‘魯星’桃中10個MADS-box基因克隆和表達(dá)分析

李慧峰，賈厚振，董慶龍，冉 昆，王宏偉

?

‘魯星’桃中10個MADS-box基因克隆和表達(dá)分析

李慧峰1，賈厚振1，董慶龍2，冉 昆1，王宏偉1

（1山東省果樹研究所，山東泰安271000；2西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100）

【目的】克隆‘魯星’桃（var.‘Luxing’）中參與調(diào)控營養(yǎng)和生殖生長的MADS-box（）基因，研究其在不同組織器官中的表達(dá)特性，為解析該基因在花發(fā)育和果實發(fā)育及成熟過程中的功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坷猛幢葘蚏T-PCR技術(shù)，克隆獲得‘魯星’桃中10個全長cDNA序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)相關(guān)分析；采用RT-PCR技術(shù)檢測在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣等組織以及花發(fā)育7個階段和果實發(fā)育5個階段的表達(dá)特性。【結(jié)果】測序結(jié)果顯示，獲得10個s（、、、、、、、、和；GenBank登錄號分別為KU559577、KU559578、KU559585、KU559586、KU559587、KU559588、KU559594、KU559595、KU559596和KU559597），其開放閱讀框（open reading frame，ORF）分別為522、279、1 065、828、723、600、636、534、750和480 bp。進(jìn)化分析表明，屬于AP3亞組，是AGL17亞組，屬于MIKC*組，、和同被分為Mα組，、、和同屬于Mγ組。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，10個PpMADS蛋白均定位于細(xì)胞核中。啟動子分析顯示，s啟動子區(qū)域含有多個順式作用元件，包括光響應(yīng)元件、防御及逆境響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點、熱激響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、真菌效應(yīng)子響應(yīng)元件、傷害響應(yīng)元件、厭氧響應(yīng)元件、GA響應(yīng)元件、Auxin響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件、ABA響應(yīng)元件、SA響應(yīng)元件和乙烯響應(yīng)元件。半定量RT-PCR和qRT-PCR結(jié)果顯示，在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣、花發(fā)育和果實發(fā)育中表達(dá)；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中表達(dá)；在萼片、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中（苗期除外）表達(dá)；Mα組和Mγ組所有成員在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中均有表達(dá)，部分成員在果實發(fā)育中表達(dá)。【結(jié)論】10個在‘魯星’桃的營養(yǎng)生長以及花和果實發(fā)育過程中可能具有重要的調(diào)控作用。

‘魯星’桃；MADS-box；轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；表達(dá)分析

0 引言

【研究意義】桃（L.）作為中國重要的落葉果樹樹種之一，栽培歷史悠久，因其果實營養(yǎng)豐富、風(fēng)味鮮美，深受人們的喜愛。分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及桃基因組草圖的公布，為研究和揭示桃生長和發(fā)育的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。研究‘魯星’桃（var.‘Luxing’）中，對探索其在花及果實發(fā)育過程中的作用具有重要參考意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在植物中，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是一個大家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，是植物界中研究最為廣泛的基因家族之一，在植物的花和果實發(fā)育及成熟等多個過程中具有重要的調(diào)控作用；其名稱源于4個物種的，即釀酒酵母的、擬南芥的、金魚草的及人類的首字母，在其N末端含有一段約為60個氨基酸組成的高度保守結(jié)構(gòu)域，稱之為MADS-box結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)識別和綁定靶基因中調(diào)控區(qū)域的CArG盒[CC(A/T)6GG][1-3]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同，植物基因家族可分為2個亞家族：Type I和Type II。Type I可繼續(xù)分為Mα、Mβ、Mγ和Mδ組；Type II又稱為MIKC類型，因其含有4個保守結(jié)構(gòu)域：MADS（M）盒、Intervening（I）區(qū)域、Keratin（K）盒和C-terminal（C）末端[4]。此外，根據(jù)上述保守域特征，MIKC類型可進(jìn)一步分為MIKCC和MIKC*，二者之間的差別是MIKC*缺少I區(qū)域和K盒[5]。MIKCC依據(jù)進(jìn)化關(guān)系又可進(jìn)一步分為AP1、SVP、AP3、SOC1、AG、SEP、AGL12、AGL17和FLC等亞組，同時MIKCC也是植物中研究最為廣泛和深入的類型[3,6]。近年來隨著研究的不斷深入，花形成的分子調(diào)控機(jī)理已經(jīng)從最初的ABC模型發(fā)展為ABCDE模型。根據(jù)ABCDE模型的闡述，A類（（））和E類（（、、和））基因調(diào)控萼片的形成；A類、B類（（）和）和E類基因調(diào)控花瓣的形成；B類、C類（（））和E類基因調(diào)控雄蕊的形成；C類和E類基因調(diào)控心皮的形成；D類（（））和E類基因調(diào)控胚珠的形成[4, 6-8]。此外，還參與調(diào)控果實的發(fā)育[9-10]、成熟和開裂[11-13]，調(diào)控光合作用和營養(yǎng)代謝[14]以及參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑[3,15]。【本研究切入點】根據(jù)前人研究結(jié)果[16-17]，已經(jīng)鑒定得到79個桃。本研究以‘魯星’桃為試材，去除GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的基因，克隆不同亞組的桃（）?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆，詳細(xì)分析的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)和保守元件，并研究其在不同組織以及花和果實發(fā)育過程中的表達(dá)情況，為桃的深入研究提供參考。

1 材料與方法

試驗于2014—2015年在山東省果樹生物技術(shù)育種重點實驗室和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院作物生物學(xué)國家重點實驗室進(jìn)行。

1.1 植物材料

供試材料為2014年山東省果樹研究所天平湖試驗示范基地（山東泰安）3年生‘魯星’桃（var.‘Luxing’，證書編號：魯農(nóng)審2014047號，親本：Yukon King/曙光），一年生的枝條（莖）（4月5日）、新葉（4月5日）、7個不同發(fā)育階段的整花（花蕾期：1階段，4月2日取樣；露瓣期：2階段，4月2日取樣；初開期：3階段（小），4月2日取樣；初開期：4—5階段（中—大），4月9日取樣；盛花期：6階段，4月9日取樣；衰敗期：7階段，4月15日取樣）[18-19]、雄蕊（4月5日）、萼片（4月5日）、子房（4月5日）、花瓣（4月5日）和5個不同發(fā)育階段的果實（花后30、50、60、70和80 d）（以4月5日開始計算）。上述植物材料均從3棵及以上樹上采集發(fā)育階段和狀態(tài)較一致的樣品。于液氮中速凍，-80℃保存，以便提取RNA進(jìn)行表達(dá)分析。

1.2 基因克隆與序列分析

采用改良熱硼酸法提取混和樣品（包括1.1中的混合組織材料：莖、葉、7階段整花和80 d果實）RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaRaKa公司）合成cDNA。根據(jù)前人研究結(jié)果[20-21]，鑒定得到79個，通過序列比對去除GenBank數(shù)據(jù)庫中存在的15條，選擇克隆分屬不同亞組的10個。設(shè)計特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 45 s，56—62℃ 45 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物并連接到-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

在桃基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.rosaceae.org/gb/ gbrowse/prunus_persica/）中，通過序列比對查找的啟動子序列，由于桃基因組數(shù)據(jù)庫測序質(zhì)量較好，可直接進(jìn)行啟動序列分析。在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）進(jìn)行啟動子序列分析；DNAMAN 6.0.3.99軟件分析基因的開放閱讀框（ORF）和編碼氨基酸序列；在線軟件WebLogo 3（http://weblogo. threeplusone. com/）分析PpMADS蛋白的MADS-box結(jié)構(gòu)域；MEGA6.0軟件構(gòu)建PpMADS和其他物種MADS-box的系統(tǒng)進(jìn)化樹；LocTree3（https://rostlab. org/services/ loctree3/）和SoftBerry ProtComp 9.0（http://linux1. softberry.com/berry. phtml）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[22-23]。

1.3的表達(dá)分析

使用RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN公司）提取組織RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaRaKa公司）合成cDNA。采用作為半定量PCR（RT-PCR）內(nèi)參基因[21]。RT-PCR擴(kuò)增體系為25 μL：1 μL cDNA；2.5 μL 10×緩沖液；2.5 mmol dNTP 2 μL；上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL；DNA聚合酶（購自全式金公司）0.25 μL；剩余用ddH2O補(bǔ)齊。循環(huán)參數(shù)為：94℃5 min；94℃25 s；58℃25 s；72℃30 s；目的基因為36個循環(huán)，內(nèi)參基因為28個循環(huán)。每一個基因的RT-PCR反應(yīng)均重復(fù)3次。

表1 基因克隆引物序列

采用作為實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的內(nèi)參基因[21]。參照谷彥冰等[21]的方法，采用三步法進(jìn)行qRT-PCR分析。所用儀器為BIO-RAD IQ5（USA），所有qRT-PCR反應(yīng)都設(shè)3次重復(fù)。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Master I 10 μL，上、下游引物（5 μmol·L-1）各1 μL，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min；95℃10 s，58℃ 30 s，72℃15 s，40個循環(huán)；最后退火至55℃，每隔7 s上升0.5℃，至95℃，共81個循環(huán)。試驗結(jié)果用2–ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。引物設(shè)計均避開MADS-box保守域，所用引物具體序列詳見表2。

表2 RT-PCR和qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1克隆

經(jīng)測序克隆得到分屬不同亞組的10個，基因命名、ORF、蛋白大小、分子量、等電點、所屬類型和GenBank登錄號詳見表3。對10個PpMADS蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果顯示均含有MADS-box結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2 PpMADS進(jìn)化分析

利用MEGA6.0軟件對本研究克隆的10個PpMADS蛋白、GenBank數(shù)據(jù)庫中有記載的15個PpMADS蛋白[17]、擬南芥MADS-box蛋白（AGL）[22]和水稻MADS-box蛋白（OsMADS）[23]進(jìn)行MADS-box結(jié)構(gòu)域聚類分析（圖2）。結(jié)果表明，Type II MADS-box蛋白被分為MIKCC和MIKC*兩組，其中MIKCC可繼續(xù)分為9個亞組；Type I MADS-box蛋白被分為Mα、Mβ、Mγ和Mδ四組。PpMADS11屬于AP3亞組；PpMADS12屬于AGL17亞組；PpMADS19屬于MIKC*組；PpMADS20、PpMADS21和PpMADS22屬于Mα組；PpMADS28、PpMADS29、PpMADS30和 PpMADS31同屬于Mγ組（圖2）。

2.3 PpMADS亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過在線預(yù)測軟件SoftBerry ProtComp 9.0對PpMADS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。結(jié)果顯示（表4），PpMADS11、PpMADS12、PpMADS19、PpMADS20、PpMADS21、PpMADS22、PpMADS28、PpMADS、PpMADS30和PpMADS31定位在細(xì)胞核的相應(yīng)預(yù)測數(shù)值均為最高（共10分：數(shù)值越高表示可信度越大）。進(jìn)一步利用在線預(yù)測軟件LOCTREE3對PpMADS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示PpMADS蛋白均定位在細(xì)胞核。由此判斷，PpMADS蛋白可能定位于細(xì)胞核中。

表3 PpMADS基因信息

圖1 PpMADS蛋白氨基酸序列同源性比對和MADS-box結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽分析

表4 PpMADS亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.4啟動子序列分析

通過桃基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.rosaceae.org/ gb/gbrowse/prunus_persica/）下載基因組定位信息，獲得10個的啟動子序列（1 500 bp）。對啟動子序列上順式作用元件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10個啟動子上含有多個光響應(yīng)元件、防御及逆境響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點、熱激響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、真菌效應(yīng)子響應(yīng)元件、傷害響應(yīng)元件、厭氧響應(yīng)元件、GA響應(yīng)元件、Auxin響應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件、ABA響應(yīng)元件、SA響應(yīng)元件和乙烯響應(yīng)元件。其中，啟動子含有2個真菌效應(yīng)子響應(yīng)元件和2個厭氧響應(yīng)元件；啟動子含有7個厭氧響應(yīng)元件和4個MeJA響應(yīng)元件；啟動子含有2個熱激響應(yīng)元件、2個SA響應(yīng)元件和2個防御及逆境響應(yīng)元件；啟動子含有4個厭氧響應(yīng)元件；啟動子含有3個干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點；啟動子含有4個干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點；啟動子含有4個GA響應(yīng)元件和4個防御及逆境響應(yīng)元件；和啟動子分別含有5個厭氧響應(yīng)元件；啟動子含有2個SA響應(yīng)元件和2個GA響應(yīng)元件（圖3）。

2.5的表達(dá)分析

利用半定量RT-PCR技術(shù)對10個進(jìn)行不同組織、花發(fā)育和果實發(fā)育階段的表達(dá)分析。結(jié)果表明，、Mα組和Mγ組成員在莖、葉、萼片、子房、雄蕊和花瓣中均有表達(dá)；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊和花瓣中均表達(dá)；而在萼片、雄蕊和花瓣中表達(dá)（圖4）。在花不同發(fā)育階段中，、Mα組和Mγ組成員持續(xù)高表達(dá)；在蕾期（1階段）、露瓣期（2階段）和初開期（3階段）表達(dá)量逐漸上升，在初開期（4—5階段）和盛開期（6階段）表達(dá)量逐漸下降，在衰敗期（7階段）表達(dá)更加微弱；的表達(dá)模式與相似，不同的是在蕾期（1階段）無表達(dá)（圖5）。在果實不同發(fā)育階段中，、、、、和均無表達(dá)；則持續(xù)在不同果實發(fā)育階段表達(dá)；、和在30 d和50 d過程中表達(dá)逐漸上調(diào)，60 d表達(dá)下調(diào)，而后表達(dá)持續(xù)上升（圖6）。為了驗證上述基因表達(dá)的準(zhǔn)確性，選擇分屬不同亞組的5個在不同組織、花不同發(fā)育階段和果實不同發(fā)育階段進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析，結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果一致（圖7）。

圖3 PpMADSs啟動子序列順式作用元件分析

圖4 PpMADS在桃不同組織中的半定量表達(dá)分析

1：花蕾期；2：露瓣期；3—5：初開期；6：盛開期；7：衰敗期。下同

圖6 PpMADS在果實不同發(fā)育階段中的半定量表達(dá)分析

3 討論

作為轉(zhuǎn)錄因子大家族，廣泛參與到植物多種生理和生殖過程的調(diào)控。2013年，Verde等[24]公布了桃基因組草圖，使得在基因組范圍內(nèi)鑒定和分析桃MADS-box家族成為可能。2015年，WELLS等[16]鑒定了桃基因組中存在79個。

已有研究表明，受到非生物脅迫后，表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式[23,25-27]。水稻多個在鹽、干旱、冷和ABA處理后出現(xiàn)不同響應(yīng)[23,25]；二穗短柄草幼苗在面對鹽、干旱和冷脅迫處理后，的相對表達(dá)呈現(xiàn)不同程度地上調(diào)和下降[26]；大白菜幼苗在面對赤霉素、水楊酸、脫落酸、冷和熱脅迫處理后，多個的相對表達(dá)也呈現(xiàn)不同程度地上調(diào)和下降[27]。本文中，順式作用元件分析表明10個的啟動子含有多個與激素和逆境脅迫相關(guān)的作用元件，因此，暗示著這10個的轉(zhuǎn)錄可能受到激素和逆境脅迫的誘導(dǎo)。

研究表明，B類包括和在花瓣和雄蕊中起到特異性的調(diào)控作用[4,6-8]。擬南芥或者突變都會導(dǎo)致第二輪的花瓣轉(zhuǎn)換為萼片，而第三輪雄蕊轉(zhuǎn)換為心皮結(jié)構(gòu)[28]。此外，在多個物種的突變體中也發(fā)現(xiàn)這種相似表型，例如，雙子葉植物金魚草、矮牽?；?、非洲菊、罌粟、歐洲耬斗菜、番茄、本氏煙以及單子葉植物玉米和水稻[29]。這些結(jié)果表明，和的調(diào)控功能非常保守。盡管在花瓣和雄蕊中起到特異性調(diào)控作用，但其在花組織中的表達(dá)卻是多種多樣的。例如，水稻同源基因在花瓣和雄蕊中有表達(dá)[30]；擬南芥在花瓣、雄蕊和子房中有表達(dá)[31]；玉米同源基因在萼片、花瓣、雄蕊和子房中均有表達(dá)[32]；非洲菊同源基因在萼片、花瓣、雄蕊和子房以及非花器官中均有表達(dá)[31]；蒺藜苜蓿同源基因只在非花器官葉中表達(dá)[33]；蘋果AP3亞組成員在非花器官莖、葉中有表達(dá)，花中無表達(dá)，而且在果實發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)[6]。本研究克隆得到的同源基因，在非花器官莖、葉和雄蕊以及花瓣中均表達(dá)，并且在花發(fā)育的過程中，表達(dá)模式是先升高后降低；在果實發(fā)育過程中，持續(xù)高表達(dá)。在擬南芥[22]、二穗短柄草[26]和黃瓜[34]中，AGL17亞組成員在根中特異表達(dá)；而在蘋果[6]、水稻[23]和葡萄[35]中，AGL17亞組成員還在其他組織中表達(dá)。本研究中，比較不同的是，在莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊和子房以及花發(fā)育的各個階段中均有表達(dá)，在果實發(fā)育過程中則沒有表達(dá)。前人研究表明，擬南芥包含6個MIKC*類型的，分別是：（）、、、、和。除了，其他成員均在花粉發(fā)育過程中特異表達(dá)，并且它們之間的功能高度冗余，其單突變體并沒有缺陷表型，而雙突變體則表現(xiàn)為：花粉發(fā)育能力下降，延遲萌發(fā)，花粉管生長畸形[36]。水稻包含3個MIKC*類型成員，分別是、和，而且與擬南芥MIKC*類型的具有相似功能，不同的是其單突變體就能表現(xiàn)為花粉成熟和萌發(fā)受到嚴(yán)重破壞[37]。在本文中，檢測到在萼片、雄蕊和花瓣中有表達(dá)，在花發(fā)育的過程中，表達(dá)模式是先升高后降低。以上結(jié)果表明，AP3亞組、AGL17亞組和MIKC*類型成員在各個物種中調(diào)控花發(fā)育的相關(guān)功能高度保守，但在各個物種的進(jìn)化過程中又賦予其新的功能。

圖7 PpMADS在不同組織（A）、花不同發(fā)育階段（B）和果實不同發(fā)育階段（C）的實時熒光定量表達(dá)分析

相對于MIKC類型來說，Type I的相關(guān)研究較少。最近研究表明，擬南芥Type I成員在雌配子體的決定以及胚和胚乳的發(fā)育過程中具有重要作用[38-39]。本研究中，Mα組和Mγ組成員在莖、葉、萼片、花瓣、雄蕊和子房以及花發(fā)育的各個階段中均有表達(dá)，在果實發(fā)育過程中則是先上升后下降再上升；相似的結(jié)果也出現(xiàn)在梅花Mα組和Mγ組成員中[40]；擬南芥[22]、水稻[23]、黃瓜[34]和大豆[41]Mα組和Mγ組成員在葉、花和果實也均有表達(dá)；而蘋果[6]、二穗短柄草[26]和大白菜[27]Mα組和Mγ組成員在多種組織中特異性表達(dá)。以上結(jié)果表明，不同物種Mα組和Mγ組成員在植物營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育過程中扮演相似或者獨特的功能。

此外，WELLS等[16]通過RNA-seq數(shù)據(jù)分析了桃（‘Lovell’）中根、成熟葉、幼葉和果實等組織的表達(dá)模式。對于同一基因在不同桃品種相同組織的表達(dá)模式，有些類似，有些則差別較大。例如，、、和的RNA-seq表達(dá)模式與本研究中RT-PCR的表達(dá)模式相似，而、、、、和的表達(dá)模式則不同。這可能是由于品種特性、組織取樣的時間和空間、栽培條件以及外界環(huán)境等多種因素造成的。因此，桃不同品種間的表達(dá)模式及其相關(guān)生物學(xué)功能有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

克隆獲得了‘魯星’桃10個，均含有MADS-box結(jié)構(gòu)域，分屬5個亞組，可能都定位于細(xì)胞核中，含有多個順式作用元件；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣、花發(fā)育和果實發(fā)育中均表達(dá)；在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中表達(dá)；在萼片、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中（蕾期除外）表達(dá)；Mα組和Mγ組所有成員在莖、葉、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花發(fā)育中均有表達(dá)，部分成員在果實發(fā)育中表達(dá)，暗示其在營養(yǎng)生長以及花和果實發(fā)育過程中可能具有重要的調(diào)控作用。

References

[1] Riechmann J L, Meyerowitz E M. MADS domain proteins in plant development., 1997, 378(10): 1079-1101.

[2] Messenguy F, Dubois E. Role of MADS box proteins and their cofactors in combinatorial control of gene expression and cell development., 2003, 316: 1-21.

[3] 劉菊華, 徐碧玉, 張靜, 金志強(qiáng). MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的相互作用及對果實發(fā)育和成熟的調(diào)控. 遺傳, 2010, 32(9): 893-902.

Liu J H, Xu B Y, Zhang J, Jin Z Q. The interaction of MADS-box transcription factors and manipulating fruit development and ripening., 2010, 32(9): 893-902. (in Chinese)

[4] KAUFMANN K, MELZER R, THEISSEN G. MIKC-type MADS- domain proteins: structural modularity, protein interactions and network evolution in land plants., 2005, 347(2): 183-198.

[5] HENSCHEL K, KOFUJI R, HASEBE M, SAEDLER H, MUNSTER T, THEISSEN G. Two ancient classes of MIKC-typegenes are present in the moss., 2002, 19(6): 801-814.

[6] TIAN Y, DONG Q L, JI Z R, CHI F M, CONG P H, ZHOU Z S. Genome-wide identification and analysis of thegene family in apple., 2015, 555(2): 277-290.

[7] WEIGEL D, MEYEROWITZ E M. The ABCs of floral homeotic genes., 1994, 78(2): 203-209.

[8] MA H, DEPAMPHILIS C. The ABCs of floral evolution., 2000, 101(1): 5-8.

[9] IRELAND H S, YAO J L, TOMES S, SUTHERLAND P W, NIEUWENHUIZEN N, GUNASEELAN K, WINZ R A, DAVID K M, SCHAFFER R J. Apple-like genes control fruit flesh development and ripening., 2013,73(6): 1044-1056.

[10] FUJISAWA M, SHIMA Y, NAKAGAWA H, KITAGAWA M, KIMBARA J, NAKANO T, KASUMI T, ITO Y. Transcriptional regulation of fruit ripening by tomato FRUITFULL homologs and associated MADS box proteins., 2014, 26(1): 89-101.

[11] FERRANDIZ C, LILJEGREN S J, YANOFSKY M F. Negative regulation of the SHATTERPROOF genes by FRUITFULL duringfruit development., 2000, 289(5478): 436-438.

[12] VREBALOV J, RUEZINSKY D, PADMANABHAN V, WHITE R, MEDRANO D, DRAKE R, SCHUCH W, GIOVANNONI J. Agene necessary for fruit ripening at the tomato ripening- inhibitor (rin) locus., 2002, 296(5566): 343-346.

[13] ITO Y, KITAGAWA M, IHASHI N, YABE K, KIMBARA J, YASUDA J, ITO H, INAKUMA T, HIROI S, KASUMI T. DNA-binding specificity, transcriptional activation potential, and the rin mutation effect for the tomato fruit-ripening regulator RIN., 2008, 55(2): 212-223.

[14] MARA C D, IRISH V F. Two GATA transcription factors are downstream effectors of floral homeotic gene action in., 2008, 147(2): 707-718.

[15] KAUFMANN K, MUI?O J M, JAUREGUI R, AIROLDI C A, SMACZNIAK C, KRAJEWSKI P, ANGENENT G C. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: Integration of developmental and hormonal pathways in theflower., 2009, 7(4): 854-875.

[16] WELLS C E, VENDRAMIN E, TARODO S J, VERDE I, BIELENBERG D G. A genome-wide analysis ofgenes in peach [(L.) Batsch]., 2015, 15(1): 41.

[17] 王傳增, 余賢美, 董慶龍, 張安寧, 劉偉, 董飛, 王淑珍, 王長君. 桃已知 MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)及花發(fā)育表達(dá)分析.核農(nóng)學(xué)報, 2015, 29(5): 849-858.

WANG C Z, YU X M, DONG Q L, ZHANG A N, LIU W, DONG F, WANG S Z, WANG C J. Bioinformatic and expression analysis on the known MADS-box transcription factors at different development stages of flower in peach., 2015, 29(5): 849-858. (in Chinese)

[18] SUI S, LUO J, MA J，ZHU Q, LEI X, LI M. Generation and analysis of expressed sequence tags from(Wintersweet) flowers for discovering stress-responsive and floral development- related genes., 2012, doi:10. 1155/2012/134596.

[19] 馬婧, 孫文婷, 王晶, 眭順照, 李名揚(yáng). 蠟梅胚胎晚期豐富蛋白基因的克隆及表達(dá)分析. 園藝學(xué)報, 2014, 41(8): 1663-1672.

MA J, SUN W T, WANG J, MU S Z, LI M Y. Cloning and expression analysis of a late embryogenesis abundant protein genefrom., 2014, 41(8): 1663-1672. (in Chinese)

[20] 谷彥冰, 冀志蕊, 遲福梅, 喬壯, 徐成楠, 張俊祥, 董慶龍, 周宗山. 蘋果WRKY基因家族生物信息學(xué)及表達(dá)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(16): 3221-3238.

GU Y B, JI Z R, CHI F M, QIAO Z, XU C N, ZHANG J X, DONG Q L, ZHOU Z S. Bioinformatics and expression analysis of the WRKY gene family in apple., 2015, 48(16): 3221-3238. (in Chinese)

[21] 谷彥冰, 冀志蕊, 遲福梅, 喬壯, 徐成楠, 張俊祥, 周宗山, 董慶龍. 桃WRKY基因家族全基因組鑒定和表達(dá)分析. 遺傳, 2016, 38(3): 254-270.

GU Y B, JI Z R, CHI F M, QIAO Z, XU C N, ZHANG J X, ZHOU Z S, DONG Q L. Genome-wide identification and expression analysis of the WRKY gene family in peach., 2016, 38(3): 254-270. (in Chinese)

[22] PAENICOVá L, DE-FOLTER S, KIEFFER M, HORNER D S, FAVALLI C, BUSSCHER J, COOK H E, INGRAM R M, KATER M M, DAVIES B, ANGENENT G C, COLOMBO L. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family in: New openings to the MADS world., 2003, 15(7): 1538-1551.

[23] ARORA R, AGARWAL P, RAY S, SINGH A K, SINGH V P, TYAGI A K, KAPOOR S. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress., 2007, 8(1): 242.

[24] VERDE I, ABBOTT A G, SCALABRIN S, JUNG S, SHU S, MARRONI F, ZHEBENTYAYEVA T, DETTORI M T, GRIMWOOD J, CATTONARO F, ZUCCOLO A, ROSSINI L, JENKINS J, VENDRAMIN E, MEISEL L A, DECROOCQ V, SOSINSKI B, PROCHNIK S, MITROS T, POLICRITI A, CIPRIANI G, DONDINI L, FICKLIN S, GOODSTEIN D M, XUAN P, DEL FABBRO C, ARAMINI V, COPETTI D, GONZALEZ S, HORNER D S, FALCHI R, LUCAS S, MICA E, MALDONADO J, LAZZARI B, BIELENBERG D, PIRONA R, MICULAN M, BARAKAT A, TESTOLIN R, STELLA A, TARTARINI S, TONUTTI P, ARúS P, ORELLANA A, WELLS C, MAIN D, VIZZOTTO G, SILVA H S, ALAMINI F, SCHMUTZ J, MORGANTE M, ROKHSAR M D. The high -quality draft genome of peach () identifies unique patterns of genetic diversity, domestication and genome evolution., 2013, 45(5): 487-493.

[25] PUIG J, MEYNARD D, KHONG G N, PAULUZZI G, GUIDERDONI E, GANTET P. Analysis of the expression of the AGL17-like clade of MADS-box transcription factors in rice., 2013, 13(5): 160-170.

[26] WEI B, ZHANG R, GUO J, LIU D, LI A, FAN R, MAO L, ZHANG X. Genome-wide analysis of the MADS-box gene family in., 2014, 9(1): e84781.

[27] DUAN W, SONG X, LIU T, HUANG Z, REN J, HOU X, LI Y. Genome-wide analysis of the MADS-box gene family in(Chinese cabbage)., 2015, 290(1): 239-255.

[28] JACK T, BROCKMAN L L, MEYEROWITZ E M. The homeotic geneofencodes a MADS box and is expressed in petals and stamens., 1992, 68(4): 683-697.

[29] CHANG Y, KAO N, LI J, HSU W, LIANG Y, WU J, YANG C. Characterization of the possible roles for B class MADS box genes in regulation of perianth formation in orchid., 2010, 152(2): 837-853.

[30] XIAO H, WANG Y, LIU D, WANG W, LI X, ZHAO X, XU J, ZHAI W, ZHU L. Functional analysis of the rice AP3 homologueby RNA interference., 2003, 52(5): 957-966.

[31] ZAHN L M, LEEBENS-MACK J, MA H, THEISSEN, G. To B or not to B a flower: the role of DEFICIENS and GLOBOSA orthologs in the evolution of the angiosperms., 2005, 96(3): 225-240.

[32] AMBROSE B A, LERNER D R, CICERI P, PADILLA C M, YANOFSKY M F, SCHMIDT R J. Molecular and genetic analyses of thegene reveal conservation in floral organ specification between eudicots and monocots., 2000, 5(3): 569-579.

[33] ROQUE E, SERWATOWSKA J, CRUZ ROCHINA M, WEN J, MYSORE K S, YENUSH L, BELTRáN J P, CA?AS L A. Functional specialization of duplicated AP3-like genes in., 2013, 73(4): 663-675.

[34] HU L, LIU S. Genome-wide analysis of the MADS-box gene family in cucumber., 2012, 55(3): 245-256.

[35] DíAZ-RIQUELME J, LIJAVETZKY D, MARTíNEZ-ZAPATER J M, CARMONA M J. Genome-wide analysis of MIKCC-type MADS box genes in grapevine., 2009, 149(1): 354-369.

[36] ADAMCZYK B J, FERNANDEZ D E. MIKC* MADS domain heterodimers are required for pollen maturation and tube growth in., 2009, 149(4): 1713-1723.

[37] LIU Y, CUI S, WU F, YAN S, LIN X, DU X, CHONG K, SCHILING S, THEI?EN G, MENG Z. Functional conservation of MIKC*-type MADS box genes inand rice pollen maturation., 2013, 25(4): 1288-1303.

[38] PORTEREIKO M F, LLOYD A, STEFFEN J G, PUNWANI J A, OTSUGA D, DREWS G N.is required for central cell and endosperm development in., 2006, 18(8): 1862-1872.

[39] KANG I H, STEFFEN J G, PORTEREIKO M F, LLOYD A, DREWS G N. The AGL62 MADS domain protein regulates cellularization during endosperm development in., 2008, 20(3): 635-647.

[40] XU Z, ZHANG Q, SUN L, DU D, CHENG T, PAN H, YANG W, WANG J. Genome-wide identification, characterization and expression analysis of the MADS-box gene family in., 2014, 289(5): 903-920.

[41] SHU Y, YU D, WANG D, GUO D, GUO C. Genome-wide survey and expression analysis of the MADS-box gene family in soybean., 2013, 40(6): 3901-3911.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Cloning and Expression Analysis of TenGenes in Peach (var.‘Luxing’)

LI Hui-feng1, JIA Hou-zhen1, DONG Qing-long2, RAN Kun1, WANG Hong-wei1

(1Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, Shandong;2College of Horticulture, Northwest A & F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi)

【Objective】The aim of this study is to characterize the novel peach (var.‘Luxing’)genes (s) involved in regulation of vegetative and reproductive growth. The transcriptional levels ofin different tissues were determined to provide a basis for studying the related function ofs in flower development, fruit development and ripening.【Method】The full-length cDNA sequences ofs form ‘Luxing’ peach were isolatedby homologous alignment and RT-PCR confirmation, the obtained cDNA sequences and the deduced amino acid sequences were analyzed with bioinformatics methods; the expression levels ofs were detected in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal, 7 stages of flower development and 5 stages of fruit development using RT-PCR.【Result】The sequencing results showed that ten cDNAs (designated as,,,,,,,,and; GenBank accession No. KU559577, KU559578, KU559585, KU559586, KU559587, KU559588, KU559594, KU559595, KU559596 and KU559597) contained open reading frame (ORF) of 522, 279, 1 065, 828, 723, 600, 636, 534, 750 and 480 bp, respectively. The results of phylogenetic analysis revealed that,, andbelong to AP3, AGL17 and MIKC* subgroups, respectively; and,andbelong to Mα group;,,andbelong to Mγ group. The results of subcellular localization prediction showed that all PpMADS proteins were located in the nucleus. The results of promoter analysis indicated that there were multiple putative-acting elements involved in light responsiveness,defense and stress responsiveness, MYB binding site was involved in drought-inducibility, heat stress responsiveness,low-temperature responsiveness, fungal elicitor responsive element, wound-responsive element, anaerobic induction element, gibberellin-responsive element, auxin-responsive element, MeJA-responsiveness, abscisic acid responsiveness, salicylic acid responsiveness and ethylene-responsive element. Semi RT-PCR and qRT-PCR results showed thatwas expressed in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal and during flower and fruit development.was expressed in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal and during flower development.was expressed in sepal, stamen, petal and during flower development ( except bud stage). All members in Mα and Mγ groups were expressed in stem, leaf, sepal, ovary, stamen, petal and during flower development, some members were expressed during fruit development.【Conclusion】These results indicated that tengenes have crucial regulatory roles in ‘Luxing’ peach vegetative growth, flower and fruit development processes.

‘Luxing’ peach; MADS-box; transcription factor; gene cloning; expression analysis

2016-04-26；接受日期：2016-07-15

山東省良種工程項目（2014）

李慧峰，E-mail：fenglh79@163.com。通信作者冉昆，Tel：0538-8207123；E-mail：rkrl001@126.com