殼聚糖與果膠復(fù)合作用研究及顯微觀察

張立彥,劉小芳,李作為

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,食品與生物工程系,廣東廣州 510300)

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殼聚糖與果膠復(fù)合作用研究及顯微觀察

張立彥,劉小芳,李作為

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,食品與生物工程系,廣東廣州 510300)

探討了殼聚糖和果膠特性、加量配比、溶液pH及聚合物濃度對(duì)殼聚糖與果膠復(fù)合溶液濁度、ζ-電位的影響,并結(jié)合觀察復(fù)合物的顯微狀態(tài)研究其影響機(jī)制及殼聚糖/果膠的靜電復(fù)合過程。結(jié)果表明,適當(dāng)分子量的殼聚糖(15萬)更易與果膠形成大顆粒的復(fù)合物,殼聚糖脫乙酰度對(duì)溶液濁度的影響不大;高酯果膠易與殼聚糖形成結(jié)構(gòu)緊密的復(fù)合物;隨果膠加量升高,復(fù)合物顯微結(jié)構(gòu)從松散、稀疏變?yōu)橹旅?溶液濁度也呈現(xiàn)4階段變化;當(dāng)果膠加量在82%(w/w)左右時(shí)復(fù)合物顆粒ζ-電位為0,但對(duì)應(yīng)的溶液濁度并不是最高;殼聚糖及果膠在溶液pH3.0～4.0之間最易發(fā)生靜電復(fù)合并形成結(jié)構(gòu)均勻、細(xì)密的復(fù)合物,溶液濁度也較高;由于聚合物濃度影響了分子鏈的伸展及靜電復(fù)合,使得復(fù)合物結(jié)構(gòu)明顯不同。

殼聚糖,果膠,靜電復(fù)合,顯微觀察

目前,雖然已有關(guān)于殼聚糖/果膠復(fù)合條件的探索以及形成的PEC特性(pH敏感性、溶脹特性及藥物釋放特性)研究[7-8,12],但缺乏對(duì)各條件影響作用的深入探討,因此對(duì)殼聚糖與果膠的復(fù)合作用機(jī)制或過程仍知之甚少,直接影響了PEC的制備和應(yīng)用。鑒于此,本文針對(duì)殼聚糖/果膠PEC制備過程中各條件對(duì)復(fù)合物溶液濁度、ζ-電位等的影響,結(jié)合顯微觀察,深入探討其影響作用,以期為殼聚糖/果膠PEC的制備和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高酯果膠 Sigma-Aldrich公司,P9135-100G,分子量為4萬,酯化度>74.0%;低酯果膠 衢州果膠公司,酯化度<30%,分子量為4萬;殼聚糖 奧興生物有限公司,分子量分別為5、15、25和35萬(脫乙酰度大致相同),脫乙酰度分別為76.5%和83.6%(分子量大致相同);其他所有化學(xué)試劑 均為分析純。

PHS-25型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;752型紫外-可見分光光度計(jì) 上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司;Nano-ZS MPT-2電位儀 英國馬爾文公司;CX31型電子顯微鏡 奧林巴斯(廣州)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖/果膠復(fù)合溶液的制備及測定

1.2.1.1 殼聚糖、果膠特性對(duì)溶液復(fù)合的影響 常溫下進(jìn)行。分別配制0.5%、pH4.0的殼聚糖(分子量分別為5、15、25和35萬及脫乙酰度為76.5%和83.6%的6種殼聚糖)和果膠酸性溶液,并緩慢攪拌過夜。取2 mL殼聚糖溶液置于小燒杯中,邊攪拌邊滴加入不同體積的果膠溶液,殼聚糖溶液始終保持2 mL不變,按殼聚糖∶果膠體積比=2∶0、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入果膠溶液(對(duì)應(yīng)的果膠加量分別為0、9.1%、11.1%、14.3%、20%、25%、33.3%、50%、66.7%、80%、85.7%、88.9%、90.9%、92.3%、93.3%、94.1%、100%,文中果膠的加量是指果膠質(zhì)量占?xì)ぞ厶恰⒐z總質(zhì)量之和的百分比),使之與殼聚糖溶液通過復(fù)凝聚法形成殼聚糖/果膠復(fù)合溶液,加入果膠溶液之前補(bǔ)充一定體積pH4.0的醋酸緩沖液,使復(fù)合溶液最終體積達(dá)到20 mL,混勻后放置24 h使充分復(fù)合,之后測定殼聚糖分子量和脫乙酰度、果膠酯化度及其加量對(duì)殼聚糖/果膠復(fù)合溶液濁度、ζ-電位及顯微結(jié)構(gòu)的影響,并根據(jù)結(jié)果選擇適宜的條件。

1.2.1.2 pH對(duì)溶液復(fù)合的影響 根據(jù)前續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用殼聚糖分子量15萬、高酯果膠(加量為80%)進(jìn)行pH對(duì)殼聚糖/果膠復(fù)合溶液影響的實(shí)驗(yàn),對(duì)不同pH條件、濃度為0.5%的殼聚糖和果膠溶液進(jìn)行復(fù)合,對(duì)殼聚糖/果膠復(fù)合溶液的濁度、ζ-電位及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定與觀察。

1.2.1.3 濃度對(duì)溶液復(fù)合的影響 選用殼聚糖分子量15萬、高酯果膠(加量80%)、pH3.5進(jìn)行殼聚糖及果膠濃度對(duì)復(fù)合物溶液影響的實(shí)驗(yàn),對(duì)不同濃度(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)條件下殼聚糖/果膠復(fù)合溶液的濁度及顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定和觀察。

1.2.2 濁度的測定 樣品在測定濁度前需用高速渦旋儀振動(dòng)、混勻10 s,以使混合均勻,然后于420 nm處測定不同配比殼聚糖/果膠復(fù)合溶液透光度的變化,并按以下公式計(jì)算濁度。

濁度的計(jì)算公式如下:

其中,L為光程長度(cm),It為投射光強(qiáng)度,I0為入射光的強(qiáng)度。

1.2.3 ζ-電位的測定 將由1.2.1制備得到的不同配比的殼聚糖/果膠復(fù)合溶液稀釋10倍,用漩渦振蕩器充分震蕩(5～10 s)后,用注射器吸取1 mL樣品注射到彎曲式毛細(xì)管樣品池,注意避免有氣泡,采用標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)進(jìn)行測量,每個(gè)樣至少測定2次。

1.2.4 顯微觀察 采用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照溶液中復(fù)合物的狀態(tài)。用滴管吸取1滴混勻的樣品,置于載玻片上,再將蓋玻片輕放于樣品上,并在40倍下觀察,選擇復(fù)合物中最具代表性的片段進(jìn)行拍照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每組進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),使用Office 2007中的Excel軟件進(jìn)行圖表整理與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖、果膠特性及配比對(duì)復(fù)合液的影響

圖1 殼聚糖分子量、果膠加量及其酯化度對(duì)復(fù)合物溶液濁度的影響Fig.1 The influence of chitosan molecular weight volume,pectin content and the esterification degree on the compound solution turbidity

從圖1還可以看出,當(dāng)殼聚糖的加量一定時(shí),隨著果膠加入量增加,溶液濁度發(fā)生四個(gè)階段的變化:在果膠加量為0～20%(w/w)時(shí),溶液濁度隨果膠加量的增加變化緩慢;當(dāng)果膠加量在20%～85%時(shí),溶液濁度隨果膠加量線性增加;當(dāng)果膠加量在85%～93.3%左右時(shí),溶液濁度急劇上升,表明此加量范圍內(nèi)大顆粒復(fù)合物大量形成;而當(dāng)果膠加量>93.3%后,溶液濁度則稍有下降,說明復(fù)合物粒度下降,對(duì)光的散射能力減弱[14]。出現(xiàn)上述變化可能是由于殼聚糖與不同濃度果膠形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)不同,對(duì)光的散射性質(zhì)不同,導(dǎo)致宏觀性質(zhì)(濁度)產(chǎn)生差異。

圖2 殼聚糖脫乙酰度對(duì)復(fù)合物溶液濁度的影響Fig.2 The influence of chitosan degree on the on the compound solution turbidity

圖3 果膠加量對(duì)復(fù)合物ζ-電位的影響Fig.3 The influence of pectin contenton compound solution ζ-electric potential

與圖1對(duì)比可以發(fā)現(xiàn),復(fù)合物溶液濁度最大時(shí)果膠的加量(93.3%)超過電中性時(shí)的(82%),此時(shí)果膠過量而復(fù)合物表面呈負(fù)電性。這可能是因?yàn)檫^量的果膠在殼聚糖與果膠形成的“初始”(primary)復(fù)合物顆粒表面橋連,形成更大的復(fù)合物。當(dāng)果膠的量超過一定的量(>93.3%),由于PEC表面的負(fù)電性太強(qiáng),致使大的顆粒發(fā)生解離,溶液濁度下降[13-15](圖1)。

圖4 不同果膠酯化度及加量對(duì)殼聚糖/果膠復(fù)合物微觀狀態(tài)的影響Fig.4 The influence of different pectin esterification and content on chitosan/pectin polymer microscopic state注:a代表加入低酯果膠,b代表加入高酯果膠;殼聚糖分子量15萬,放大倍數(shù)為40倍。

2.1.4 果膠酯化度及加量對(duì)復(fù)合物顯微結(jié)構(gòu)的影響 由圖4可知,果膠酯化度及加量不同,即殼聚糖與果膠的配比不同,所形成的復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)差別明顯。當(dāng)果膠加量較低(33.3%)時(shí),顯微觀察到溶液中僅有微小、散亂的枝狀物體,表明此時(shí)復(fù)合物少而松散,高酯果膠形成的復(fù)合物稍多,結(jié)構(gòu)稍明顯;當(dāng)果膠加量達(dá)到66.7%后,大量復(fù)合物形成,低酯果膠形成的復(fù)合物均勻分散,而高酯果膠卻與殼聚糖形成了較致密、但仍均勻的結(jié)構(gòu);當(dāng)果膠加量達(dá)到85.7%后,雖然低酯果膠形成的復(fù)合物仍相對(duì)均勻,但有些部位開始出現(xiàn)較致密的線狀結(jié)構(gòu),高酯果膠形成的復(fù)合物更致密些,說明此時(shí)兩種聚合物分子結(jié)合緊密;果膠加量進(jìn)一步提高到90.9%,復(fù)合物結(jié)構(gòu)變得清疏,尤其是高酯果膠與殼聚糖形成的復(fù)合物呈現(xiàn)出明顯的線狀結(jié)構(gòu),果膠的毛發(fā)狀側(cè)鏈伸展,帶有一定的剛性,這可能是由于果膠過量,復(fù)合物帶負(fù)電荷,分子鏈上的靜電斥力使得復(fù)合物鏈狀結(jié)構(gòu)伸展,剛性增強(qiáng),而低酯果膠形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)則較彎曲柔順;當(dāng)果膠加量增加到93.3%后,復(fù)合物線狀結(jié)構(gòu)明顯,且盡量伸展,尤其是高酯果膠參與形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)纏結(jié),鏈段粗厚,表現(xiàn)出更強(qiáng)的剛性和張力;當(dāng)果膠加量達(dá)到94.1%后,復(fù)合物主鏈變細(xì),且相互分離,說明鏈段之間的靜電斥力作用非常強(qiáng),使得復(fù)合物分子離散。

結(jié)合復(fù)合物濁度、ζ-電位隨殼聚糖/果膠配比的變化以及復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)(圖1、圖3、圖4),可以闡述殼聚糖與果膠的復(fù)合過程如下:在果膠加量較少時(shí)(<20%),少量的果膠分子通過-COO--+H3N靜電作用分散結(jié)合在殼聚糖長鏈上,復(fù)合物粒子非常小,結(jié)構(gòu)松散,量也較少,所以溶液濁度較低;隨著果膠加量增加,復(fù)合物形成的量越來越多,粒度逐漸增加,對(duì)光的散射能力增強(qiáng),溶液濁度逐漸增加,直至達(dá)到靜電平衡(ζ-電位為0,果膠加量82%左右),此時(shí)復(fù)合物顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)較均勻、致密;其后,隨著果膠加量增加,過量的果膠將已形成的復(fù)合物通過橋連,形成更粗、更長、更復(fù)雜的復(fù)合物;當(dāng)果膠的量超過93%后,復(fù)合物鏈段之間的靜電斥力作用強(qiáng),復(fù)合物分子離散,與圖1中的濁度下降相對(duì)應(yīng)。

2.2 溶液pH對(duì)殼聚糖與果膠復(fù)合作用的影響

2.2.1 pH對(duì)溶液濁度的影響 由圖5可知,pH對(duì)復(fù)合物溶液的濁度有顯著影響。溶液pH為2.0時(shí),溶液近乎透明,濁度較低;溶液pH為3.5時(shí),復(fù)合物溶液的濁度最高,在pH4.5降至較低點(diǎn),之后溶液濁度又開始逐漸上升。由于殼聚糖、果膠自身pKa值的差異,復(fù)合環(huán)境pH的變化主要影響了殼聚糖和果膠的帶電性及分子蜷曲度,造成復(fù)合位點(diǎn)變化,從而影響殼聚糖/果膠復(fù)合物的復(fù)合程[17]。

圖5 pH對(duì)殼聚糖與果膠復(fù)合物溶液濁度的影響Fig.5 The influence of pH on chitosan/pectin polymer solution turbidity

2.2.2 溶液pH對(duì)復(fù)合物電位的影響 由圖6可知,隨著溶液pH由2逐漸變化到6,復(fù)合物表面的ζ-電位由正逐漸變負(fù),表明正電荷逐漸減少,而負(fù)電荷數(shù)量增多,這是由于聚合物在不同pH條件下解離形成的帶電基團(tuán)數(shù)量不同,造成復(fù)合物總的表面電荷變化。Espinosa-Andrews指出當(dāng)pH調(diào)整到兩膠體中帶相反電荷分子等量時(shí),即為復(fù)合物復(fù)聚最佳的pH條件,因?yàn)榇藭r(shí)鹽鍵的數(shù)量最多[16]。由圖6數(shù)據(jù)可知,殼聚糖與果膠形成復(fù)合物的最佳pH為3.0～3.5左右。

圖6 pH對(duì)殼聚糖/果膠復(fù)合物ζ-電位的影響Fig.6 Influence of pH on ζ-electric potential of chitosan/pectin complex

圖7 不同pH溶液中殼聚糖/果膠復(fù)合物的顯微照片(40×)Fig.7 The micrograph of chitosan/pectin polymer in different pH solution(40×)

2.3 殼聚糖、果膠濃度對(duì)復(fù)合作用的影響

2.3.1 殼聚糖、果膠濃度對(duì)復(fù)合物溶液濁度的影響 由圖8可見,殼聚糖和果膠濃度對(duì)溶液濁度也有顯著影響。當(dāng)聚合物濃度為0.1%時(shí),溶液濁度僅為0.5左右;其后,隨著濃度提高至0.5%,溶液濁度急升至2.244±0.085 cm-1;當(dāng)濃度為1%后,溶液濁度繼續(xù)升高至3.0 cm-1左右,但濃度再增大濁度變化不大。

圖8 聚合物濃度對(duì)溶液濁度的影響Fig.8 The influence of polymer solution concentration on turbidity

圖9 不同聚合物濃度下復(fù)合物的顯微狀態(tài)Fig.9 The microscopic state of different polymer concentration

2.3.2 聚合物濃度對(duì)復(fù)合物顯微狀態(tài)的影響 觀察圖9中各顯微照片可以發(fā)現(xiàn),聚合物濃度對(duì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)有很大影響:當(dāng)兩聚合物濃度為0.1%時(shí),形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散,對(duì)光的散射能力很弱;當(dāng)濃度為0.5%時(shí),復(fù)合物自然卷曲,結(jié)構(gòu)均勻,沒有明顯的鏈狀結(jié)構(gòu);當(dāng)濃度達(dá)到1%～1.5%后,復(fù)合物呈現(xiàn)明顯的粗鏈型結(jié)構(gòu),分子伸展,表現(xiàn)出較強(qiáng)的分子剛性;當(dāng)濃度達(dá)到2.0%后,復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,分子鏈卷曲,較松散,分子剛性小。因?yàn)榫酆衔餄舛认鄬?duì)高時(shí)(2.0%),大分子的解離度低,骨架柔韌性高[12],所以復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散、卷曲。

4 結(jié)論

殼聚糖分子量太小或太大都不利于與果膠的復(fù)合作用,15萬時(shí)復(fù)合溶液濁度最高,殼聚糖脫乙酰度對(duì)靜電復(fù)合作用影響不顯著,與果膠的加量有關(guān)。

高酯果膠更易與殼聚糖形成結(jié)構(gòu)緊密的復(fù)合物,溶液濁度較高;隨著果膠加量增加,復(fù)合物溶液濁度發(fā)生四個(gè)階段的變化;果膠加量在82%時(shí)顆粒表面的ζ-電位為0,果膠加量在85%～93%時(shí),溶液的濁度增加最快,復(fù)合物結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的粗鏈狀結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)較致密。

溶液pH顯著影響溶液濁度及復(fù)合物結(jié)構(gòu),當(dāng)溶液pH在3.0～4.0之間時(shí),復(fù)合物結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、均勻,溶液濁度較高。

聚合物濃度不僅影響復(fù)合物溶液濁度,還對(duì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)有明顯影響。濃度為0.1%～1%,此時(shí)復(fù)合溶液濁度呈緩慢上升趨勢;濃度為1%～2%,此時(shí)溶液濁度基本保持不變。濃度較低或較高時(shí),形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)較松散卷曲;聚合物濃度在1%～1.5%,復(fù)合物呈現(xiàn)粗鏈型結(jié)構(gòu),分子剛性較強(qiáng)。

殼聚糖與果膠發(fā)生靜電復(fù)合作用與聚合物分子鏈的伸展、彎曲及靜電位點(diǎn)的結(jié)合、復(fù)合物表面電荷密切相關(guān)。本研究所探討條件會(huì)影響殼聚糖及果膠的上述特性,所形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)變化。

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Study and microscopic observation on complexation of chitosan and pectin

ZHANG Li-yan1,LIU Xiao-fang1,LI Zuo-wei2

(1.School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Industry Polytechnic,Department of Food and Bioengineering,Guangzhou 510300,China)

Effects of characteristics of chitosan and pectin,chitosan/pectin ratio,solution pH and polymer concentration on the turbidity and ζ-potential of solution were investigated and the affecting mechanisms,electrostatic complexation between chitosan and pectin were elaborated by combining the microstructure of complex. The results showed that chitosan with medium molecular weight(15×104)react more easily with pectin to form large complexes,while the deacetylation degree of chitosan had small effect on turbidity of complexation solution.High methoxyl pectin could form compact complexes with chitosan.With the addition level of pectin increasing,the microstructure of complexes changed from loose and sparse to more compacter,and the turbidity of solution showed 4 phases.The ζ-potential of complexation particles became 0 at pectin addition level of with 82%(w/w),but the turbidity of solution didn’t reach the maximum.When the solution pH was between 3.0 and 4.0,chitosan and pectin were easiest to interact with each other to form complexes with a even,dense structure and the solution had higher turbidity.The complexes formed by chitosan and pectin with various concentrations showed significant different structure because of the effects of polymer concentration on stretch of molecular chain and polyelectrolyte complexation.

chitosan;pectin;electrostatic complexation;microscopy

2015-12-22

張立彥(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：食物資源高值化利用研究，E-mail：liyanzh@scut.edu.cn。

華南理工大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2014ZM0070)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B020204002)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000