喀斯特地區(qū)同一花序白三葉形態(tài)多樣性研究

吳永潔+王元素+李莉

摘 要 通過觀測19份野生白三葉形態(tài)指標，比較同一花序及不同海拔高度的貴州野生白三葉形態(tài)多樣性.結果表明：同一花序及不同海拔高度的貴州野生白三葉形態(tài)都存在較大差異；各指標總變異系數(shù)從大到小為中葉面積、地上生物量、匍匐莖長度、生長點數(shù)、株高、中葉長、中葉寬、生長習性、有無“V”斑；不同海拔區(qū)域白三葉形態(tài)形狀居群間存在不同程度的差異.進行聚類統(tǒng)計顯示分類與海拔高度沒有明顯的關系.

關鍵詞 喀斯特；貴州；白三葉；同一花序；形態(tài)多樣性

中圖分類號 S651 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2016）05-0038-06

Abstract By observing the shape index of 19 wild Trifolium repens， we compared the morphological diversity of the same inflorescence at different altitudes. Our results imply that the morphological diversity of 19 wild Trifolium repens on the same inflorescence at different altitudes has a markedly difference. The total coefficient variation of all above indices obeys the following order： leaf area>above-ground biomass>stolon length>growing point>height >leaf length>leaf width> growth habit>V shape stripe. Between different altitudes in Trifolium repens form shape in the group have difference degrees of variations. The clustering analysis found little correlation with the altitude origin.

Key words Karst region； Guizhou； Trifolium repens； the same inflorescence； morphological diversity

基因漂移、遺傳漂變、遺傳瓶頸、自然選擇和地方適應性等因素，可以通過在不同時空尺度上的動態(tài)變化來影響并改變生物適應性和多樣化的進程[1].目前，花粉污染、基因漂移等問題已經(jīng)在實驗中得到普遍證實，而大部分研究只是針對一些基礎性工作，如花粉傳播因素、基因漂移距離、雜交親和性等[2-5].空間分離群體之間的隔離和基因流動的程度決定了遺傳差異、生殖隔離和物種形成的潛在能力.遺傳漂變和自然選擇都會使群體之間的差異增加，而基因流的作用會使群體之間的差異減小[5].研究同一花序水平上植物形態(tài)多樣性，可以減少以上因素的影響，使其表型性狀與其生態(tài)適應性的研究更趨于一致.

白三葉（Trifolium repens L.）是多年生草本優(yōu)質牧草，屬異化授粉植物，廣泛分布于世界各地，在農牧業(yè)中地位重要.貴州是中國發(fā)育最典型的喀斯特地貌之一，不僅地勢起伏大、切割強、相對高度常達到300～700 m，且喀斯特廣泛發(fā)育，地貌類型較復雜.其次，貴州具有高原峽谷地貌結構特征，導致水土資源分布不平衡，形成了多種特殊的生態(tài)位.白三葉在長期的演化過程中，不斷向著適應其生境的方向進化.本研究收集貴州省境內19份白三葉種質為試驗材料，比較其不同海拔高度居群間和同一花序水平上的多樣性，為下一步選育優(yōu)質高效白三葉新品種提供指導.

1 材料和方法

1.1 貴州地理與氣候

試驗在貴州貴陽市貴州牧草推廣站溫室大棚內進行，種子收集于貴州省不同海拔區(qū)域.貴州全省大部分地區(qū)氣候溫和，四季分明.全省平均氣溫的最高值出現(xiàn)在7月，平均22～25 ℃；最低值出現(xiàn)在1月，平均為4～6 ℃；年平均氣溫為14～19 ℃.全年極端最高氣溫為34.0～36.0 ℃，極端最低氣溫為-6.0～-9.0 ℃.常年雨量充沛，時空分布不均.全省各地多年平均年降水量大部分地區(qū)為1 100～1 300 mm，最大值接近1 600 mm，最小值約為850 mm.一年中的大多數(shù)雨量集中在夏季.全省大部分地區(qū)年日照1 200～1 600 h，氣候特點是垂直方向差異較大，立體氣候明顯.

1.2 材料收集

2013年5～8月在全省范圍內采集野生白三葉種子，有效樣本19份，見表1.

1.3 栽培與觀測

1.3.1 溫室栽培 2014年9月20日在貴州省牧草推廣站溫室大棚播種.從19份材料中各選取一個果實飽滿的花序，將來自同一花序的種子播入有32個小格的育苗培養(yǎng)盤，孔穴大小60 mm×60 mm.每小格播2粒種子，覆土1 cm，澆水.培養(yǎng)基質為m（石英砂）∶m（細土）∶m（腐殖質）=3∶4∶3混合而成，高壓滅菌冷卻后裝盤.待長出小苗后留選長勢較好的一株苗用于觀察研究.

1.3.2 施肥和管理 每隔3個月施復合肥1次，每次施用量0.03 kg/m2，苗期施尿素1次，使用量折合0.012 kg/m2，及時除雜草，適時澆水.

1.3.3 測量指標 2015年5月1日，參照《牧草種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[6]及前人研究方法觀測V型斑紋、葉面積、株高、中葉寬、中葉長、匍匐莖長度、生長點個數(shù)及地上生物量等指標.為便于分析，將非量化性狀特征進行標準化賦值.海拔：1=1 000 m以下，2=1 000～1 500 m，3=1 500～2 000 m，4=2 000 m以上；有無V型斑：有斑=1，無斑=2；生長習性：1=直立生長，2=匍匐分枝生長，3=匍匐不分枝生長.

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，分析不同海拔高度區(qū)域白三葉種內、同一花序水平上各個性狀的差異程度.各形態(tài)變異性以變異系數(shù)CV表示，CV（%）=100×S/M（S為標準差，M為平均值）.用Person相關系數(shù)分析各個性狀之間的相關性，并對各個指標標準化后用算術平均法（UPGMA）聚類分析.

2 結果與分析

2.1 白三葉形態(tài)學分析

2.1.1 同一花序白三葉形態(tài)學性狀差異分析 同一花序水平上和不同種群間白三葉形態(tài)存在較大差異（表2）.總變異系數(shù)大于300%的有7個居群，其中W16總變異系數(shù)最大，高達429.74%，其次是W12，W1，W9，W6，W3，W10；最小的是W7，總變異系數(shù)為236.9%.各指標總變異系數(shù)從大到小為中葉面積、地上生物量、匍匐莖長度、生長點數(shù)、株高、中葉長、中葉寬、生長習性、有無“V”斑.株高變異系數(shù)最大的是W10和W18，分別為37.93%和37.51%，W2最小，只有12.63%.地上生物量變異系數(shù)最大的是W3和W1，分別為98.48%和81.67%，W14和W7的最小，為38.31%和38.55%.匍匐莖長度的變異范圍為30.95%～65.75%，變異系數(shù)最大和最小分別是W7和W3.中葉寬的變異范圍主要為10.89%～32.11%，只有居群W8的變異系數(shù)高達60.61%.中葉長的變異范圍為13.33%～32.77%，變異系數(shù)最大的為W16，最小為W7.中葉面積的總變異系數(shù)比其他指標大，其中W16，W12，W3和W6的變異系數(shù)均大于100%，最小的是W11，只有30.33%.生長習性的變異范圍為0～35.33%，其中W14，W18和W19的變異系數(shù)均為0，即這幾個居群都是匍匐分枝生長.有無“V”形斑中只有W1，W5，W11，W13和W19發(fā)生了變異，其余居群全都有“V”斑.生長點個數(shù)最大變異是W1，為64.09%，其次是W16，W9，W12和W10，最小的是W2，僅為0.75%.

2.1.2 不同海拔高度白三葉形態(tài)學數(shù)量性狀分析 不同海拔區(qū)域白三葉形態(tài)形狀居群間存在顯著差異，見表3.總體上，隨著海拔的提升，白三葉植株越來越高，生長點數(shù)越來越多，地上生物量也越來越大；而匍匐莖長度、中葉寬、中葉長和中葉面積則隨著海拔的提升而增大，高于2 000 m的區(qū)域則有所減小.在低于1 000 m的區(qū)域，匍匐莖長度的變異系數(shù)最大，高達102.87%，其次是地上生物量、中葉面積，最小的是中葉寬，僅為25.49%.在1 000～1 500 m區(qū)域，變異范圍為21.43%～80.46%，最大的為匍匐莖長度，其次是地上生物量、生長點個數(shù)、中葉面積，最小的是中葉寬.在1 500～2 000 m區(qū)域，變異范圍是21.29%～49.62%，其中變異最大的為地上生物量，其次是中葉面積，中葉寬變異最小.在大于2 000 m的區(qū)域，匍匐莖長度的變異系數(shù)最大，為61.37%，其次是地上生物量、中葉面積、株高，最小為中葉長，僅為23.21%.

2.2 形態(tài)學形狀相關性分析

白三葉的株高與地上生物量、匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積、生長習性及生長點數(shù)呈極顯著相關性（見表4），與有無“V”形斑和海拔高度無顯著相關；地上生物量與匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積及生長習性呈極顯著相關，與海拔高度呈顯著相關；匍匐莖長度與生長點數(shù)極顯著相關；中葉寬與中葉長、中葉面積、生長習性及生長點數(shù)呈極顯著相關；中葉長與中葉面積、生長點數(shù)及生長習性呈極顯著相關；中葉面積與生長習性及生長點數(shù)極顯著相關；生長習性與生長點數(shù)呈極顯著相關；生長點數(shù)與海拔呈極顯著相關性.即隨海拔的提高，地上生物量也隨之增大，生長習性有由直立生長到匍匐分枝到匍匐不分枝生長的趨勢.

2.3 基于白三葉形態(tài)性狀的聚類分析

根據(jù)貴州野生白三葉的形態(tài)鑒定數(shù)據(jù)進行聚類分析，在歐氏距離為14.5截距處，可將19份白三葉劃分為3個聚類（圖1），3個聚類性狀平均值見表5.第Ⅰ類包括8份材料，平均株高最矮，地上生物量、匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積和生長點數(shù)的平均值最小，只有少數(shù)無“V”形斑點；第Ⅱ類包括10份材料，其生長點數(shù)最多，其余性狀指標的平均值介于第Ⅰ、Ⅲ類之間，少數(shù)無“V”形斑點，大多是匍匐分枝生長；第Ⅲ類只有材料7（匯川區(qū)董公市鎮(zhèn)，987 m）獨自成一類，除匍匐莖長度最短外，生長點數(shù)介于第Ⅰ、Ⅱ類之間，全部有“V”形斑點，均匍匐分枝生長，其余形狀指標的平均值均大于第Ⅰ、Ⅱ類.由此可知，聚類分組與海拔高度沒有明顯的關系.

3 討論與結論

3.1 巖溶地區(qū)不同海拔野生白三葉同一花序形態(tài)多樣性

種質資源是生物遺傳變異和生物多樣性遺傳的物質基礎，運用形態(tài)學標記研究植物外部形態(tài)，受基因及所處生態(tài)環(huán)境的共同影響.目前，關于開花植物花序內變異原因的研究有很多[7]，有研究證明，對不同生態(tài)環(huán)境下的同種植物的形態(tài)學研究，可以了解環(huán)境對基因表達的影響[8]，而不同海拔區(qū)域帶來的環(huán)境差異會使各類昆蟲的活動受到限制或促進，導致不同海拔地區(qū)訪花者種類和訪問比例的差異[9].在同一花序水平上研究不同海拔區(qū)域白三葉表型特征，既可以減少基因漂移、花粉污染等外部影響，還可了解由海拔帶來的環(huán)境差異對其形態(tài)的影響，為下一步研究工作提供更精密的數(shù)據(jù).本研究結果顯示，貴州19份野生白三葉同一花序水平上總變異系數(shù)大于300%的有7個居群，其中W16總變異系數(shù)最大，無論是居群內還是居群間貴州白三葉形態(tài)差異都比新疆[10]白三葉的大；各指標中總變異系數(shù)為最大的是中葉面積，其次是地上生物量、匍匐莖長度、生長點數(shù)、株高，說明其可塑性較大.貴州因地勢起伏較大，生境復雜，蘊藏著豐富的野生植物資源，例如鐘理[11]發(fā)現(xiàn)貴州野生匐剪股穎各形態(tài)學性狀均存在較大的變異，形態(tài)遺傳變異多產生于居群內.本研究材料采集地間海拔跨度較大，小氣候類型多樣，生境差異明顯，為適應不同的生境，白三葉在長期的進化過程中，形態(tài)性狀也隨之改變.

3.2 巖溶地區(qū)同一花序野生白三葉的多樣性與育種

在育種工作中，借助部分表型性狀及其組合，可實現(xiàn)對白三葉目標性狀的有效選擇.本研究中不同海拔區(qū)域甚至同一花序白三葉栽培群體內都存在較豐富的遺傳變異，可塑性較大，可為優(yōu)良類型的選擇提供材料.目前，對白三葉形態(tài)農藝性狀已有較多研究，但主要集中在居群間和居群內水平上[10，12-13]，在花序水平上的研究還未見報道.目前分子生物學技術已成為植物育種研究的有效工具，如李潤芳[14]運用細胞學方法和SRAP分子標記技術對8種三葉草的種質資源遺傳多樣性進行了初步評價，張婧源[15]對來自30個國家的70份野生白三葉從表型性狀、SRAP分子標記和SSR分子標記上進行了不同產地白三葉種質資源遺傳多樣性研究.在花序水平上研究其形態(tài)多樣性，通過人工選育成的優(yōu)良品種經(jīng)濟性狀整齊、遺傳基因穩(wěn)定.因此，對白三葉進行優(yōu)良品種選育，最終建立良種繁育體系成為獲得質量穩(wěn)定、可控優(yōu)質白三葉的必經(jīng)之路.

3.3 巖溶地區(qū)貴州野生白三葉的利用價值和開發(fā)前景

貴州地處我國云貴高原，屬長江、珠江上游地區(qū)，是我國典型喀斯特區(qū)域之一，地理位置特殊，其生態(tài)環(huán)境的優(yōu)劣將直接影響整個長江、珠江流域的生態(tài)環(huán)境安全.目前，對喀斯特地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)植物恢復多集中在森林生態(tài)系統(tǒng)的恢復研究[16]，對喀斯特山地草地相關研究還比較少[17].對貴州野生白三葉種質資源進行研究，揭示喀斯特地區(qū)白三葉種質資源豐富度、多樣性、蘊藏量等特征，可為喀斯特石漠化地區(qū)草地植被恢復提供支持.本研究通過統(tǒng)計分析白三葉同一花序水平上形態(tài)多樣性，發(fā)現(xiàn)其可塑性較大，在育種工作中可利用差異較大的材料W16和W12作為親本培育優(yōu)質高效品種.還可利用白三葉進行礦山植被修復，有研究發(fā)現(xiàn)其能同時富集污染土壤中的銅、鎘、鉛，且富集量大[18]，是很好的礦山修復植被之一.此外，白三葉還是重要的優(yōu)質豆科牧草之一，影響當?shù)剞r牧業(yè)發(fā)展.因此，下一步將全面系統(tǒng)地調查和收集貴州、四川、廣西、新疆及云南等地區(qū)野生白三葉種質資源，增加其多樣性，為充分發(fā)揮白三葉資源的生態(tài)和經(jīng)濟效益提供支持.

參考文獻：

[1]韋祖生，田益農，馬崇熙. 作物基因漂移研究綜述[J]. 現(xiàn)代農業(yè)科技， 2011（13）：13-15.

[2]牟 彤. 白三葉化學誘變后代遺傳變異的研究[D].哈爾濱：東北農業(yè)大學， 2013.

[3]何 靜，陳瑞祥，劉秀峰. 俄羅斯白三葉在貴州南部的引種試驗初報[J]. 種子， 2013，32（3）：59-61.

[4]GUSTINE D L， HUFF D R. Genetic variation within and among white clover populations from managed permanent pastures of the Northeastern USA[J]. Crop Sci， 1999，39（2）：524-530.

[5]曲若竹，侯 林，呂紅麗，等. 群體遺傳結構中的基因流[J].遺傳，2004，26（3）：377-382.

[6]李志勇，王宗禮，師文貴，等.牧草種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M].北京：中國農業(yè)出版社， 2005.

[7]謝田朋，杜國禎，張格非，等. 黃帚橐吾種子生產的花序位置效應及其對幼苗建植的影響[J].植物生態(tài)學報， 2010，34（4）：418-426.

[8]苗佳敏，鐘金城，陳智華.披堿草屬種質資源研究現(xiàn)狀[J].草業(yè)與畜牧， 2007，27（11）：2222-2227.

[9]段元文，張挺峰，劉建全.山莨菪（茄科）的傳粉生物學[J].生物多樣性， 2007，15（5）：584-591.

[10]王玉祥，張 博. 新疆野生白三葉表型性狀變異研究[J]. 草地學報， 2012，20（6）：1163-1168.

[11]鐘 理. 貴州野生匍匐剪股穎種質資源遺傳多樣性及越夏生理動態(tài)研究[D].成都：四川農業(yè)大學， 2008.

[12]李 州，彭 燕，張婧源，等.白三葉種質資源形態(tài)變異與地理起源的關系[J].草業(yè)科學， 2012，29（11）：1706-1714.

[13]王建麗，申忠寶，潘多鋒，等. 白三葉種質資源主要數(shù)量性狀的變異與相關性研究[J]. 中國農學通報， 2012，28（26）：19-23.

[14]李潤芳.三葉草的細胞學、分子標記及多倍體誘導研究[D].武漢：華中農業(yè)大學， 2007.

[15]張婧源.世界范圍野生白三葉種質資源的遺傳多樣性研究[D].成都：四川農業(yè)大學， 2013.

[16]魏 媛，張金池，俞元春，等.貴州高原退化喀斯特森林恢復過程中土壤微生物生物量碳、微生物熵的變化[J]. 農業(yè)現(xiàn)代化研究， 2009，30（4）：487-490.

[17]張 文，張建利，莫本田，等. 喀斯特山地草地植物群落物種數(shù)量特征及多樣性分析[J]. 生態(tài)環(huán)境學報， 2011，（5）：849-854.

[18]況 武，田偉莉，高全喜. 白三葉在銅、鎘、鉛復合污染土壤修復上的應用[J]. 能源工程， 2012（6）：53-56.

（編輯 WJ）