ITC研究達(dá)卡巴嗪與DNA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

王 歡， 王 姣， 李宗孝， 趙微微， 蒲小華， 程花蕾

(寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 寶雞 721013)

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ITC研究達(dá)卡巴嗪與DNA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

王 歡， 王 姣， 李宗孝， 趙微微*， 蒲小華， 程花蕾

(寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 寶雞 721013)

利用等溫滴定量熱(ITC)、光譜、粘度測(cè)量等方法，研究了小牛胸腺DNA與抗癌藥物達(dá)卡巴嗪的相互作用。結(jié)果表明：達(dá)卡巴嗪與DNA作用后，吸收光譜會(huì)出現(xiàn)增色、藍(lán)移和粘度減小等現(xiàn)象。采用ITC法得到了結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，發(fā)現(xiàn)達(dá)卡巴嗪與DNA以非經(jīng)典嵌插式及表面作用兩種方式結(jié)合。對(duì)于嵌插式，ΔH1<0，ΔS1>0，K1=5.63×104，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)0.10；對(duì)于藥物分子僅與DNA表面發(fā)生作用而并未嵌入到DNA分子的疏水部分的結(jié)合方式，ΔH2>0，ΔS2>0，K2=1.00×103，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)9.99。同時(shí)發(fā)現(xiàn)紫外法得到的結(jié)合常數(shù)是Ka=6.70×104，與ITC的嵌插式吻合。

DNA； 達(dá)卡巴嗪； 光譜法； 作用機(jī)理； 等溫滴定量熱

1 引 言

生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)、糖類(lèi)等，它們參與了生命活動(dòng)的所有過(guò)程[1-3]。DNA是生物體內(nèi)最重要的生物大分子，是絕大多數(shù)生物遺傳信息的載體，對(duì)生物的遺傳進(jìn)化起著重要的作用。許多外源性的小分子可以與DNA結(jié)合，這種相互作用能引起DNA的斷裂，或者改變DNA的結(jié)構(gòu)，破壞其作為核酸模板的功能，影響DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等功能，導(dǎo)致細(xì)胞癌變、突變或者死亡[4-8]。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)于小分子與DNA的相互作用做了研究：劉振佳等[9]利用圓二色譜技術(shù)研究了DNA 與小分子化合物的相互作用；龍泉鑫等[10]對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物斷裂復(fù)合體與DNA復(fù)制的抑制進(jìn)行了研究；鐘文英等[11]探討了巴羅沙星與DNA的相互作用及Mg2+的影響。但廣譜抗腫瘤藥物達(dá)卡巴嗪 (Dacarbazine,DAC)與DNA的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文利用ITC法檢測(cè)探討了DAC導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡的作用機(jī)制及抗癌原理，闡述了反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)力。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的儀器主要有NANO 等溫滴定量熱儀(美國(guó)TA)、UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)和Advantage A10超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore Q)。

實(shí)驗(yàn)中使用的試劑主要有達(dá)卡巴嗪(DAC)、小牛胸腺DNA、三羥甲基氨基甲烷(AR，Tris)和鹽酸(AR，HCl)。所需溶液均用Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1，pH=7.40)溶解，用DNA 在260 nm處的吸光度與280 nm處的吸光度比值檢驗(yàn)其純度(A260/A280>1.80)。DNA濃度利用ε260=6 600 L·(mol·cm)-1來(lái)確定。溶液均于4 ℃的冰箱中儲(chǔ)備。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(18.2 MΩ·cm，25 ℃)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用等溫滴定量熱法、粘度法、紫外吸收法對(duì)DNA與DAC的相互作用進(jìn)行測(cè)試和分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 DNA-DAC的吸收光譜

在常壓及25 ℃下，以Tris-HCl作緩沖液(0.05 mol·L-1，pH=7.40)，CDNA=5.82×10-5mol·L-1，CDAC=5.81×10-5mol·L-1，分別繪制吸收光譜，如圖1所示。

圖1分別為DNA、DAC及DNA與DAC作用后的紫外吸收曲線。其中DNA和DAC吸收值的和不完全等于DNA-DAC的吸收值，二者相差0.049。這可能是因?yàn)樗幬顳AC與DNA作用形成了復(fù)合物，從而導(dǎo)致DNA紫外吸收性質(zhì)的改變，使得特征峰強(qiáng)度增大，最終導(dǎo)致單純的DNA、DAC線的疊加不等于DNA-DAC線之值。

圖1 DNA、DAC及DNA-DAC在Tries-HCl ( 0.05 mol·L-1, pH =7.40)中的紫外吸收光譜。

Fig.1 UV absorption spectra of DNA, DAC and DNA-DAC in Tris-HCl ( 0.05 mol·L-1, pH=7.4 ), respectively.

3.2 DAC與DNA的作用方式推斷

按3.1的方法，固定DNA濃度(2.05×10-4mol·L-1)，將DAC濃度由5.53×10-6mol·L-1增加到3.73×10-5mol·L-1，獲得紫外光譜如圖2 所示。

圖2 室溫下達(dá)卡巴嗪與DNA相互作用的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

Fig.2 UV-Vis absorption spectra of the interaction between DNA and DAC at room temperature

一般而言，DNA的堿基在250～270 nm之間有吸收，其特征吸收峰在260 nm處，該特征峰常用于確定DNA 的濃度。通過(guò)DNA 和小分子藥物作用的增色/減色效應(yīng)或者吸收帶的紅移/藍(lán)移等現(xiàn)象[12-13]，可以確定藥物分子和DNA 作用的方式。

圖2顯示， DNA在300～360 nm區(qū)間沒(méi)有吸收峰，但隨著DAC的逐漸加入，在330 nm附近出現(xiàn)新的吸收峰，該吸收峰是DAC的特征吸收；同時(shí)，在260 nm處的DNA特征吸收峰隨著DAC濃度的增加出現(xiàn)增色效應(yīng)，并伴隨微小的吸收帶藍(lán)移。這表明藥物DAC沒(méi)有插入到DNA堿基對(duì)之間的平面中，說(shuō)明DAC與DNA并不是以經(jīng)典的嵌插結(jié)合模式結(jié)合，而是以其他方式結(jié)合。

若以CDNA表示DNA的濃度,εf、εa和εb分別代表自由態(tài)、部分結(jié)合和完全結(jié)合的化合物的摩爾消光系數(shù)，按照公式[14]

(1)

并以CDNA/(εa-εf)對(duì)CDNA作圖,得到圖3。

由截距1/Ka(εb-εf) 得該體系的結(jié)合常數(shù)Ka為6.70×104L·mol-1。

3.3 利用DNA的熔點(diǎn)特征確定結(jié)合方式

常壓下，分別將DNA、DNA-DAC置于恒溫水浴槽中，從25 ℃開(kāi)始每間隔5 ℃測(cè)定DNA、DNA- DAC兩種體系在260 nm處的吸光度。以fss=(A-A0)/(Af-A0)對(duì)溫度T作熱變性曲線(其中，A0和Af分別為25 ℃和 100 ℃時(shí)體系260 nm處的吸光度。A為溫度變化時(shí)體系260 nm對(duì)應(yīng)的吸光度)。當(dāng)fss=0.5時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度即為熔點(diǎn)Tm，得圖4。

通常情況下，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)在加熱或堿性條件下會(huì)遭到破壞，導(dǎo)致雙鏈間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈結(jié)構(gòu)。Sun等[15]證明：當(dāng)DNA與小分子藥物相互作用時(shí)，Tm會(huì)發(fā)生變化。若Tm上升了5～8 ℃，表明DNA雙螺旋會(huì)更加穩(wěn)定，二者的結(jié)合為嵌插結(jié)合，而靜電結(jié)合或溝槽結(jié)合對(duì)Tm無(wú)明顯影響。如圖4所示，游離 DNA 的Tm為85.54 ℃，DNA-DAC體系的Tm為86.02 ℃，顯然Tm無(wú)明顯變化，表明DAC與DNA不是以嵌插方式結(jié)合。這也證明3.2的推斷是正確的。

Fig.4 Thermal melting profiles of DNA(■) and its complexes with DAC(●)

3.4 粘度法的再利用

(2)

由圖5可以看出，隨著DAC濃度的增加，DNA溶液的相對(duì)粘度逐漸減小。這是因?yàn)樗幬顳AC以部分、非經(jīng)典嵌插方式與DNA結(jié)合[17]，使得DNA螺旋結(jié)構(gòu)扭曲，因而有效長(zhǎng)度減小，從而導(dǎo)致DNA溶液的相對(duì)粘度降低。

3.5 反應(yīng)驅(qū)動(dòng)力的確定

等溫滴定量熱技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù)，用于生物熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)研究，其優(yōu)點(diǎn)為原位、快速、無(wú)損傷，已成為鑒定生物分子間相互作用的首選方法。它可直接定量監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程的熱量變化，確定反應(yīng)過(guò)程的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，諸如結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n、反應(yīng)焓變?chǔ)、熵變?chǔ)等，用以表征分子間的相互作用[18-21]。

在25 ℃下將DAC加入250 μL的注射器中注入裝有DNA溶液的樣品池并持續(xù)攪拌，每次滴加5 μL共50次，每次間隔300 s。采用上面同樣的設(shè)置以DAC溶液滴定緩沖溶液作為對(duì)照試驗(yàn)，扣除稀釋熱的作用。圖6 為達(dá)卡巴嗪滴定DNA的等溫滴定曲線。使用NanoAnalyze軟件的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到DAC滴定DNA的熱力學(xué)參數(shù)于表1。

由表1可知,雖然n2比n1大，但結(jié)合常數(shù)K1卻大于K2，顯示出第一類(lèi)結(jié)合要比第二類(lèi)結(jié)合穩(wěn)定牢靠。這是因?yàn)樵诘诙?lèi)結(jié)合中，藥物分子僅與DNA表面發(fā)生作用而并未嵌到DNA分子的疏水部分。由于作用物之間相互作用于表面，所以容易形成較大的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，但作用力分散，親合力較弱。然而當(dāng)藥物小分子以非經(jīng)典嵌入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)并與堿基對(duì)相結(jié)合時(shí),則能成為較穩(wěn)定的第一類(lèi)結(jié)合。

SitenKa/(10-3L·moL-1)ΔH/(kJ·moL-1)ΔG/(kJ·moL-1)TΔS/(kJ·moL-1)First0．1056．33-12．33-27．1114．78Second9．991．001．57-17．1218．69

第一類(lèi)結(jié)合時(shí)，ΔH1<0，ΔS1>0，結(jié)合常數(shù)為5.63×104，顯然，該過(guò)程放熱，且熱熵為正。其原因有二：藥物小分子的疏水部分深深地陷入了DNA分子的疏水局部，導(dǎo)致體系能量降低而放熱；藥物分子的陷入，促使疏水空腔部分溶劑水分子進(jìn)入溶液本體，轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤肿?。以上兩個(gè)過(guò)程都有一定的熱量放出，進(jìn)而使體系混亂度增加。但在考慮作用過(guò)程時(shí)，藥物分子靠近DNA時(shí)本身的去水化作用和結(jié)合位點(diǎn)周?chē)瘜拥谋黄茐乃鸬奈鼰嵝?yīng)也必須予以考慮，不過(guò)這種吸熱效應(yīng)明顯小于上述兩因素導(dǎo)致的放熱效應(yīng)，因此，第一類(lèi)結(jié)合表現(xiàn)為放熱熵增現(xiàn)象，導(dǎo)致該過(guò)程的ΔG1<0，該過(guò)程的主要驅(qū)動(dòng)力為疏水作用力。

第二類(lèi)結(jié)合時(shí)，ΔH2>0，ΔS2>0 ，結(jié)合常數(shù)為1.00×103，該過(guò)程吸熱，且熱熵為正，結(jié)合常數(shù)比第一類(lèi)小。這是由于藥物分子在接近DNA表面時(shí)發(fā)生了去水化作用并且DNA表面水化層被破壞，藥物分子并沒(méi)有進(jìn)入DNA分子內(nèi)部，而是在表面進(jìn)行。因?yàn)門(mén)ΔS2>|ΔH2|熵增效應(yīng)較大并決定著該過(guò)程的ΔG2<0，故表現(xiàn)為熵驅(qū)動(dòng)過(guò)程，靜電作用力是其驅(qū)動(dòng)力。

以上兩類(lèi)結(jié)合的ΔG均小于0，說(shuō)明均可自發(fā)進(jìn)行，都可形成穩(wěn)定的化合物。

4 結(jié) 論

通過(guò)紫外滴定、熔點(diǎn)以及粘度實(shí)驗(yàn)證明DNA與DAC結(jié)合方式為非經(jīng)典、部分嵌插式。等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA與DAC反應(yīng)有兩類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)，反應(yīng)均可自發(fā)進(jìn)行。第一類(lèi)發(fā)生在DNA分子內(nèi)部，結(jié)合穩(wěn)定，為熵驅(qū)動(dòng)為主的焓熵協(xié)同驅(qū)動(dòng)過(guò)程，疏水作用是其主要驅(qū)動(dòng)力；第二類(lèi)發(fā)生在DNA分子表面，為熵驅(qū)動(dòng)過(guò)程，靜電相互作用是其主要推驅(qū)力。

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王歡(1991-)，男，陜西寶雞人，碩士研究生，2014年于寶雞文理學(xué)院獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事天然產(chǎn)物、抗癌藥物與生物大分子的相互作用的研究。E-mail: 15829499347@163.com

趙微微(1984-)，女，陜西渭南人，博士，助教，2016年于西北大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事多功能納米載體的制備及其可控釋放藥物的研究。E-mail: gengts@163.com

Interaction Dynamics Between Dacarbazine and DNA

WANG Huan, WANG Jiao, LI Zong-xiao, ZHAO Wei-wei*, PU Xiao-hua, CHENG Hua-lei

(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Baoji University of Arts and Sciences,ShannxiKeyLaboratoryofPhytochemistry,Baoji721013,China)*CorrespondingAuthor,E-mail:gengts@163.com

The interaction between calf thymus DNA and anti-cancer drug dacarbazine was investigated using isothermal titration calorimetry(ITC), spectroscopy, viscosity and other methods. The hyperchromic effect and blue shift in the absorption spectra as well as viscosity decline are observed clearly after the interaction between dacarbazine and DNA. Furthermore, the binding constant and number of binding sites are also recorded by ITC, presenting that the interactions of the dacarbazine with DNA can be categorized for two modes: a non-classical intercalation type and surface binding effect. In former, ΔH1<0, ΔS1>0,K1=5.63 × 104, the binding site is 0.10. In latter, only surficial interaction during the combination of the drug molecule with DNA occurs, not embedding into the hydrophobic part of the DNA molecule, due to ΔH2> 0 , ΔS2> 0,K2=1.00 × 103, and the binding site of 9.99. Meanwhile, UV method is also employed to find the binding constant ofKa=6.70×104, which is consistence with ITC observation.

DNA; dacarbazine; spectroscopy; interaction mechanism; isothermal titration calorimetry

1000-7032(2016)12-1560-06

2016-07-03；

2016-10-09

國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金(21501007)； 陜西省自然科學(xué)基金(2012Jm2019)； 陜西省教育廳項(xiàng)目(14JK1045)資助

O657.3

A

10.3788/fgxb20163712.1560