右美托咪定預(yù)處理對2型糖尿病大鼠缺血再灌注腦損傷的作用

王 鵬，單世民，郝 偉，任立潔

右美托咪定預(yù)處理對2型糖尿病大鼠缺血再灌注腦損傷的作用

王 鵬，單世民，郝 偉，任立潔

目的:探討右美托咪定預(yù)處理對2型糖尿病大鼠缺血再灌注腦損傷的影響及機(jī)制。方法：雄性SD大鼠60只建立2型糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組（I/R組）、右美托咪定組（D組），建立全腦缺血再灌注損傷模型。缺血前30 min D組靜脈輸注右美托咪定0.05 μg·kg-1·min-1，S組和I/R組靜脈輸注0.9%生理鹽水2 mL/h，持續(xù)輸注120 min。于缺血再灌注24 h對各組進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分（NDS評分），檢測腦組織含水量，腦組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶（CAT），血漿白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，以及腦組織凋亡細(xì)胞水平。結(jié)果:S組、I/ R組和D組NDS評分分別為4.25±3.15、45.56±8.59和23.00±8.83，D組顯著高于S組(t=8.00,P＜0.05)而低于I/R組(t=7.32,P＜0.05)；三組腦組織相對含水量分別為59.58±0.06、87.87±0.06和80.52±0.04，D組顯著高于S組(t=116.21,P＜0.05)而低于I/R組(t=40.76,P＜0.05)；三組MDA分別為0.89±0.13，2.67±0.52和1.85±0.51(nmol/mg)，D組顯著高于S組(t=7.29,P＜0.05)而低于I/R組(t=4.50,P＜0.05)；SOD分別為82.33±13.17、32.06±6.34和57.89±9.74(U/mg)，D組顯著低于S組(t=5.97,P＜0.05)而高于I/R組(t=8.89,P＜0.05)；CAT分別為85.13±9.08、22.25±3.69和52.43±6.75 CAT(U/mg)，D組顯著低于S組(t=5.96,P＜0.05)而高于I/R組(t=8.89,P＜0.05)；三組大鼠血清IL-6分別為51.06±6.24、117.77±6.93和92.14±4.34(pg/mL)，D組顯著高于S組(t=21.62,P＜0.05)而低于I/R組(t=12.54,P＜0.05)，TNF-α分別為40.98±9.29、85.31±9.64和55.89±7.39(pg/mL)，D組顯著高于S組(t=5.02,P＜0.05)而低于I/R組(t=9.69,P＜0.05)；三組大鼠細(xì)胞凋亡分別為30.25±4.65，91.25±3.37和62.25±7.40，D組顯著高于S組(t= 14.65,P＜0.05)而低于I/R組(t=14.27,P＜0.05)。結(jié)論：右美托咪定預(yù)處理通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對2型糖尿病大鼠全腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生了保護(hù)作用。

右美托咪定；糖尿病大鼠；缺血再灌注損傷；氧化應(yīng)激；炎癥反應(yīng)

腦血管疾病嚴(yán)重威脅著人們的健康，其發(fā)病率、病死率及致殘率有逐年上升的趨勢。基礎(chǔ)研究證明，右美托咪定具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制主要通過作用于中樞α2-腎上腺素能受體，發(fā)揮抗炎抗氧化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[1]。近年來，糖尿病是腦血管病的重要危險因素之一，高血糖可導(dǎo)致腦血管病變加重腦缺血再灌注損傷[2]。目前，右美托咪定對于糖尿病機(jī)體是否具有神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚。我們在建立糖尿病大鼠全腦缺血再灌注損傷模型后，觀察了右美托咪啶預(yù)處理對大鼠炎癥因子及腦組織的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 鏈尿佐菌素（streptozotocin,STZ）,美國Sigma公司產(chǎn)品。IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自藍(lán)基生物工程有限公司；SOD、MDA、CAT試劑盒購自南京建成生物有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒、DAB染色試劑盒購自德國羅氏公司；右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司。

1.2 動物分組與處理 成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，平均（209±10）g，周齡8周。2型糖尿病大鼠模型造模成功后隨機(jī)分為3組（n=16），分別為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組（I/R組）、右美托咪定組（D組）。缺血前30 min，S組和I/R組靜脈輸注生理鹽水120 min,輸注速度2 mL/h。D組靜脈輸注右美托咪定，首次劑量6 μg/kg，10 min內(nèi)輸注，剩余劑量以0.05 μ g·kg-1·min-1持續(xù)靜脈泵注120 min，輸注速度2 mL/h（右美托咪定用生理鹽水稀釋）。

1.3 模型制備方法

1.3.1 2型糖尿病大鼠模型制備 造模前均自由飲食水，在恒定條件下[（21±2）℃，12 h白/12 h黑循環(huán)]每2只1籠飼養(yǎng)。高脂高糖飼料。在第6周和第9周禁食12 h，不禁水。經(jīng)尾靜脈再次注射1%STZ溶液(30 mg/kg)。觀察大鼠的飲食尿及體質(zhì)量的情況，STZ注射后72 h測量大鼠的隨機(jī)血糖水平。挑選隨機(jī)血糖水平≥16.7 mmol/L的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 全腦缺血再灌注損傷模型的制備 夾閉雙側(cè)頸總動脈聯(lián)合低血壓法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。異氟烷吸入誘導(dǎo)并維持麻醉，氣管插管機(jī)械通氣。穿刺大鼠股動脈、尾動靜脈分別用來放血降壓、有創(chuàng)血壓監(jiān)測、回輸血液和泵藥。分離雙側(cè)頸總動脈待夾閉。進(jìn)行腦缺血處理，從股動脈放血到無菌容器內(nèi)，10 min之內(nèi)使大鼠的平均動脈壓（MAP）降至（35±2）mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)水平，夾閉雙側(cè)頸總動脈。調(diào)節(jié)無菌容器內(nèi)的血液量，保證MAP在（35±2）mmHg水平。全腦缺血時間為10 min。10 min后去掉動脈夾同時經(jīng)尾靜脈回輸放出的血液，回輸時間為10 min?；剌斀Y(jié)束，繼續(xù)機(jī)械通氣60 min。生命體征穩(wěn)定后停藥，拔除氣管導(dǎo)管。圍術(shù)期記錄大鼠的血壓、心率、氧分壓、心電圖、血?dú)?，維持體溫為37℃。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 NDS評分 于缺血再灌注24 h測定大鼠感覺運(yùn)動功能。NDS評分包括意識、呼吸、聽力、嗅覺、視覺、胡須運(yùn)動及角膜反射、運(yùn)動及感覺功能、協(xié)調(diào)能力及有無癲癇發(fā)作等。神經(jīng)功能完全正常為0分，腦死亡為100分。

1.4.2 腦組織含水量測定 于缺血再灌注24 h，每組取8只大鼠，斷頭取左側(cè)腦皮質(zhì)立即稱重（濕重），放入70℃烘干箱3 d。3 d后稱重（干重）。通過公式計(jì)算腦組織含水量：[（濕重-干重）/濕重]×100%。

1.4.3 腦組織MDA、SOD、CAT檢測 于缺血再灌注24h，每組取8只大鼠，斷頭取海馬組織，-80℃深低溫冰箱保存。按照重量：體積比為1∶9比例的冰鹽水制成10%的腦組織勻漿，BCA法測定勻漿蛋白濃度，分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀測定腦組織中MDA含量、SOD活性、CAT活性。

1.4.4 血漿IL-6、TNF-α的測定 于缺血再灌注24 h，每組取8只大鼠，取股動脈血液標(biāo)本5 mL，3000 r/min離心15 min,取上清液（血漿），-80℃深低溫保存。ELISA法檢測血漿中IL-6、TNF-α含量。

1.4.5 腦組織凋亡細(xì)胞的檢測 于缺血再灌注24 h，每組取8只大鼠，4%多聚甲醛灌注、固定，做海馬冠狀切片，行TUNEL染色。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色。使用光學(xué)顯微鏡觀察在40倍視野下，由1名未知實(shí)驗(yàn)分組的實(shí)驗(yàn)員應(yīng)用顯微鏡隨機(jī)選取5個視野，每個視野選取100個細(xì)胞，進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDS評分及腦組織含水量 S組、I/R組和D組NDS評分分別為4.25±3.15、45.56±8.59和23.00± 8.83，D組顯著高于S組(t=8.00,P＜0.05)而低于I/R組(t=7.32,P＜0.05)；三組腦組織相對含水量分別為59.58±0.06、87.87±0.06和80.52±0.04，D組顯著高于S組(t=116.21,P＜0.05)而低于I/R組(t=40.76, P＜0.05)，見表1。

表1 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量(±s)

表1 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦組織含水量(±s)

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05

組別S組I/R組D組NDS評分4.25±3.15 45.56±8.59a23.00±8.83a、b腦組織含水量59.58±0.06 87.87±0.06a80.52±0.04a、b

2.2 腦組織MDA、SOD、CAT水平 S組，I/R組和D組MDA分別為0.89±0.13，2.67±0.52和1.85±0.51 (nmol/mg)，D組顯著高于S組(t=7.29,P＜0.05)而低于I/R組(t=4.50,P＜0.05)；SOD分別為82.33± 13.17、32.06±6.34和57.89±9.74(U/mg)，D組顯著低于S組(t=5.97,P＜0.05)而高于I/R組(t=8.89,P＜0.05)；CAT分別為85.13±9.08、22.25±3.69和52.43±6.75 CAT(U/mg)，D組顯著低于S組(t=5.96, P＜0.05)而高于I/R組(t=8.89,P＜0.05)，見表2。

表2 3組大鼠腦組織MDA、SOD、CAT水平比較(±s)

表2 3組大鼠腦組織MDA、SOD、CAT水平比較(±s)

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05

組別S組I/R組D組MDA(nmol/mg) 0.89±0.13 2.67±0.52a1.85±0.51a、b SOD(U/mg) 82.33±13.17 32.06±6.34a57.89±9.74a、b CAT(U/mg) 85.13±9.08 22.25±3.69a52.43±6.75a、b

2.3 血漿IL-6、TNF-α水平 S組，I/R組和D組大鼠血清IL-6分別為51.06±6.24、117.77±6.93和92.14±4.34(pg/mL)，D組顯著高于S組(t=21.62,P＜0.05)而低于I/R組(t=12.54,P＜0.05)，TNF-α分別為40.98±9.29、85.31±9.64和55.89±7.39(pg/mL)，D組顯著高于S組(t=5.02,P＜0.05)而低于I/R組(t= 9.69,P＜0.05)，見表3。

表3 3組大鼠血漿IL-6、TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

表3 3組大鼠血漿IL-6、TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

注：與S組比較，aP＜0.05；與I/R組比較，bP＜0.05

組別S組I/R組D組IL-6 51.06±6.24 117.77±6.93a92.14±4.34a、bTNF-α 40.98±9.29 85.31±9.64a55.89±7.39a、b

2.4 海馬區(qū)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)與TUNEL染色 S組，I/R組和D組大鼠細(xì)胞凋亡分別為30.25±4.65，91.25± 3.37和62.25±7.40，D組顯著高于S組(t=14.65,P＜0.05)而低于I/R組(t=14.27,P＜0.05)，見圖1。

3 討論

采用高脂高糖飲食聯(lián)合小劑量STZ溶液尾靜脈注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，很好地模擬了2型糖尿病患者身體狀態(tài)，同時該方法也是2型糖尿病大鼠模型常用的制備方法[3-4]。夾閉雙側(cè)頸總動脈聯(lián)合低血壓法制備全腦缺血再灌注損傷模型，是目前研究全腦缺血再灌注損傷較常用的動物模型，該模型很好的模擬了大鼠腦組織缺血再灌注的病生理過程。這2種模型的結(jié)合，可用來模擬臨床上糖尿病患者圍術(shù)期發(fā)生的缺血性腦損傷。既往研究發(fā)現(xiàn)[5]，右美托咪定能夠抑制糖尿病大鼠全腦缺血再灌注損傷，表現(xiàn)為降低NDS評分和腦組織含水量，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與右美托咪定可以減輕糖尿病大鼠全腦缺血再灌注引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

圖1 三組大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果(A∶S組；B∶I/R組；C∶D組)

TNF-α和IL-6是重要的炎癥因子，共同參與機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)[6]。近年來，基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，促炎因子在腦缺血再灌注損傷中起重要作用[7]。腦缺血再灌注損傷可引起腦組織、腦脊液、血漿中TNF-α和IL-6的水平升高[8]。原因是腦缺血再灌注后激活的腦組織細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，其主要有TNF-α和IL-6。炎性因子通過“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”，可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)毒性雙向作用。而在缺血再灌注狀態(tài)下，高濃度的炎性因子TNF-α、白介素等參與了神經(jīng)損傷[9]，介導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性增高，使得腦組織含水量增加，進(jìn)一步導(dǎo)致腦組織水腫，水腫的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞核碎裂導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。研究證實(shí)，右美托咪定能夠降低缺血再灌注后血漿中TNF-α、IL-6的水平，從而抑制炎癥網(wǎng)絡(luò)、降低缺血再灌注所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在全腦缺血再灌注損傷后24 h，右美托咪定能夠降低糖尿病大鼠血漿中IL-6和TNF-α水平。表明右美托咪定對糖尿病的大鼠的腦損傷具有抗炎作用。

氧化應(yīng)激參與了腦缺血再灌注損傷的全過程[11]。腦缺血可導(dǎo)致腦組織活性氧簇（ROS）增多，如O2-、H2O2[12]。ROS可引起細(xì)胞損傷，通過氧化細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白、DNA片段，破壞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，凋亡。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變，促使溶酶體酶和線粒體基質(zhì)酶進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，溶解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，是檢測氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體ROS產(chǎn)生增多時，機(jī)體會啟動防御系（SOD和CAT）來起到自動調(diào)節(jié)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。機(jī)體在正常情況下SOD可將O2-轉(zhuǎn)換成H2O2，最后由CAT清除。發(fā)生腦缺血再灌注時，因?yàn)镾OD和CAT濃度較低，ROS不能全部被分解清除[13]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與S組比較，I/R組和D組腦組織內(nèi)MDA水平明顯升高，SOD、CAT活性明顯下降。D組腦組織內(nèi)MDA水平比I/R組明顯降低，SOD、CAT活性明顯升高。表明糖尿病大鼠全腦缺血再灌注后發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，而給予右美托咪定后，降低了這種應(yīng)激反應(yīng)。因此，右美托咪定對糖尿病大鼠全腦缺血再灌注損傷具有抗氧化作用。

TUNEL染色是判定神經(jīng)細(xì)胞凋亡的金指標(biāo)。腦梗死時，腦組織的神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞以及血管全部被破壞。而且，梗死周圍的腦組織神經(jīng)元也將走向壞死、凋亡[14]。以往研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能夠減少梗死范圍改善神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸，具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與S組比較，I/R組和D組腦組織海馬區(qū)凋亡細(xì)胞增多；D組腦組織海馬區(qū)凋亡細(xì)胞比I/R組減少。表明右美托咪定對糖尿病大鼠全腦缺血再灌注損傷，具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

右美托咪定對糖尿病大鼠全腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)為降低NDS評分，減少腦組織水腫，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。其原因可能與右美托咪定的抗炎抗氧化作用相關(guān)。但右美托咪定如何抑制缺血再灌注病理過程中炎性因子的產(chǎn)生及其確切分子機(jī)制目前并不十分清楚。因此，下一步應(yīng)通過蛋白免疫印跡、免疫共沉淀等分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步探討其抑制缺血再灌注損傷的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更為可靠的證據(jù)。

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（收稿：2016-01-26 修回：2016-05-20）

（責(zé)任編輯 李文碩）

摘 要的具體要求

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英文摘 要的內(nèi)容應(yīng)相對具體，一般在600個實(shí)詞以內(nèi)，統(tǒng)一采用Objective、Methods、Results、Conclusion格式。英文摘 要前列出英文標(biāo)題、前三個作者姓名（漢語拼音，姓氏字母均大寫，名字首字母大寫，雙字名中間加連字符）和第一作者的單位名稱、所在城市名和郵政編碼及國名。三個以上的作者用“et al”表示，如“QIU Qi，CUI Nai-qiang，WU Xian-zhong，et al.Department of Surgery,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China.”。

Influence of Dexmedetomidine on Cerebral Injury in Diabetic Rats

WANG Peng,SHAN Shi-min,HAO Wei,et al.Department of Anesthesiology,Fifth Centre Hospital of Tianjin,Tianjin(300450),China

Objective To observe the effect of dexmedetomidine on cerebral injury in type 2 diabetic rats. Methods Sixty male,Sprague-Dawley rats(200～220 g)as animal models with type 2 diabetes mellitus were es?tablished.The rat models were randomly divided into 3 groups:sham-operation group(group S),ischemic-reper?fusion control group(group I/R)and dexmedetomidine group(group D),with 16 rats in each group.The animal models with global cerebral ischemia were established.The rats in group D,on 30 min before ischemia,were in?fused with dexmedetomidine 0.05 μg·kg-1·min-1over 120 min,while the rats in group S and group I/R were giv?en 0.9%sodium chloride solution 2ml/h instead.Neurologic deficit scores,brain water content,SOD activity, CAT activity,and MDA content of brain tissue and the IL-6,TNF-α in the plasma were tested,the number of TUNEL-positive neurons in ischemic hippocampus were observed 24 h after reperfusion. Results The NDS scores were 4.25±3.15,45.56±8.59 and 23.00±8.83 for group S,group I/R and group D respectively,which indi?cated D group was significantly higher than S group(t=8.00,P＜0.05)but statistically lower than I/R group(t= 7.32,P＜0.05)；The brain water contents were 59.58±0.06,87.87±0.06 and 80.52±0.04 for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly higher than S group(t=116.21,P＜0.05) but statistically lower than I/R group(t=40.76,P＜0.05).The MDA were 0.89±0.13，2.67±0.52 and 1.85±0.51 (nmol/mg)for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly higher than S group(t=7.29,P＜0.05)but statistically lower than I/R group(t=4.50,P＜0.05).The SOD were 82.33±13.17,32.06±6.34 and 7.89±9.74(U/mg)for Sgroup,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly lower than S group(t=5.97, P＜0.05)but statistically higher than I/R group(t=8.89,P＜0.05).The CAT were 85.13±9.08、22.25±3.69 and 52.43±6.75 CAT(U/mg)for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significant?ly lower than S group(t=21.62,P＜0.05)but statistically higher than I/R group(t=8.89,P＜0.05).The serum IL-6 were 51.06±6.24、117.77±6.93 and 92.14±4.34(pg/mL)for S group,I/R group and D group respectively, which indicated D group was significantly higher than S group(t=21.62,P＜0.05)but statistically lower than I/R group(t=12.54,P＜0.05).The serum levels of TNF-α were 40.98±9.29,85.31±9.64 and 55.89±7.39(pg/mL)for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly lower than S group(t= 5.02,P＜0.05)but statistically higher than I/R group(t=9.69,P＜0.05).The apoptosis were 30.25±4.65，91.25± 3.37 and 62.25±7.40 for S group,I/R group and D group respectively,which indicated D group was significantly lower than S group(t=14.65,P＜ 0.05)but staitistically higher than I/R group(t=14.27,P＜ 0.05). Conclusion The dexmedetomidine has protective effects on global cerebral ischemia-reperfusion injury in dia?betic rats.

Dexmedetomidine;diabetes mellitus;ischemia-reperfusion injury;oxidative stress;inflammato?ry response

Q95-33;R971+.1

A

1007-6948(2016)04-0355-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.04.012

天津市第五中心醫(yī)院麻醉科（天津 300450）

單世民,E-mail：15022171377@163.com