硫化物脅迫對凡納濱對蝦血細胞抗氧化酶基因表達的影響

汪蕾， 張秀霞， 鄭佩華， 魯耀鵬， 冼健安*

(1.華南師范大學藥物研究院，廣州510631； 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?71101)

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硫化物脅迫對凡納濱對蝦血細胞抗氧化酶基因表達的影響

汪蕾1， 張秀霞2， 鄭佩華1， 魯耀鵬1， 冼健安2*

(1.華南師范大學藥物研究院，廣州510631； 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?71101)

硫化物是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常見的水體污染物之一，為探討抗氧化酶在凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei血細胞抗硫化物脅迫中的作用，以不同濃度(0 mg·L-1和2.0 mg·L-1)的硫化物對凡納濱對蝦進行脅迫，于脅迫后的0 h、6 h、12 h、24 h和48 h取血淋巴，測定血細胞中銅鋅超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和硫氧還蛋白(TRx)基因表達量的變化。結(jié)果顯示，Cu，Zn-SOD和TRx的表達量在脅迫的6～24 h顯著上升，在48 h時恢復(fù)至對照組水平；Mn-SOD和GPx的表達量在脅迫的6～48 h均顯著上調(diào)；CAT表達水平在脅迫的12 h開始有顯著提高。這些結(jié)果表明凡納濱對蝦血細胞抗氧化相關(guān)基因的表達均被誘導上調(diào)，以進行防御；Cu，Zn-SOD、Mn-SOD、GPx和TRx均對硫化物脅迫敏感，在脅迫前期發(fā)揮作用，CAT主要在脅迫后期發(fā)揮作用。

硫化物；凡納濱對蝦；血細胞；抗氧化酶；基因表達

硫化物是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的水體有毒污染物之一，在養(yǎng)殖池塘中主要有2個來源：(1)硫酸鹽在硫酸鹽還原菌的作用下異化還原形成；(2)水產(chǎn)動物的代謝物、殘餌等有機質(zhì)中的含硫氨基酸被微生物分解利用而產(chǎn)生。硫化物對水產(chǎn)動物具有較強的毒性，但目前針對硫化物對蝦類毒性影響的研究較少，主要集中在半致死濃度以及對酶活性影響的研究上(Chengetal.，2007；Hsu & Chen，2007；李建等，2007；管越強等，2009，2011；於葉兵等，2011；余靜等，2011；楊世平等，2014)。筆者前期應(yīng)用流式細胞術(shù)分析了硫化物對凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei細胞毒性的影響，結(jié)果顯示硫化物脅迫刺激其血細胞產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，誘導血細胞凋亡，繼而導致血細胞總數(shù)(THC)下降，這可能是硫化物對蝦類產(chǎn)生細胞毒性的重要機制之一(汪蕾等，待發(fā)表)?？寡趸甘菣C體內(nèi)清除過量ROS，進行抗氧化防御的重要工具。根據(jù)前期研究結(jié)果，筆者推測抗氧化酶可能在抗硫化物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究針對5種重要的抗氧化酶：銅鋅超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和硫氧還蛋白(TRx)，分析硫化物脅迫對其在血細胞中表達水平的影響，探討它們在抗硫化物脅迫中發(fā)揮的作用，為進一步研究如何提高蝦類的抗硫化物脅迫能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦購自廣東省廣州市番禺區(qū)某養(yǎng)殖場。對蝦平均體質(zhì)量為8.69 g±0.75 g，在實驗室環(huán)境條件下馴養(yǎng)，養(yǎng)殖用水的條件為：鹽度20‰，pH7.9～8.0，溫度22～24 ℃，一直保持曝氣，并進行循環(huán)過濾。馴養(yǎng)1周后，選取健康無病患、附肢完整、處于蛻皮間期的對蝦進行實驗。

DNA marker、PCR試劑盒(Taq Mix)購自東盛公司；Trizol RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)、熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)均購自大連TaKaRa公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)和瓊脂粉均購自上海生工生物工程有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。所有使用的器具和耗材經(jīng)過RNase free處理。

1.2 硫化物脅迫

以硫化鈉作為硫化物來源，配制硫濃度為1 g·L-1的硫化鈉溶液，用于調(diào)節(jié)水體硫化物濃度。根據(jù)參考文獻(Hsu & Chen，2007)及前期研究結(jié)果，設(shè)置硫化物脅迫濃度為2.0 mg·L-1，硫化物濃度采用亞甲基藍分光光度法測定，實際測定濃度為1.92 mg·L-1±0.09 mg·L-1，對照組為不添加組。每組設(shè)3個平行，每個養(yǎng)殖桶放鹽度20‰的水180 L，放養(yǎng)對蝦20尾。為保證硫化物濃度，每6 h換水1次，換水量約為50%。分別在脅迫的0 h、6 h、12 h、24 h和48 h取樣。

1.3 血細胞總RNA提取

用2.5 mL一次性注射器吸取預(yù)冷的抗凝劑(葡萄糖20.5 g·L-1、檸檬酸鈉8 g·L-1、氯化鈉4.2 g·L-1，pH7.5)，然后從對蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴，3 000 r·min-1, 4 ℃離心10 min，棄上清，沉淀為血細胞，用于提取總RNA。應(yīng)用Trizol RNA提取試劑提取總RNA，具體方法參考說明書。得到的RNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，取2 μL利用NanoDrop ND-100 Spectrophotometer測定RNA濃度和純度，OD260/280在1.9～2.0的RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板。

1.4 cDNA第一鏈的合成

根據(jù)RNA濃度用DEPC水稀釋，在10 μL的反轉(zhuǎn)率體系中加入500 ng RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板。實驗使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)試劑盒，按照說明書步驟進行。

1.5 表達定量

從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫查找所需基因的cDNA序列，根據(jù)查找到的序列利用Primer Premier 5進行引物的設(shè)計或者參考文獻中的引物，各基因的GenBank序列號和引物序列見表1，所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實時熒光定量PCR實驗使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，實驗步驟按照說明書進行。所得數(shù)據(jù)以ABI 7500 SDS進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)目的基因和β-actin的Ct值用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。每個樣品做3個重復(fù)。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.6 統(tǒng)計分析

結(jié)果顯示為平均值±標準差(Mean±SD)，實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0進行統(tǒng)計單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 對Cu，Zn-SOD表達量的影響

硫化物脅迫對Cu，Zn-SOD表達水平的影響見圖1。與對照組相比，脅迫6 h、12 h和24 h對蝦血細胞中Cu，Zn-SOD的表達水平顯著提高(P<0.05)，并在12 h時達到最大值，為對照組的8.16倍；48 h時，Cu，Zn-SOD的表達量下降至對照組水平(P>0.05)。

圖1 凡納濱對蝦經(jīng)硫化物脅迫后的血細胞中Cu，Zn-SOD基因表達量

2.2 對Mn-SOD表達量的影響

硫化物脅迫對Mn-SOD表達水平的影響見圖2。脅迫6 h、12 h、24 h和48 h對蝦血細胞中的Mn-SOD表達水平均顯著升高(P<0.05)；在6 h時達到最大值，為對照組的14.73倍。

圖2 凡納濱對蝦經(jīng)硫化物脅迫后的血細胞中Mn-SOD基因表達量

2.3 對CAT表達量的影響

硫化物脅迫對CAT表達水平的影響見圖3。脅迫6 h對蝦血細胞中的CAT表達量與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；脅迫12 h、24 h和48 h對蝦血細胞中的Mn-SOD表達量均顯著升高(P<0.05)，在24 h時達到最大值，為對照組的13.78倍。

圖3 凡納濱對蝦經(jīng)硫化物脅迫后的血細胞中CAT基因表達量

2.4 對GPx表達量的影響

硫化物脅迫對GPx表達水平的影響見圖4。脅迫6 h、12 h、24 h和48 h對蝦血細胞中的GPx表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，在6 h時達到最大值，為對照組的7.80倍。

圖4 凡納濱對蝦經(jīng)硫化物脅迫后的血細胞中GPx基因表達量

2.5 對TRx表達量的影響

硫化物脅迫對TRx表達水平的影響見圖5。脅迫6 h、12 h和24 h對蝦血細胞中的TRx表達量顯著高于對照組(P<0.05)，在12 h時達到最大值，為對照組的2.84倍；48 h時，TRx的表達量下降至對照組水平(P>0.05)。

3 討論

眾多研究表明，氧化損傷是水體環(huán)境因子對水產(chǎn)動物產(chǎn)生脅迫毒害作用的普遍機制之一，如亞硝酸鹽(郭慧等，2015)、pH(Maietal.，2010)和重金屬(Wangetal.，2013)等。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)硫化物脅迫會誘導凡納濱對蝦血細胞產(chǎn)生大量ROS，導致氧化脅迫毒害?？寡趸甘菣C體內(nèi)清除過多ROS、保護機體免受氧化損傷的重要工具。一些研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境脅迫過程中，蝦會調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達水平，使其在抗脅迫中發(fā)揮作用(Wangetal.，2009；Guoetal.，2013)。本研究分析5種抗氧化相關(guān)基因?qū)α蚧锩{迫的分子響應(yīng)，探討這些基因在抗硫化物脅迫中的作用。

圖5 凡納濱對蝦經(jīng)硫化物脅迫后的血細胞中TRx基因表達量

SOD是抗氧化酶系統(tǒng)中清除氧自由基的第一個酶，它可將超氧陰離子(O2-)轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)。研究表明，甲殼動物的SOD活力會受到硫化物脅迫的影響。日本沼蝦Macrobachiumnipponense經(jīng)1.2 mg·L-1和4.0 mg·L-1硫化物脅迫48 h后，肌肉的SOD活力顯著上升(管越強等，2011)。低濃度硫化物脅迫在短期內(nèi)可使河蟹Eriocheirsinensis血淋巴和鰓組織中的SOD活力提高，脅迫時間延長至10 d后，血淋巴中SOD活力逐漸下降；而高濃度硫化物脅迫則抑制SOD活力(顧順樟，2007)。在對日本囊對蝦Marsupenaeusjaponicus和凡納濱對蝦的研究中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硫化物脅迫后，血細胞中SOD活力顯著上升(Chengetal.，2007；Hsu & Chen，2007)。根據(jù)所含金屬輔基的不同，在真核生物中SOD可分為Cu，Zn-SOD和Mn-SOD 2種。本研究分別測定了這2種SOD的表達水平的變化，結(jié)果顯示，2種SOD的基因轉(zhuǎn)錄水平均不同程度地被誘導上調(diào)。就敏感度而言，2種SOD均在脅迫6 h時被顯著誘導上調(diào)，脅迫組Cu，Zn-SOD表達水平是對照組的1.80倍，其最大值出現(xiàn)在12 h時，而Mn-SOD在6 h時已達到最大值；就持續(xù)性而言，脅迫組Cu，Zn-SOD的表達水平在48 h時恢復(fù)至對照組水平，而Mn-SOD在脅迫的48 h內(nèi)均顯著高于對照組；就相對表達量而言，脅迫組Cu，Zn-SOD表達水平達到最大值時是對照組的8.16倍，而脅迫組Mn-SOD達到最大值時是對照組的14.73倍。由此可見，2種SOD均對硫化物脅迫敏感，在脅迫6 h時均被誘導，而Mn-SOD的表達量上調(diào)的持續(xù)性更強，并且相對表達量更高。一般認為Cu，Zn-SOD主要存在于胞漿中，而Mn-SOD存在于線粒體中，本研究結(jié)果顯示在硫化物脅迫作用下，2種SOD的表達量均被誘導上調(diào)，表明2種SOD可能在血細胞的不同部位發(fā)揮抗氧化作用。

CAT是清除H2O2的特異性酶，可以將H2O2分解為H2O和O2。GPx特異性地催化還原型谷胱甘肽對H2O2和氫過氧化物的還原反應(yīng)，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2的分解，從而保護細胞結(jié)構(gòu)和功能免受過氧化物的損害。因此CAT和GPx在抗氧化防御過程中具有一定的協(xié)同作用(Guoetal.，2013)。本研究結(jié)果顯示，GPx表達水平在脅迫6 h時顯著上升，在24 h時略有下調(diào)，但仍顯著高于對照組；而CAT表達水平在脅迫12 h時才顯著被誘導，在脅迫的24 h時表達量達到最大值，為對照組的15.30倍，這些結(jié)果表明GPx對硫化物脅迫更敏感，在脅迫的前期發(fā)揮作用，而CAT主要在脅迫后期發(fā)揮作用。

TRx是細胞內(nèi)具有氧化還原活性的小分子蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)二硫鍵的還原酶，參與多種生理過程，其中包括調(diào)節(jié)抗氧化作用、抗脅迫作用(叢藝等，2008)。結(jié)果顯示，在硫化物脅迫作用下，TRx表達量在6～24 h時有顯著上調(diào)，在48 h時恢復(fù)至對照組水平，表明TRx對硫化物脅迫敏感，在脅迫前期可能發(fā)揮重要的抗脅迫作用。

本研究結(jié)果顯示，在硫化物脅迫作用下，各類抗氧化相關(guān)基因均呈現(xiàn)出不同程度的表達量上調(diào)，表明凡納濱對蝦血細胞通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)抗氧化相關(guān)基因的表達水平以進行抗氧化防御。各類抗氧化相關(guān)基因表現(xiàn)出對硫化物脅迫的不同敏感度，Cu，Zn-SOD、Mn-SOD、GPx和TRx在脅迫前期發(fā)揮作用，CAT主要在脅迫后期發(fā)揮作用；各基因在表達量的增量上也有所不同，體現(xiàn)了它們在抗硫化物脅迫過程中具有一定的協(xié)同作用。以往一些研究顯示，通過合理的營養(yǎng)學手段可顯著提高水產(chǎn)動物機體的抗亞硝酸鹽、銅離子、氨氮等脅迫的能力(冼健安等，2013；類延菊等，2015；施兆鴻等，2015)，合理的營養(yǎng)調(diào)控能否有效提高蝦的抗硫化物脅迫能力，仍有待深入研究。

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Effects of Sulfide Stress on Expressions of Antioxidant Enzymes inLitopenaeusvannameiHaemocytes

WANG Lei1， ZHANG Xiuxia2， ZHENG Peihua1， LU Yaopeng1， XIAN Jian’an2*

(1. Institute of Pharmaceutical Research， South China Normal University， Guangzhou 510631， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China)

Sulfide is one of the common water pollutants in aquaculture. To investigate the role of antioxidant enzymes in anti-sulfide defense of shrimp haemocytes， gene expression levels of copper， zinc-superoxide dismutase (Cu， Zn-SOD)， manganese-superoxide dismutase (Mn-SOD)， catalase (CAT)， glutathion peroxidase (GPx) and thioredoxin (TRx) were determined in haemocytes of the white shrimp (Litopenaeusvannamei) exposure to sulfide (0 mg·L-1and 2.0 mg·L-1) for 0 h， 6 h， 12 h， 24 h and 48 h. The results showed that expression levels of Cu， Zn-SOD and TRx significantly increased after 6～24 h exposure， and reduced to the control levels at 48 h. Mn-SOD and GPx mRNA expression levels were up-regulated after 6～48 h exposure. CAT expression level began to increase after 12 h exposure. These results indicated that the mRNA expressions of antioxidant enzymes were induced to protect the haemocytes against sulfide stress. Cu， Zn-SOD， Mn-SOD， GPx and TRx displayed high sensitivity to sulfide stress， and might play the dominant role at the initial stage of sulfide stress， whereas CAT mainly worked at the later period.

sulfide;Litopenaeusvannamei; haemocyte; antioxidant enzyme; gene expression

2016-08-25 接受日期：2016-09-21

國家自然科學基金項目(31500326); 廣東省自然科學基金項目(2014A030310185); 廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項目(2014KQNCX056); 廣東省普通高校特色創(chuàng)新項目(2015KTSCX019); 華南師范大學青年教師科研培育基金項目(13KJ16)

汪蕾(1986—)， 女， 講師， 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學研究， E-mail：wanglei@scnu.edu.cn

*通信作者Corresponding author， E-mail：xian-ja@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160229

X503.225； Q959.223

A

1000-7083(2016)06-0884-05