寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白的提取及抗凍活性的檢測

陳鳳蓮,鮑 歡,曲 敏,劉羽佳,孫兆國,李凌俐,趙 旭

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

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寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白的提取及抗凍活性的檢測

陳鳳蓮,鮑 歡,曲 敏,劉羽佳,孫兆國,李凌俐,趙 旭

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

以東農(nóng)冬麥1號寒地冬小麥面粉為原料,利用磷酸鹽緩沖溶液結(jié)合冰提法提取寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白,通過單因素和響應(yīng)曲面實驗,得到提取寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白的最佳工藝為:料液比1∶15,磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mol/mL,pH7.8,攪拌時間2 h,冰球用量10個,冰提時間2 min,冰提溫度-10 ℃,在此條件下對寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液進行復(fù)提,復(fù)提三次得到寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白,提取率為18.2%。將寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白進行濃縮,制成凍干粉,復(fù)溶至5%,對其進行冰晶觀察,檢測寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性,結(jié)果顯示,寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)溶液冰晶排列整齊,形態(tài)各異,具有很好的抗凍活性。將其應(yīng)用到冷凍面團中,面團品質(zhì)得到了較好的改善。

高寒冬小麥,冰提,冰結(jié)構(gòu)蛋白,冰晶

冰結(jié)構(gòu)蛋白(Ice Structuring Proteins,ISPs),又稱為抗凍蛋白、不凍蛋白(Antifreeze Protein,AFP),廣泛地分布于各類有機體中,如魚類、昆蟲、動物、植物、細菌和真菌等[1-5]。冰結(jié)構(gòu)蛋白具有三大特性[6]:一是ISPs具有非依數(shù)性降低冰點的抗凍活性,主要表現(xiàn)在ISPs可以影響結(jié)冰過程,而不影響熔化過程;二是ISPs具有抑制冰晶生長的作用,而且該作用在冰晶的不同方向上強弱是不同的,冰晶形態(tài)檢測的方法,適用于定性檢測。張超等[7]發(fā)現(xiàn)冬小麥麩皮中存在ISPs,并進一步對冬小麥麩皮抗凍蛋白(TaISPs)進行分離純化,研究其理化性質(zhì)、一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu),并以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),探討TaISPs與冰晶的結(jié)合方式,揭示其抗凍機理。本實驗采用黑龍江省黑河地區(qū)種植的東農(nóng)冬麥1號寒地冬小麥面粉為原料,利用ISPs可吸附在冰晶表面的性質(zhì),采用改進的冰結(jié)合磷酸鹽緩沖溶液法提取寒地冬小麥ISPs,對其進行冰晶形態(tài)的觀察,檢測其是否具有抗凍活性。將寒地冬小麥ISPs添加到冷凍面團中,考察對冷凍面團質(zhì)地的影響。我國冬小麥種植地區(qū)生態(tài)條件具有多樣性,東農(nóng)冬麥1號寒地冬小麥種植于在我國黑龍江省東北部(45度-47度),高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),耐寒性極強。對寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白的研究,旨在拓寬寒地冬小麥的開發(fā)利用,為我國小麥育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東農(nóng)冬麥1號寒地冬小麥面 粉由綠禾農(nóng)產(chǎn)品種植合作社提供;考馬斯亮藍G250 美國Sigma公司;磷酸二氫鈉 分析純,天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司;磷酸氫二鈉 分析純,天津市致遠化學(xué)試劑有限公司。

UV-5100B紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;FDU-1200型冷凍干燥機 日本東京理化;Z366高速大容量臺式離心機 德國哈默公司;DM750生物顯微鏡 瑞士萊卡顯微系統(tǒng)有限公司;TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 寒地冬小麥蛋白質(zhì)含量的測定 參照GB/T5511-2008測定寒地冬小麥蛋白質(zhì)的含量。

1.2.2 冰提寒地冬小麥蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍法。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用考馬斯亮藍比色法。配制牛血清白蛋白100 ug/mL,分別精確吸取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,分別加蒸餾水至1 mL,然后在各支試管中分別加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250溶液、搖勻,在595 nm波長處測吸光度。后以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制曲線。

1.2.2.2 冰提寒地冬小麥蛋白提取率的測定

式中:M1為冰提后寒地冬小麥蛋白質(zhì)量;M2為磷酸鹽緩沖溶液提取的寒地冬小麥蛋白質(zhì)量。

1.2.3 寒地冬小麥ISPs的提取

1.2.3.1 冰球的制備 冰球為統(tǒng)一規(guī)格的玻璃珠放入冰格板中加水冰凍而成。冰球直徑約為2 cm。

1.2.3.2 提取方法 稱取5份3 g寒地冬小麥面粉,分別與不同濃度,不同pH,不同料液比的磷酸鹽緩沖溶液混合攪拌,在室溫條件下提取不同時間。然后用離心機以2000 r/min離心15 min,取離心后的上清液并記錄溶液體積,取1 mL上清液用蒸餾水稀釋100倍后加入5 mL考馬斯亮藍測其分光光度值。而后將剩余液體加入提前凍好的不同數(shù)量的冰球,放入-10 ℃的冰箱中,冰提2 min待冰球表面吸附的ISPs達到飽和,將冰球取出,置于室溫下自然融化,測其分光光度值。

1.2.4 單因素實驗設(shè)計

1.2.4.1 磷酸鹽緩沖溶液料液比對冰提寒地冬小麥ISPs提取的影響 在磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mol/mL,pH7.8,攪拌時間2 h,冰球用量10個,冰提時間2 min,冰提溫度-10 ℃時,以不同的料液比:1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,按上述方法進行單因素實驗,研究磷酸鹽緩沖溶液料液比對寒地冬小麥ISPs提取的影響。

1.2.4.2 磷酸鹽緩沖溶液濃度對寒地冬小麥ISPs提取的影響 在料液比1∶15,pH7.8,攪拌時間2 h,冰球用量10個,冰提時間2 min,冰提溫度-10 ℃時,添加不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液:6、8、10、12、14 mol/mL,按上述方法進行單因素實驗,研究磷酸鹽緩沖溶液濃度對寒地冬小麥ISPs提取的影響

1.2.4.3 磷酸鹽緩沖溶液pH對寒地冬小麥ISPs提取的影響 在料液比1∶15,磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mol/mL,攪拌時間2 h,冰球用量10個,冰提時間2 min,冰提溫度-10 ℃時,改變磷酸鹽緩沖溶液的pH7.2、7.4,、7.6,、7.8,、8.0,按上述方法進行單因素實驗,研究磷酸鹽緩沖溶液pH對寒地冬小麥ISPs提取的影響。

1.2.4.4 攪拌時間對寒地冬小麥ISPs提取的影響 在料液比1∶15,磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mol/mL,pH7.8,冰球用量10個,冰提時間2 min,冰提溫度-10 ℃時,以不同的攪拌時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,按上述方法進行單因素實驗,研究攪拌時間對寒地冬小麥ISPs提取的影響。

1.2.4.5 冰球數(shù)量對寒地冬小麥ISPs提取的影響 在料液比1∶15,磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mol/mL,pH7.8,攪拌時間2 h下進行提取后,向42 mL左右粗蛋白(磷酸鹽緩沖溶液提取)溶液中分別加入規(guī)格相同的6、8、10、12、14個冰球,冰提時間2 min,冰提溫度-10 ℃,按上述方法進行單因素實驗,研究冰球數(shù)量對寒地冬小麥ISPs提取的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理,以寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值,在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,綜合考慮選擇磷酸鹽緩沖溶液濃度、料液比、pH 3個因素進行響應(yīng)面實驗設(shè)計,見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平

1.2.6 復(fù)提寒地冬小麥ISPs 根據(jù)單因素實驗和響應(yīng)曲面實驗,確定寒地冬小麥ISPs提取的最佳實驗工藝條件,在最佳工藝條件下,對寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白進行復(fù)提(對磷酸鹽緩沖溶液提取后的粗蛋白溶液重復(fù)三次冰提),計算寒地冬小麥ISPs提取率。

1.2.7 寒地冬小麥蛋白冰晶形態(tài)觀察 在最佳工藝條件下,復(fù)提寒地冬小麥ISPs溶液,將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后,冷凍干燥成凍干粉,將凍干粉用磷酸鹽緩沖溶液進行復(fù)溶,復(fù)溶至濃度5%,在顯微鏡下,觀察高寒ISPs溶液的冰晶形態(tài)。并以水、3%蔗糖溶液和3%復(fù)溶溶液進行對照。

1.2.8 添加寒地冬小麥ISPs對冷凍面團的影響 稱取2份50 g普通高筋粉,加入等比例的水制作成面團,分別標(biāo)為空白組,實驗組。其中空白組為不添加寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白的面團,實驗組為以面粉為100%加入1%的寒地冬小麥冰結(jié)構(gòu)蛋白凍干粉,冷凍48 h以上,利用Brabender物性儀對其進行檢測,并進行三次平行實驗。測定方式:T.P.A;探頭:P/50;測試前速率:2.00 mm/s;測試中速率:1.00 mm/s;測試后速率:1.00 mm/s;壓縮程度:50%;力度:100 g;停留間隔:5 s;數(shù)據(jù)采集速率:200 pps。從質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)當(dāng)中選取硬度、黏附性、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性指標(biāo)進行評價[8-10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert軟件進行三因素三水平Box-Behnken實驗設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 寒地冬小麥面粉的蛋白含量

寒地冬小麥面粉的蛋白含量為12.25%。

2.2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:y=0.0098x+0.1244,R2=0.9955,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性良好。將測量的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計算蛋白質(zhì)含量。

圖1 牛血清蛋白溶液Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

2.3 寒地冬小麥提取ISPs的單因素實驗結(jié)果

2.3.1 磷酸鹽緩沖溶液料液比對ISPs提取的影響 料液比1∶10時,寒地冬小麥ISPs不能被充分提取,提取率較低。料液比在1∶15時,寒地冬小麥ISPs被磷酸鹽緩沖溶液充分提取,提取率最大,達到10.49%。料液比達到1∶20時,由于緩沖液過多,提取率逐漸下降。料液比的最佳范圍為1∶10～1∶20。

圖2 料液比對ISPs提取的影響Fig.2 Effect of solid/solvent ratio on antifreeze protein extraction

2.3.2 磷酸鹽緩沖溶液濃度對ISPs提取的影響 緩沖液濃度在6 mol/mL時,由于緩沖液濃度較低,冰提寒地冬小麥ISPs不能被充分溶出。緩沖液濃度升高到10 mol/mL時,寒地冬小麥ISPs的提取率達到最高9.86%。之后,由于緩沖液濃度的升高,影響了寒地冬小麥ISPs的溶出,提取率隨之下降。因此,磷酸鹽緩沖液濃度的最佳范圍8～12 mol/mL。

圖3 緩沖液濃度對ISPs提取的影響Fig.3 Effect of buffer concentration on antifreeze protein extraction

2.3.3 磷酸鹽緩沖溶液pH對ISPs提取的影響 緩沖液pH=7.2到7.8時,寒地冬小麥ISPs提取率逐漸升高,在pH=7.8時,ISPs提取率達到最大11.57%,但在pH達到8時,ISPs提取率明顯下降。說明最佳提取pH范圍為7.6～8。

圖4 緩沖液pH對ISPs提取的影響Fig.4 Effect of pH on antifreeze protein extraction

2.3.4 攪拌時間對ISPs提取的影響 攪拌時間達到0.5 h后,隨著攪拌時間的增加,寒地冬小麥ISPs的提取率逐漸升高。到達2 h時,ISPs提取率達到10.23%,之后,繼續(xù)增加攪拌時間,ISPs的提取率趨于穩(wěn)定,說明寒地冬小麥ISPs充分溶出。所以,最佳的攪拌時間為2 h。

圖5 攪拌時間對ISPs提取的影響Fig.5 Effect of stirring time on antifreeze protein extraction

2.3.5 冰球數(shù)對ISPs提取的影響 隨著冰球數(shù)量的增加,冰球吸附的ISPs越多,ISPs的提取率越高。冰球數(shù)量達到10個時,寒地冬小麥ISPs的提取率達到10.92%。之后,繼續(xù)增加冰球數(shù)量,由于冰球不能完全被緩沖溶液提取的粗蛋白溶液覆蓋,寒地冬小麥ISPs提取率逐漸下降。所以,10個冰球為最優(yōu)條件。

圖6 冰球數(shù)量對ISPs提取的影響Fig.6 Effect of number of ice ball on antifreeze protein extraction

2.4 提取最佳工藝條件的確定

通過單因素方差分析,得到因素對寒地冬小麥ISPs提取率的影響程度大小順序為:料液比>磷酸鹽緩沖溶液濃度>pH>冰球數(shù)量>提取時間,故最佳提取工藝條件優(yōu)化時,選擇影響程度最大的3個因素。根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理,選擇料液比、磷酸鹽緩沖溶液濃度、pH 3個因素,采用三因素三水平的響應(yīng)分析方法求取優(yōu)化的工藝參數(shù),實驗設(shè)計和結(jié)果見表2、表3。實驗次數(shù)為17次,其中析因部分實驗次數(shù)為12,中心點重復(fù)實驗次數(shù)為5。利用 Design Expert 軟件對表2的實驗結(jié)果進行二次多元回歸擬合,并進行方差分析,結(jié)果見表3。對響應(yīng)值與各因素進行回歸擬合后,得到的寒地冬小麥冰ISPs提取率(Y)對編碼自變量的回歸模型表達式。

Y=9.53+0.034A-0.17B+0.44C-0.063AB+1.28AC+0.15BC+0.64A2+0.12B2-0.36C2

表2 響應(yīng)面實驗分析方案及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

從表3可知,此模型顯著(p<0.01,A、B、C、AC、A2、B2對寒地冬小麥ISPs提取率有顯著影響。模型失擬項(p=0.0549,不顯著),說明該回歸模型對實驗結(jié)果擬合較好,回歸方程整體模型極顯著,并且失擬項不顯著,表明該回歸模型與實測值能較好地擬合。因此可利用該回歸模型對實驗結(jié)果進行分析,并確定寒地冬小麥ISPs的最優(yōu)提取工藝。各因素的F值可以反映出各因素對實驗指標(biāo)的重要性,F值越大,表明對實驗指標(biāo)的影響越大。從方差分析結(jié)果可知:F(A)=43.50,F(B)=30.65,F(C)=68.96,即各因素對寒地冬小麥ISPs提取率的影響程度大小順序為:pH>磷酸鹽緩沖溶液濃度>料液比。

為了考察交互項對冬小麥ISPs提取率的影響,在其他因素條件固定不變的情況下,考察交互項對ISPs提取率的影響,對模型進行降維分析。經(jīng)Design Expert7.0軟件分析,得到隨著因素的增大,響應(yīng)值逐漸減小或不再增大。在交互項對蛋白提取率的影響中,磷酸鹽緩沖液濃度和pH交互作用對提取率的影響顯著,其次是pH和料液比交互作用,影響最小的是磷酸鹽緩沖液濃度與料液比交互作用。經(jīng)過軟件分析,得到最優(yōu)提取條件為料液比1∶15,磷酸鹽緩沖液濃度為10.45 mol/mL,pH7.82。得到的蛋白提取率為11.84%。選取最佳工藝條件:料液比1∶15,磷酸鹽緩沖液濃度為10 mol/mL,pH7.8,經(jīng)過3次平行實驗,得到的蛋白提取率為11.78%,稍低于實驗的設(shè)計值,但接近于最優(yōu)提取條件的預(yù)測值,實驗值與預(yù)測值相符合。

2.5 復(fù)提寒地冬小麥蛋白質(zhì)

在最佳提取工藝條件下,對緩沖溶液提取的寒地冬小麥粗蛋白溶液重復(fù)三次冰提,得到寒地冬小麥蛋白質(zhì)提取率為18.2%。

2.6 寒地冬小麥ISPs的冰晶觀察

ISPs具有抑制冰晶生長的作用,而且該作用在冰晶的不同方向上強弱是不同的,因而引起冰晶形態(tài)的改變。在電子顯微鏡下,放大40倍進行觀察,純水中,冰晶形狀為大的圓形,由圖7可以看出,寒地冬小麥ISPs溶液的冰晶形態(tài)大多呈水滴形和小圓形,分布均勻,也出現(xiàn)多邊形,短棒形甚至線性,冰晶形態(tài)理想。由圖8可以看出,水的冰晶呈大圓泡型,排列致密;蔗糖溶液的冰晶數(shù)量多,體積小,形態(tài)單一,呈小圓形,排列較緊密?？梢?寒地冬小麥ISPs對冰晶生長的抑制及對冰晶的形態(tài)修飾作用顯著。Yang等[11]認(rèn)為冰結(jié)構(gòu)蛋白的這種作用,可以在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)胞外冰晶的生長形態(tài),避免冰晶對細胞膜造成機械損傷。由此,冰提法提取的寒地冬小麥蛋白具有較好的抗凍活性,為冰結(jié)構(gòu)蛋白。

圖7 5%高寒冬小麥ISPs溶液冰晶形態(tài)Fig.7 Ice crystal morphology of 5% alpine winter wheat ISPs注：A:水滴形和小圓形;B:水滴形和線形;C:多邊形;D:小圓形和短棒形;E:線形。

圖8 高寒冬小麥ISPs溶液與蔗糖溶液、及水的冰晶形態(tài)對比Fig.8 Ice crystal morphology of alpinewinter wheat ISPs contrast to sugar solution and water注：A：3%蔗糖溶液；B：水； C：3%高寒冬小麥ISPs溶液。

2.7 添加寒地冬小麥ISPs對冷凍面團的影響

潘振興[12]等通過采用質(zhì)構(gòu)分析儀、掃描電鏡以及冷凍面團烘焙發(fā)酵實驗法研究了ISPs對長期凍藏冷凍面團抗凍發(fā)酵特性與超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ISP可以顯著保護冷凍面團超微結(jié)構(gòu)。Zhang[13]等研究了抗凍蛋白對冷凍面團質(zhì)地特性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加抗凍蛋白的實驗組冷凍面團的硬度比空白組更加柔軟和穩(wěn)定。本實驗從質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)當(dāng)中選取硬度、黏附性、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性等指標(biāo)對空白組和實驗組進行比較,結(jié)果見圖9,圖10。

圖9 硬度、黏附性、咀嚼性的變化Fig.9 The change of hardness,adhesion and chewiness

圖10 彈性、內(nèi)聚性的變化Fig.10 The change of elasticity and cohesion

未添加ISPs的面團由于經(jīng)過冷凍過程,使面筋質(zhì)量變差,內(nèi)部組織變硬,所以面團硬度升高,咀嚼性和內(nèi)聚性增加,彈性下降,經(jīng)過緩凍后面團表面黏附性增加。而添加了寒地冬小麥ISPs的面團,由于其能夠改變冰晶形態(tài),影響面團中淀粉和蛋白質(zhì)的凝膠性、持水性等,從而影響面團的質(zhì)構(gòu)特性。使面團的硬度、黏附性、咀嚼性和內(nèi)聚性有所下降,彈性有所提高,面團的品質(zhì)得到了明顯改善。因此,寒地冬小麥抗凍蛋白能夠提高冷凍面團的抗凍性。

3 結(jié)論

在最佳工藝條件:料液比1∶15,磷酸鹽緩沖溶液濃度為10 mol/mL,pH7.8,攪拌時間2 h,冰球用量10個,冰提時間2 min,冰提溫度-10 ℃,提取后復(fù)提,得到寒地冬小麥ISPs的提取率為18.2%。對寒地冬小麥ISPs進行冰晶形態(tài)的觀察,得到小圓形,三角形,橢圓形,四邊形,五邊形和六邊形的冰晶結(jié)構(gòu),并且冰晶分布均勻,可知寒地冬小麥ISPs具有抗凍活性。將寒地冬小麥ISPs加入到冷凍面團中,經(jīng)物性儀檢測,冷凍面團品質(zhì)得到了改善。

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Extraction of apine winter wheat antifreeze protein and detection of the antifreeze activity

CHEN Feng-lian,BAO Huan,QU Min,LIU Yu-jia,SUN Zhao-guo,LI Ling-li,ZHAO Xu

(Key Laboratory for Food Science and Engineering of HeiLongjiang Province,College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

Supposing alpine winter wheat as raw material,antifreeze protein extracted from alpine winter wheat by phosphate buffer solution and ice process. Though single factor and response surface test,we concluded that the best process conditions of alpine winter wheat antifreeze protein was:the material liquid ratio was 1∶15,concentration of phosphate buffer solution was 10 mol/mL,pH was 7.8,stirring time was 2 h,ice hockey was 10,ice time was 2 min,the ice temperature was-10 ℃. Under this condition the extraction yield of antifreeze protein from alpine winter wheat was 18.2%. After extraction of antifreeze protein from alpine winter wheat,producing into freeze drying,and redissolving into 5%,its ice crystals observed to detect the antifreeze activity of alpine winter wheat protein. According to the results,the ice crystals were in order forms,and have good antifreeze activity. Applying to the frozen dough,it could improve the quality of frozen dough.

alpine winter wheat;ice process;ice structure protein;ice crystal

2015-09-10

陳鳳蓮(1975-)，女，博士，副教授，主要從事生物技術(shù)在糧食谷物精深加工方面的應(yīng)用研究，E-mail：finesxm@163.com。

黑龍江省自然科學(xué)基金項目(C2011-24)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12511128)；黑龍江省博士后科研啟動基金項目(LBH-Q13098)。

TS255.3

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1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000