木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響

肖芳，覃益民，劉幽燕，2

（1廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響

肖芳1，覃益民1，劉幽燕1，2

（1廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

采用機(jī)械活化方法對(duì)蔗渣進(jìn)行處理，研究在原料可及性變化時(shí)木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶解的影響，用牛血清蛋白（BSA）預(yù)先使原料中木質(zhì)素吸附飽和的方法來(lái)測(cè)定木質(zhì)素對(duì)酶的吸附情況、用 X-射線(xiàn)衍射和掃描電鏡來(lái)測(cè)定蔗渣結(jié)晶結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)來(lái)表征原料可及性，從而分析影響的可能機(jī)制。結(jié)果表明木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響與蔗渣可及性有關(guān)，原料可及性越高，影響越小。當(dāng)蔗渣可及性相對(duì)較低時(shí)，此時(shí)木質(zhì)素影響蔗渣酶水解轉(zhuǎn)化率的兩種方式（木質(zhì)素與纖維素、半纖維素組成的致密結(jié)構(gòu)限制纖維素對(duì)酶的可及性及木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無(wú)效吸附作用）同時(shí)存在。當(dāng)原料的可及性增加到一定程度后（如機(jī)械活化 2h的蔗渣），木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用幾乎消除，木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響主要表現(xiàn)為對(duì)酶的可及性的限制。

生物質(zhì)；木質(zhì)素；水解；纖維素可及性；機(jī)械活化

由于木質(zhì)纖維原料是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的致密復(fù)雜的聚合物，且具有很強(qiáng)的抗性，使得木質(zhì)纖維素的預(yù)處理和酶解過(guò)程成本仍然很高[1]。而要想通過(guò)進(jìn)一步改善木質(zhì)纖維素預(yù)處理的效率和開(kāi)發(fā)新的酶解技術(shù)來(lái)降低成本，則要對(duì)影響酶水解效率的關(guān)鍵因素有更深入的理解。

在各種影響酶水解效率的因素中，纖維原料中木質(zhì)素的存在被認(rèn)為是影響酶水解效率重要因素之一[2-3]，并認(rèn)為其影響機(jī)制主要表現(xiàn)在兩方面：一方面木質(zhì)素與纖維素、半纖維素組成的致密復(fù)雜的結(jié)構(gòu)限制原料對(duì)酶的可及性，即木質(zhì)素對(duì)纖維原料本身可及性的影響[4-5]；另一方面木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附（non-productive adsorbtion）降低了有效作用的酶量[6-7]。研究表明，這樣的影響可通過(guò)對(duì)木質(zhì)纖維原料預(yù)處理去除木質(zhì)纖維原料中的木質(zhì)素來(lái)降低或消除[8-9]。但由于木質(zhì)纖維原料組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，影響酶水解效率因素間存在相互間的牽連，且通常脫木質(zhì)素方法在改變?cè)夏举|(zhì)素含量的同時(shí)，或多或少也會(huì)改變?cè)系目杉靶?。因此，在纖維素水解過(guò)程中木質(zhì)素到底主要是起限制纖維素的可及性作用還是主要起對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附作用仍有待深入研究。近來(lái)的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將脫去的木質(zhì)素重新回加到被完全脫木質(zhì)素或純纖維素的纖維原料中時(shí)，木質(zhì)素對(duì)纖維素的酶解幾乎沒(méi)有影響。因此認(rèn)為只要纖維原料中纖維素對(duì)酶是可及的時(shí)候，木質(zhì)素存在與否對(duì)纖維素酶解幾乎沒(méi)有影響[10-11]。但這樣的原料體系與天然木質(zhì)纖維原料體系在結(jié)構(gòu)上有很大的區(qū)別，故研究結(jié)果并未真正反映出存在于天然原料中木質(zhì)素的影響行為。

為了排除由于木質(zhì)素含量變化帶來(lái)的對(duì)酶水解效率的影響，以便更好研究纖維原料可及性變化時(shí)木質(zhì)素的存在對(duì)酶水解效率的影響，本文采用機(jī)械活化方法對(duì)蔗渣進(jìn)行處理（經(jīng)處理的蔗渣組成不變，只是結(jié)構(gòu)改變）以獲得不同可及性的纖維原料，考察了在原料可及性變化時(shí)木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶解的影響。用 BSA預(yù)先使原料中木質(zhì)素吸附飽和的方法（可作為“l(fā)ignin blockers”）[12]來(lái)測(cè)定木質(zhì)素對(duì)酶的吸附情況、用X-射線(xiàn)衍射和掃描電鏡來(lái)測(cè)定蔗渣結(jié)晶結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)來(lái)表征原料可及性，從而分析影響的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

蔗渣：取去皮甘蔗榨汁后水洗除去可溶性糖，后放入80℃恒溫干燥箱干燥至恒重備用。

機(jī)械活化蔗渣[13]：在自制高能效攪拌磨的研磨筒中加入磨介質(zhì) 300mL（堆體積），按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，調(diào)好轉(zhuǎn)速和恒溫水浴溫度后，放入一定量蔗渣，達(dá)到規(guī)定活化時(shí)間后取出分球，樣品烘干后密封保存。以上所有蔗渣樣品均過(guò)80目篩。

1.2纖維素酶

商品纖維素酶，Sigma公司生產(chǎn)。

1.3蔗渣酶解實(shí)驗(yàn)

在250mL錐形瓶中加入100mg蔗渣[或預(yù)先用牛血清蛋白（BSA）處理的蔗渣]、10 FPU/g纖維素的酶量和100mL pH為4.8的緩沖溶液，在溫度為50℃，轉(zhuǎn)速為160r/min的恒溫振蕩水槽中酶解12h、24h、36h、48h、60、72h。反應(yīng)結(jié)束后，收集樣品，離心，分析上清液總還原糖產(chǎn)率。所有酶解實(shí)驗(yàn)均做三組平行。

1.4分析方法

預(yù)處理蔗渣木質(zhì)素含量測(cè)定方法為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 2677.8—1994和GB/T 10337—1989），纖維素和半纖維素測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。還原糖測(cè)定方法為 DNS法[15]。SEM 分析：掃描電鏡型號(hào)為S-3400N，掃描電壓 20kV，放大倍速 3000。XRD分析采用D/max2500V型X-射線(xiàn)衍射儀，加速電壓為30kV，電流為25mA，2θ角為5°～50°；掃描速度為 2°/min。纖維素轉(zhuǎn)換為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率及結(jié)晶度x的計(jì)算見(jiàn)式(1)、式(2)[16]。

式中，I002為002晶面衍射強(qiáng)度最大值；Iam是2θ為18°的衍射強(qiáng)度。

2　結(jié)果與討論

2.1蔗渣酶解實(shí)驗(yàn)

圖1為機(jī)械活化預(yù)處理2h的蔗渣酶水解過(guò)程曲線(xiàn)。可見(jiàn)經(jīng)機(jī)械活化處理后的蔗渣，木質(zhì)素雖沒(méi)有脫去（木質(zhì)素含量與原蔗渣相同，只是提高了蔗渣的可及性），但蔗渣的酶水解轉(zhuǎn)化率均有明顯的提高，蔗渣水解反應(yīng)60h后轉(zhuǎn)化率基本達(dá)到最高值。表明當(dāng)原料的可及性增加時(shí)，即使木質(zhì)素含量較高的原料不經(jīng)脫木質(zhì)素，也能獲得較好的酶水解效率。

圖1　蔗渣酶解進(jìn)程

圖2　機(jī)械活化時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)糖率的影響

為了探索木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響與蔗渣可及性的關(guān)系，用經(jīng)不同時(shí)間機(jī)械活化處理的蔗渣進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

與預(yù)期結(jié)果一樣，圖2結(jié)果表明機(jī)械活化處理后的蔗渣酶解產(chǎn)糖率是隨著活化時(shí)間（可及性）的增加而提高，表明木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響與蔗渣可及性有關(guān)。當(dāng)蔗渣活化時(shí)間較短時(shí)（0～1h），由于蔗渣結(jié)構(gòu)受破壞的程度較低，酶解轉(zhuǎn)化率提高得很慢，如處理1h的蔗渣酶解轉(zhuǎn)化率只由未處理時(shí)的12.3%提高到17.7%。當(dāng)蔗渣經(jīng)活化時(shí)間增長(zhǎng)時(shí)（1～3h），酶解轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)快速提高，當(dāng)蔗渣活化時(shí)間大于2h處理后，酶解轉(zhuǎn)化率達(dá)到51.8%的最大值，比經(jīng)堿法脫木質(zhì)素后蔗渣的酶解轉(zhuǎn)化率還要高（經(jīng)測(cè)定堿法脫木質(zhì)素后蔗渣的酶解轉(zhuǎn)化率為49.3%），說(shuō)明當(dāng)原料的可及性增加時(shí)，即使木質(zhì)素含量較高的蔗渣原料不經(jīng)脫木質(zhì)素也能獲得較好的酶水解效率，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相類(lèi)似[11,16]。至于為何會(huì)出現(xiàn)酶解轉(zhuǎn)化率快速提高現(xiàn)象，推測(cè)應(yīng)是原料結(jié)構(gòu)此時(shí)發(fā)生了較大的變化，此后的原料可及性分析結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

由于經(jīng)機(jī)械活化處理后的蔗渣木質(zhì)素含不變，由木質(zhì)素含量變化而引起的原料可及性變化以及對(duì)纖維素酶吸附的變化可以排除，因此經(jīng)機(jī)械活化處理后的蔗渣酶解產(chǎn)糖率的提高似乎應(yīng)只是由于機(jī)械活化處理方法使原料的可及性增加從而降低或消除了木質(zhì)素對(duì)纖維原料可及性的限制所致。但從添加BSA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看情況并非如此。當(dāng)蔗渣經(jīng)活化時(shí)間較短時(shí)（0～1h），盡管添加BSA對(duì)蔗渣酶解產(chǎn)糖率的提高率還很高（活化0、0.5h和1.0h的提高率分別為 182%、147%、115%），即木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用很?chē)?yán)重，但吸附作用還是隨活化時(shí)間（可及性）增加而逐漸降低的。特別是當(dāng)蔗渣經(jīng)活化時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)（2～3h），添加BSA對(duì)蔗渣酶解產(chǎn)糖率的影響已變得不明顯（活化2.0h、3.0h的酶解產(chǎn)糖率的提高率分別只有3.4%、2.6%），木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用幾乎消除，這表明經(jīng)機(jī)械活化處理后的蔗渣酶解產(chǎn)糖率的提高不僅僅是由于預(yù)處理降低或消除了木質(zhì)素對(duì)纖維原料可及性的限制所致，由于蔗渣可及性的提高而降低了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用也是原因之一。

2.2原料可及性分析

纖維原料的可及性與其表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)晶程度有關(guān)。為了進(jìn)一步說(shuō)明預(yù)處理后纖維原料的可及性變化，用X射線(xiàn)衍射和掃描電鏡對(duì)不同預(yù)處理的蔗渣樣進(jìn)行了分析。

圖3顯示了未處理和經(jīng)過(guò)處理后蔗渣的X射線(xiàn)圖譜。結(jié)果表明，預(yù)處理并沒(méi)有改變蔗渣的晶型，仍然為結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)共存的纖維素Ⅰ類(lèi)型，2θ＝22.6°的峰對(duì)應(yīng)著結(jié)晶區(qū)，而2θ＝16°處對(duì)應(yīng)著無(wú)定型區(qū)[17-19]。但預(yù)處理使蔗渣的結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)的比例發(fā)生了比較明顯的變化。預(yù)處理前后蔗渣的結(jié)晶度變化采用式(2)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明蔗渣經(jīng)過(guò)機(jī)械活化后，結(jié)晶度從48%降低到35.25%，降低了12.75%。

圖3　不同預(yù)處理后蔗渣的X射線(xiàn)衍射

電鏡分析表明（圖4），未處理過(guò)的蔗渣纖維成束，結(jié)構(gòu)非常緊密，表面很光滑，沒(méi)有裂紋及孔洞[圖4(a)]。而經(jīng)過(guò)機(jī)械活化后，蔗渣的表面結(jié)構(gòu)由于在機(jī)械活化過(guò)程中不斷與球體摩擦、沖擊、碰撞、剪切而受到破壞，首先纖維束沿著排列方向發(fā)生了斷裂，表面也出現(xiàn)很多片狀剝離及孔洞[圖 4(b)]。活化2h后[圖4(c)]蔗渣的結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化，緊密的纖維束結(jié)構(gòu)消失，并形成了許多細(xì)小的顆粒，使蔗渣纖維的比表面積大幅度增加，結(jié)果使蔗對(duì)纖維酶的可及性也大大增加，從而導(dǎo)致蔗渣酶水解變得容易。這也解釋了2.1節(jié)中當(dāng)蔗渣處理時(shí)間在1～2h變化時(shí)酶解轉(zhuǎn)化率變化有一個(gè)明顯突躍的原因。

圖4　處理前后蔗渣掃描電鏡圖片

3　結(jié) 論

木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響與蔗渣可及性如表面形態(tài)和結(jié)晶性有關(guān)，原料可及性越高，影響越小。當(dāng)蔗渣可及性相對(duì)較低時(shí)，木質(zhì)素影響蔗渣酶水解轉(zhuǎn)化率的兩種方式（木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用及木質(zhì)素與纖維素、半纖維素組成的致密的結(jié)構(gòu)限制纖維素對(duì)酶的可及性）同時(shí)存在。當(dāng)預(yù)處理方法使原料的可及性增加到一定程度后（如機(jī)械活化2h的蔗渣），此時(shí)木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附作用幾乎消除，木質(zhì)素對(duì)蔗渣酶水解的影響主要表現(xiàn)為對(duì)酶的可及性的限制。

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The effect of lignin in bagasse enzyme hydrolysis

XIAO Fang1，QIN Yimin1，LIU Youyan1，2
（1School of Chemistry and Chemical Engineering ，Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China；2Guangxi Key Laboratory of Biorefinery，Nanning 530004，Guangxi，China）

The mechanical activation method was employed to process bagasse. The effect of lignin on enzymatic hydrolysis was studied effect when the raw material accessibility changed. The X-ray diffraction and scanning electron microscopy（SEM）were used to determine the crystal structure and surface morphology of bagasse，to characterize the raw material accessibility，and analyze the influence of the possible mechanisms. The results showed that the effect of lignin on bagasse enzyme hydrolysis was related to bagasse accessibility. The higher raw material availability was，the smaller the effect was. When the accessibility of bagasse was relatively low，lignin affected the rate of enzymatic hydrolysis of bagasse in two ways (limiting cellulose accessibility and unproductive binding of the enzymes) simultaneously. When the availability of raw material increased to a certain level (for example，2 hours by mechanical activation of bagasse) and lignin adsorption of cellulose was virtually eliminated. The main effect of Lignin on bagasse enzymatic hydrolysis was limiting enzyme accessibility.

biomass；lignin；hydrolysis；cellulose accessibility；mechanical activation

TQ 353.4+23

A

1000–6613（2016）12–4072–04

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.12.047

2016-05-09；修改稿日期：2016-05-24。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21276053）及廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開(kāi)放課題項(xiàng)目。

肖芳（1989—），女，碩士研究生。E-mail quitefang@sina.com。

聯(lián)系人：覃益民，博士，教授。E-mail qym6289@sina.com。