卵巢癌抗原沖擊DC在體外對SKOV3細胞作用的研究

盛敏佳，薛麗娟，王立巖*，郝筱詩，劉玉萍

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學第一臨床醫(yī)院)

?

*通訊作者

卵巢癌抗原沖擊DC在體外對SKOV3細胞作用的研究

盛敏佳1，薛麗娟2，王立巖1*，郝筱詩1，劉玉萍1

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學第一臨床醫(yī)院)

目的 探討卵巢癌患者外周血和腹水中培養(yǎng)的樹突細胞(DC)在體外激活淋巴細胞產(chǎn)生的腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)作用，及其對卵巢癌SKOV3細胞的殺傷作用。方法 分別培養(yǎng)卵巢癌患者外周血及腹水來源DC，進行細胞形態(tài)學觀察及細胞表面分子表達檢測；以卵巢癌凍融抗原致敏DC，檢測兩種來源DC刺激T淋巴細胞增殖的能力及對IL-2水平的影響；檢測抗原負載DC與T細胞誘導CTL對卵巢癌細胞的殺傷作用。結果 鏡下顯示卵巢癌患者外周血及腹水來源的DC形態(tài)學無明顯差異，腹水來源DC成熟時間較外周血來源DC晚，二者表面分子表達的陽性率除CD83外無明顯差異；卵巢癌凍融抗原負載DC上調其表面相關分化抗原表達，統(tǒng)計學差異具有顯著性(P<0.05)；經(jīng)卵巢癌凍融抗原負載后的DC刺激T淋巴細胞的增殖，差異有顯著性(P<0.05)，但兩種來源DC間刺激指數(shù)無統(tǒng)計學差異；抗原負載DC與無抗原負載DC相比，其上清中IL-12濃度增高，差異具有顯著性(P<0.05)；負載與不負載抗原的DC對卵巢癌細胞殺傷作用增強，與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，隨著效應細胞數(shù)量的增高，殺傷作用增強，加入IL-2增強其殺傷作用，但外周血及腹水來源DC間相應情況下對卵巢癌細胞的殺傷作用無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結論 卵巢癌患者外周血及腹水來源的DC均具有誘導CTL作用，DC作為載體負載腫瘤抗原后可以激發(fā)T淋巴細胞形成CTL，在體外有效的殺傷卵巢癌SKOV3細胞。

卵巢癌；樹突細胞；細胞毒T淋巴細胞；白細胞介素-2；殺傷作用

(ChinJLabDiagn,2016,20:1811)

卵巢癌是婦科惡性腫瘤患者死亡的首要原因之一，5年生存率較低，近年來生物治療成為卵巢癌患者治療的重要手段。樹突狀細胞(DC)在抗原提呈及激活淋巴細胞使其成為腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)方面起著重要作用。目前研究證實，DC可由外周血單核細胞及腹水中的單核細胞等多種細胞誘導而來[1-3]。本研究分別從卵巢癌患者外周血和腹水中培養(yǎng)DC，觀察體外激活淋巴細胞產(chǎn)生CTL及CTL在體外對卵巢癌SKOV3細胞的殺傷作用，同時對比加入IL-2后對卵巢癌細胞殺傷作用，為卵巢癌的生物治療研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人白細胞成分血 健康人抗凝靜脈血制備的濃縮白細胞成分血標本來自長春市中心血站健康獻血者共10份，每份50 ml，年齡20-45歲，均在獻血后2 h行外周血單核細胞分離。

1.1.2 卵巢癌患者腹水及血液標本 6份晚期卵巢癌腹水2 000 ml取自吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院的確診的住院患者，在術前診斷性腹穿或術中無菌收集，采集前均未進行放化療，離心后分離單核細胞。同時采50 ml外周抗凝靜脈血，用于分離淋巴細胞。

1.1.3 其他試劑 IMDM，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco提供)；rhIL-1，rhIL-4， rhIL-2(北京軍科院四所)；rhGM-CSF(長春金賽藥業(yè))；TNF-a(美國Coring)；無關系細胞(COS，蘇州醫(yī)學院免疫室提供)；人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3(上海細胞研究所)；淋巴細胞分離液(上海生化二廠生產(chǎn))；FITC標記的鼠抗人CD1a，DC83，IgG1單克隆抗體，PE標記的鼠抗人CD86，CD80單克隆抗體及APC標記的HLA-DR單克隆抗體(深圳晶美公司提供)；MTT及DMSO (Sigma 公司)；IL-12ELISA檢測試劑盒購自R&D公司。

1.1.4 儀器設備 低溫冰箱(日本日立公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(日本平澤公司)；高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；流式細胞儀(美國 Coulter 公司ELITE-Ⅱ型號)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國索林公司ELX800型號)；電子天平(日本島津公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 DC 的體外誘導

①人外周血單核細胞(PBMC)的分離 取健康人抗凝靜脈血制備濃縮白細胞，離心1 000 r·min-1，5 min后去除血漿，用pH7.2的D-Hank’s液稀釋1倍后混勻；按1∶2加入淋巴細胞分層液(Ficoll)2 000 r·min-1離心20 min；吸取單個核細胞層至離心管中，加入約5倍體積的pH7.2的含1%FCS的D-Hank’s液，混勻，1 500 r·min-1離心1 000 r·min-1，8 min，棄上清；重復后加入1%FCS-D-Hank’s 液混勻。臺酚藍記數(shù)細胞，用無血清-IMDM 重懸細胞。

②外周血DC[DC(P)]的體外培養(yǎng) 調整上述重懸細胞濃度為2×106/ml，加入24孔板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；收集懸浮細胞備用；以無血清IMDM 清洗培養(yǎng)板兩次；加入10%FCS-IMDM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中過夜；去掉無血清IMDM，加入10%FCS-IMDM,GM-CSF 200 ng/ml,IL-450 ng/ml,3天后進行半量換液,加入帶有細胞因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天后收集未成熟DC，3天半量換液一次；自第7天開始換成帶有 rhTNF-α10 ng/ml、rhGM-CSF 200 ng·ml-1的培養(yǎng)基,3天半量換液，第11-14天收獲成熟的DC(mDC)。

③卵巢癌患者腹水來源的DC(A)的培養(yǎng) 取卵巢癌患者腹水2 000 ml以2 000 r/min離心10 min后棄上清，Hanks液重懸細胞，置于Ficoll溶液上，2 000 r/min，離心15分鐘，吸取單核細胞層，培養(yǎng)基重懸細胞后計數(shù)，置于24孔培養(yǎng)板中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，收集貼壁細胞，獲得了腹水中的單核細胞。腹水中DC的培養(yǎng)同血中DC的培養(yǎng)過程。

④分離卵巢癌患者外周血T淋巴細胞 取卵巢癌患者抗凝靜脈血50 ml(20 U/ml 肝素抗凝)，Hanks適量稀釋，按1∶2加入淋巴細胞分層液(Ficoll)稀釋血液2 000 rpm，離心20 min，吸取界面灰白單核細胞層T細胞，以2%胎牛血清的PBS液懸浮細胞，離心1 000 rpm，5 min，洗滌2次，獲得富集純化的自體T淋巴細胞備用。

1.2.2 DC 形態(tài)學觀察

用倒置顯微鏡每日觀察細胞的大小、形態(tài)及生長狀況；用PE-CD83、FITC-HLA-DR、CD80、CD86、CD1a處理DCs,，觀察成熟DCs表面表達的熒光強度。

1.2.3 流式細胞術(FCM)檢測樹突細胞表型 取培養(yǎng)5-7 d未成熟DC(iDC)和11-14dmDC，0.02%EDTA，37℃消化30 min，收集細胞并制備成濃度4×105/ml的細胞懸液；用PBS洗滌細胞2次；稀釋為200 μl，加入熒光標記的5 μl FITC標記的鼠抗人CD1a，DC83，IgG1單克隆抗體，PE標記的鼠抗人CD86，CD80單克隆抗體及APC標記的HLA-DR單克隆抗體，4℃孵育30 min； PBS洗滌細胞，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清液；加入0.5 ml pH7.4 PBS后重懸細胞。

1.2.4 SKOV3卵巢癌凍融抗原的制備 取對數(shù)生長期SKOV3細胞，調整密度為2×107/ml,置于液氮中10 min,迅速放入100℃水浴,反復凍融3次。600 g離心20 min,收集上清,13 000 g離心1 h。經(jīng)微孔濾膜過濾后作為可溶性卵巢癌凍融抗原,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 致敏DC 分別取培養(yǎng)6天的DC(P)及DC(A)(1×105/ml)， 每孔加入腫瘤細胞抗原凍融液0.1 ml，DC與抗原比例為1∶5，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.2.6 同種異體混合淋巴細胞反應(MLR) MLR反應分為4組,第1組按上述常規(guī)方法培養(yǎng)6 d的DC,第2組為DC+T淋巴細胞,第3組為在培養(yǎng)至第6天時加入經(jīng)SKOV3卵巢癌凍融抗原致敏的DC+T淋巴細胞,第4組為在培養(yǎng)至第6天時加入經(jīng)SKOV3卵巢癌凍融抗原致敏的DC+IL-2+T淋巴細胞。在經(jīng)紫外線處理后的96孔板中,分別加入1×104,2×103,1×103/L的樹突狀細胞懸液,以自身T淋巴細胞作為對照,每孔設 3 個復孔,分別加入T淋巴細胞1×105/孔,配成樹突狀細胞∶T細胞分別為1∶10,1∶50,1∶100 的比例,終體積為 200 μl,CO2培養(yǎng)箱中孵育90 h后,MTT法在酶標儀上測570 nm波長的OD值。計算刺激指數(shù)(SI)=實驗孔OD平均值/對照孔OD平均值。

1.2.7 IL-12檢測 收集DC上清,ELISA法定量檢測IL-12含量,具體步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.8 抗原負載DC激活CTL的細胞毒作用

①靶細胞制備 復蘇SKOV3卵巢癌細胞株，用 IMDM 培養(yǎng)基清洗細胞，1 000 r·min-1，離心5 min；將腫瘤細胞以1×106/ml 濃度接種于含10%FCS-IMDM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2-3 d 換液一次；收集對數(shù)生長期的細胞，用 PBS 洗滌細胞，1 000 r·min-1離心5 min，計數(shù)細胞，用10%FCS-IMDM培養(yǎng)基重懸細胞；調整細胞密度為104/ml，接種于 96 孔板，每孔200 μl 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。

②DC致敏抗原特異性CTL的活性檢測 將致敏DCs與T細胞按1∶10的比例,加入/不加入IL-2(40 U·ml-1)共孵育為效應細胞，調整細胞密度為2×105/ml，加入SKOV3靶細胞密度為104/ml，使效靶比為20∶1，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2天；分組：實驗組1：SKOV3細胞凍融抗原負載 DC(P) 誘導 CTL 殺傷SKOV3細胞組;實驗組2:SKOV3細胞凍融抗原負載 DC(P) 誘導 CTL +IL-2殺傷SKOV3細胞組;實驗組3:SKOV3細胞凍融抗原負載 DC(A) 誘導 CTL殺傷SKOV3細胞組;實驗組4:SKOV3細胞凍融抗原負載 DC(A) 誘導 CTL +IL-2殺傷SKOV3細胞組;實驗組5:SKOV3細胞凍融抗原負載 DC(P) 誘導 CTL殺傷COS細胞組;實驗組6:SKOV3細胞凍融抗原負載 DC(A) 誘導 CTL殺傷COS細胞組;陰性對照組：未負載凍融抗原DC誘導CTL殺傷SKOV3細胞組；空白對照組：SKOV3腫瘤細胞組。

③檢測前4 h，每孔加入MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h后，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，每孔加入DMSO 100 μl，室溫振蕩10 min,酶標儀 490 nm 處測各孔光密度(OD)值，計算殺傷率。殺傷率(%)=[1-(實驗孔 OD-陰性對照孔 OD)/對照 OD]×100%。

1.2.9 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)應用 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件處理，應用t檢驗、方差分析，P<0.05 為有顯著差異性，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DC形態(tài)學觀察

2.1.1 體外誘導DC形態(tài)觀察 外周血單個核細胞粘附培養(yǎng)2 h后，分離出圓形貼壁細胞，主要為單核細胞。過夜培養(yǎng)后有部分細胞懸浮，多為殘留的B細胞、T細胞及外周血樹突狀細胞，將懸浮細胞去除，獲得較純的單核細胞；加入GM-CSF、IL-4 培養(yǎng)72 h，呈半懸浮狀態(tài)的細胞開始增多，但細胞表面未見明顯突起；培養(yǎng)3天后細胞表面伸出毛刺樣突起，細胞數(shù)目增多，體積增大；培養(yǎng)7天后，細胞貼壁生長，分布較均勻，大小為成熟單核細胞的1-1.5倍，可見典型的樹突狀突起(圖1)。外周血來源的DC(P)，體外培養(yǎng)5-6天表現(xiàn)為懸浮叢狀生長，體積增大，表現(xiàn)為樹突狀外形，腹水來源的DC(A)較外周血來源的DC晚1-2天，但顯微鏡下未見明顯差別。如圖1、2。

2.1.2 抗原負載DC形態(tài)觀察 與未負載抗原組DC相比，細胞多為懸浮生長，呈圓形、細胞突起變少。(圖2)

2.1.3 與T細胞共培養(yǎng)DC形態(tài)觀察 加入淋巴細胞共培養(yǎng)2-3天，細胞增大，細胞突起增多，淋巴細胞成簇狀分布在DC周圍生長。

圖1 外周血來源的DC細胞 圖2 腹水來源的DC細胞

2.1.4 熒光顯微鏡下所見成熟DCs表面表達 HLA-DR的熒光強度高，其次為CD80及CD86，其他均較弱，僅見到細胞輪廓。

2.2 FCM 檢測DC細胞表型特點外周血來源DC[DC(P)]及腹腔水來源DC[DC(A)]經(jīng)流式細胞計進行表型鑒定，7天和14天時兩種來源DC表面分子表達的陽性率無明顯差異(見圖3)，但CD83在第14天時的表達明顯高于第7天，具有統(tǒng)計學意義。

結果顯示抗原負載能增強表面分子的表達。培養(yǎng)7天時，與無抗原負載的DC相比,經(jīng)卵巢癌凍融抗原負載后能上調各種DC相關分化抗原表達(見表1)，統(tǒng)計學差異具有顯著性(P<0.05)。

圖3 DC細胞表面分子的表達

DC(P)DC(P)+AgDC(A)(%)DC(A)+Ag培養(yǎng)第7天CD1a61.32±5.4171.89±3.0163.31±4.3174.32±4.15CD8039.12±4.7983.45±2.9843.24±3.6485.46±3.12CD8318.37±0.9874.00±7.8620.56±1.2576.25±6.95HLA-DR86.67±6.8995.65±3.7583.28±7.6594.74±3.28

2.3 同種異體混合淋巴細胞反應(MLR) 在效靶比分別為1∶10、1∶50、1∶100的條件下，與無抗原負載的DC相比,經(jīng)卵巢癌凍融抗原負載后的DC可強烈激發(fā)自身淋巴細胞的增殖，刺激指數(shù)SI分別是外周血來源DC(P):42.12±6.56 vs 17.98±4.72、22.87±5.67 vs 12.16±3.57、13.67±3.84 vs 6.27±3.52；腹水來源DC(A)：39.72±5.16 vs 15.23±3.24、20.65±4.33 vs 10.76±2.98、11.87±2.58 vs 5.64±2.59,差異均有顯著性(n=4,P<0.05)。不同來源DC間相應各比例的刺激指數(shù)無統(tǒng)計學意義。

2.4 IL-12檢測 如圖4所示，第7天加入卵巢抗原致敏DC與無抗原致敏DC相比，其上清中IL-12濃度明顯增高，分別為77.125.89 pg/ml vs 20.553.44，經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異具有顯著性(n=3,P=0.0001)。

圖4 DC細胞分泌IL-12水平

2.5 DC負載卵巢癌抗原激發(fā)T淋巴細胞特異性免疫殺傷作用如圖5所示，經(jīng)人卵巢癌細胞SKOV3凍融抗原負載DC激活的CTL在體外對SKOV3的殺傷能力增強，當CTL與SKOV3共培養(yǎng)24 h后SKOV3的死亡率與未經(jīng)抗原負載DC誘導的CTL對SKOV3的殺傷率相比較，負載與不負載抗原的殺傷能力與對照組相比具有顯著性差異(n=4,P=0.0001)，但不同DC間相應情況下的殺傷能力無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖5 DC負載卵巢癌細胞激發(fā)T淋巴細胞特異性細胞毒作用

兩組來源的DC經(jīng)卵巢細胞凍融癌抗原負載后誘導CTL細胞對卵巢癌細胞系SKOV3具有特異性殺傷作用，隨著效應細胞數(shù)量的增高(50∶1，100∶1)，負載卵巢癌抗原的DC能誘導出CTL細胞對卵巢癌細胞系SKOV3呈最強的細胞毒殺傷率(分別為DC(P)：89.23±5.45%，81.51 ±4.67%與DC(A)：86.47±6.12%,78.49±3.89%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義，且兩種來源的DC負載卵巢癌抗原后加入IL-2誘導出CTL細胞對卵巢癌細胞的殺傷作用更強(分別為DC(P)：92.23±5.2%，89.21±6.1%與DC(A)：90.14±6.25%，85.43±7.46%)。且與各自對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，而兩種DC間各組的殺傷作用無顯著性性差別(P>0.05)。

3 討論

卵巢上皮癌大部分患者發(fā)現(xiàn)即為晚期，5年生存率低。近年來隨著大量腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)，以腫瘤疫苗為基礎的主動免疫治療和T淋巴細胞介導的抗腫瘤細胞免疫應答已成為抗腫瘤治療新的熱點。樹突狀細胞(DC)是功能最強的專職性抗原遞呈細胞APC。大量的研究表明，通過不同形式的腫瘤抗原致敏的DC體內(nèi)注射后可誘導出特異性的抗腫瘤免疫應答，證明DC免疫療法具有的抗腫瘤治療效果。本研究從卵巢癌腹水中提取單核細胞作為DC的來源，并與外周血單核細胞來源的DC比較，結果顯示：兩種來源的DC在外形特征上未見差別，且兩種來源DC表面免疫分子表型(DC1a,DC80,DC86)表達的陽性率無明顯差異。但腹水來源的DC比外周血來源的DC晚成熟1-2天，推測腹水中的單核細胞所處的環(huán)境中免疫抑制因子多于外周血中的因子種類及含量，導致腹水中的單核細胞對GM-CSF及IL-4反應遲緩，但在比較DC刺激淋巴細胞功能時，兩組不同來源的DC沒有差別。故認為腹水來源的DC雖然發(fā)育較慢，但在體外培養(yǎng)12天后仍具有成熟DC遞呈抗原及刺激淋巴細胞的功能。

DC依賴于獨特的抗原遞呈功能及免疫佐劑功能誘導高效而特異的抗腫瘤免疫，而DC前體及成熟DC各具特點。DC前體即未成熟DC識別、攝取、加工處理抗原的能力強，刺激幼稚T細胞的能力弱，而成熟DC的功能則與其相反。本研究在DC未成熟階段與腫瘤抗原共同培養(yǎng)，保證腫瘤抗原的有效攝取、加工。而DC成熟后吞噬腫瘤抗原， DC高表達共刺激分子及其他黏附分子，可提呈抗原并誘導T細胞增殖為抗原特異性的CTL，誘導出高效而特異的抗腫瘤免疫[4,5]。

DC作為載體負載腫瘤抗原后可以激發(fā)機體有效的抗腫瘤免疫反應，同時亦可在體外激發(fā)T淋巴細胞形成CTL細胞，有效的殺傷腫瘤細胞。腫瘤相關抗原不易得到，目前多用腫瘤細胞裂解產(chǎn)物、腫瘤抗原多肽、合成的MHC-1限制性多肽等負載DC及通過遺傳工程傳導腫瘤相關抗原或細胞因子的DC[6-8]。但上述方法存在著抗原提呈效果不佳及技術上的困難等缺點。應用卵巢癌細胞反復凍融后的溶解物沖擊DC，即可誘導出已知和未確定的腫瘤相關抗原，引起特異性抗腫瘤免疫反應[9]。Li[10]等研究顯示，卵巢癌患者外周血起源的DC在其自身熱休克蛋白反復刺激下，能明顯的誘導T淋巴細胞的增殖和毒性。腫瘤細胞提取物負載的DC疫苗可以明顯誘導機體產(chǎn)生保護性的免疫反應，并具有操作簡便、遞呈抗原效率高等優(yōu)點。本研究使用凍融細胞的方法使兩種來源的DC負載卵巢癌抗原，成功誘導出具有抗腫瘤特性的CTL，且腹水來源的DC和外周血來源的DC兩組比較差異無顯著性。本研究證實從卵巢癌腹水中分離單核細胞培養(yǎng)大量DC，為卵巢癌DC基礎免疫治療提供了新的細胞來源，為其臨床應用奠定了基礎，避免了體外對同一病人DC進行反復操作[11,12]。

國外最新研究證實來源于腹水中單核細胞的不成熟DC可誘導卵巢癌細胞凋亡，且該來源的DC與自身的卵巢癌細胞共同培養(yǎng)能夠誘導CTLs的增殖反應[13]。Chu[3]等人研究證實，從卵巢癌腹水中的巨噬細胞來源的DC(TAMS，可獲得成熟的和不成熟DC)與外周血單核細胞來的DC的表型及功能進行比較，兩種DCs在同種異體雜交的淋巴細胞反映中，有同樣的激活T淋巴細胞增殖的作用，而且呈遞腫瘤抗原的TAM來源的DCs通過腫瘤特異性T細胞系能激活γ-IFN，殺傷腫瘤細胞。卵巢癌患者TAMs可生成大量的DCs。因此，TAMs可用于外源性或內(nèi)源性DC免疫治療，特別是常規(guī)外周血單核細胞DCs來源耗竭的患者，與本研究結果及觀點一致。

IL-2具有較強的免疫調節(jié)、提高抗原對免疫系統(tǒng)的激活作用，具有正負反饋現(xiàn)象，即使少量的IL-2可引發(fā)強烈的免疫反應。本研究將IL-2加入到兩種來源的DC培養(yǎng)液中，可在腫瘤細胞局部產(chǎn)生較高濃度的細胞因子，并可維持較長時間，結果顯示IL-2具有顯著的激活特異性CTLs活性，兩組比較差異無顯著性。IL-12是各種抗原提呈細胞產(chǎn)生的細胞因子，他們在抗癌免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用[14]。Kim[15]等用葉酸蛋白的191-199肽段E39刺激DC，在細胞因子IL-2和IL-15的作用下將致敏的DC兩種細胞與卵巢癌患者的淋巴細胞在體外共同培養(yǎng)，能引起腫瘤特異性的CTL介導的抗瘤反應。兩種來源DC經(jīng)卵巢癌抗原負載后培養(yǎng)液上清中IL-12的含量均增加，且與各自對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。說明腫瘤抗原能增強白細胞介素12的分泌從而刺激DC的免疫力。國內(nèi)藍春燕[16]等的研究表明，卵巢癌外周血來源的DC刺激同種異體淋巴細胞增殖能力較健康婦女組低，提示卵巢癌患者來源的DC存在某種程度的免疫功能異常，影響抗原的遞呈作用，從而影響其抗腫瘤免疫應答。

綜上，DC疫苗在常規(guī)療法消除絕大部分腫瘤負荷后，作為一種輔助治療手段，能夠消滅殘余腫瘤細胞，增強機體抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤生長，防止腫瘤復發(fā)轉移，誘導T細胞免疫反應能夠殺滅殘余的腫瘤細胞等方面，有望成為難治性和常規(guī)治療后有殘留病灶的一種有效治療方法。DC在卵巢癌免疫治療的實驗和臨床應用研究中顯示了美好的前景。

[1]Syme R,Bajwa R,Robertson L,et al.Comparison of CD34 and monocyte-derived dendritic cells from mobilized peripheral bloodfrom cancer patients[J].Stem Cells，2005，23(1):74.

[2]Zou GM1,Tam YK.Cytokines in the generation and maturation of dendritic cells:recent advances[J].Eur Cytokine Netw,2002,13(2):186.

[3]Chu CS,Woo EY,Toll AJ,et al.Tumor associated macrophages as a source of functional dendritic cells in ovarian cancer patients[J].Clin Immunol，2002，102:291.

[4]Adams S,O'Neill DW,Bhardwaj N.Recent advances in dendritic cell biology[J].J Clin Immunol，2005 Mar，25(2):87.

[5]Zamarin D,Wolchok JD.Potentiation of immunomodulatory antibody therapy with oncolytic viruses for treatment of cancer[J].Mol Ther Oncolytics，2014，1:14004.

[6]Ojima T,Iwahashi M,Nakamura M,et al.The boosting effect of co-transduction with cytokine genes on cancer vaccine therapy using genetically modified dendritic cells expressing tumor-associated antigen[J].Int J Oncol，2006，28(4):947.

[7]Bloy N,Pol J,Aranda F,et al.Trial watch:Dendritic cell-based anticancer therapy[J].Oncoimmunology，2014，3(11):e963424.

[8]KleinC,Bueler,Mulligan R,Comparative analysis of genetically modified dendritic cells and tumor cells as therapeutic cancer vaccines[J].J Exp Med，2000,191(10):1699.

[9]Brossart P,Wirths S,Brugger W,et al.Dendritic cells in cancer vaccines[J].Exp Hematol，2001，29(11):1247.

[10]Li G,Zeng Y,Chen X,et al.Human ovarian tumour derived chaper one rich cell lysate elicitsT cell responses in vitro[J].Clin Exp Immunol，2007,148(1):136.

[11]Silveira GF,Wowk PF,Machado AM，et al.Immature dendritic cells generated from cryopreserved human onocytes show impaired ability to respond to LPS and to induce allogeneic lymphocyte proliferation[J].PLoS One，2013，8(7):e71291.doi:10.1371

[12]Lewalle P,RouasR,Lehmann F,et al.Freezing of dendritic cells,generated from cryopreserved leukaphereses,does not influence their ability to induce antigen-specific immune responses or functionally react to maturation stimli[J].Immunol Methods,2002,240:69.

[13]Krempski J,Karyampudi L,Behrens MD,et al.Tumor-infiltrating programmed death receptor-1+ dendritic cells mediate immune suppression inovarian cancer[J].J Immunol，2011，186(12):6905.

[14]Zhu EF,Gai SA,Opel CF,et al.Synergistic innate and adaptive immune response to combination immunotherapy with anti-tumor antigen antibodies and extended serum half-life IL-2[J].Cancer Cell，2015,27(4):489.

[15]Kim DK,Kim JH,Kim YT,et al.The comparison of cytotoxic T-lymphocyte effects of dendritic cells stimulated by the folate binding protein peptide with IL-15and IL-2in solid tumor[J].Yonsei Medical Journal,2003,43(6):691.

[16]藍春燕，劉繼紅，夏建川，等.卵巢癌患者外周血來源樹突狀細胞的生物學特征[J].癌癥,2009,28(2):161.

The effect of ovarian cancer antigen impacted DC on SKOV3 in vitro

SHENGMin-jia1,XUELi-juan2,WANGLi-yan1*,etal.

(1.ChinaJapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033，China;2.TheFirstHospitalofJilinUniversity)

Objective To study the effect of tumor specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) produced by the activation of lymphocytes from the peripheral blood and ascites of dendritic cells (DC) in ovarian cancer patients in vitro,and its killing role on ovarian cancer cell SKOV3.Methods Cultured DC from blood and ovarian cancer ascites,observed the cell morphology and detected the cell surface molecules expression;DC was pulsed by freeze-thaw ovarian cancer antigen,to detect T lymphocyte proliferation and IL-2 levels stimulated by two sources of DC;To detect killing roll of antigen load DC and T cells induce CTL for ovarian cancer cells.Results Microscopic display of peripheral blood and ascites derived DC morphology has no significant difference,maturation time of ascites source DC is later than peripheral blood DC;The positive rate of surface molecules expression has no significant difference except CD83;ovarian cancer lysates DC raised its surface associated antigen expression,the difference was statistically significant (P<0.05);The proliferation of T lymphocytes stimulated by ovarian cancer cell lysates DC was high,the difference was significant (P<0.05),but two sources of DC stimulation index has no significant difference;compared DC with antigen loaded,the DC without antigen loaded has supernatant IL-12 concentration increased,the difference was significant (P<0.05);Without loaded DC and with loaded DC antigen ovarian cancer killing effect enhanced as compared with the control group with significant difference (P<0.05);with the increasing number of cells,the killing effect after added IL-2 was enhanced,but the peripheral blood DC sources and ascites has no significant difference (P<0.05).Conclusion The DC from peripheral blood and ascites of ovarian cancer patients have the effect of inducing CTL.DC loaded tumor antigen as a carrier can stimulate T lymphocytes formed CTL,that has anti-ovarian cancer cell SKOV3 effect in vitro.

ovarian cancer;dendritic cells;cytotoxic T lymphocytes;interleukin-2;killing effect

1007-4287(2016)11-1811-06

R737.31

A

2016-02-15)