yīng)用。

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1007-4287(2016)11-1970-05

侯玥(1988-)，女，博士，講師,主要從事生物技術(shù)與理論方面的研究工作;于源華(1962-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院院長(zhǎng),研究方向:生物分析與檢測(cè),生物納米材料。

2016-01-19)