鱘魚骨中硫酸軟骨素的提取及測定

李圣男，蔡大川，鄭家概，張 飛，付 強，陳嘉勛

(中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070)

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鱘魚骨中硫酸軟骨素的提取及測定

李圣男，蔡大川，鄭家概，張 飛，付 強，陳嘉勛

(中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東 廣州 510070)

建立了以鱘魚軟骨為原料，超聲波輔助提取硫酸軟骨素的方法，研究了超聲時間，堿濃度，料液比對提取的影響，并用高效液相色譜測定。結果表明，最佳提取條件為：超聲時間30 min，堿濃度2.0%，料液比1：8。 硫酸軟骨素在10.0～1000 mg/L線性良好，檢出限為2.0 mg/kg，回收率為92%～101%，RSD為1.07%。該方法操作簡便，準確可靠，重復性好，適于鱘魚軟骨中硫酸軟骨素的提取和測定。

鱘魚；硫酸軟骨素；超聲提??；高效液相色譜法

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,簡稱CS)是一類重要的天然酸性黏多糖, 廣泛存在于動物軟骨組織中，是動物蛋白聚糖的代表物質[1-2]。因其具有消炎、抗腫瘤、降血脂和抗粥樣斑塊形成等藥理作用，效果良好且毒副作用小，已應用于醫(yī)藥、食品、生物材料及化妝品等領域[3-4]。 目前市場上的產品多為鯊魚硫酸軟骨素, 但由于鯊魚資源有限, 限制了它的開發(fā)應用。 鱘魚，也稱鱘龍，和鯊魚同樣是地球上最古老和最原始的軟骨魚種，個體較大、壽命較長， 而且我國資源豐富，可作為天然優(yōu)質硫酸軟骨素的提取原料。然而有關鱘魚中的硫酸軟骨素，優(yōu)化提取并且用高效液相色譜測定的研究尚不多，本文以鱘魚軟骨為原料，采用超聲波輔助堿提取，反相高效液相色譜測定，為進一步研究鱘魚硫酸軟骨素提供參考依據[5-8]。

1 實 驗

1.1 實驗儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器(DAD)， 美國安捷倫；FB15067型超聲波清洗器，美國fisherbrand；BSA224S 電子天平，北京賽多利斯科學儀器公司。

1.2 試劑與材料

鱘魚，購于當地市場；硫酸軟骨素標準品，中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)，美國Merck公司；乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；實驗用水為去離子水；其余試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.3 實驗方法

本文采用超聲波輔助堿提取法，從提取時間、堿濃度、料液比等幾方面影響因素進行優(yōu)化，用高效液相色譜進行測定。

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取硫酸軟骨素對照品適量于100 mL容量瓶中，用10%乙腈水溶液配制成濃度為1.00 mg/mL的標準儲備溶液，再將儲備溶液稀釋成10.0、20.0、50.0、100、250、500 μg/mL的系列工作溶液。

1.3.2 軟骨預處理

將鱘魚軟骨組織置于90 ℃ 水浴30 min，再除去肌肉脂肪等雜質，清洗干凈后切碎，用50 ℃烘箱烘干，粉碎備用。

1.3.3 超聲提取時間優(yōu)化

稱取適量鱘魚骨粉五份，按一定料液比加入10%乙腈水溶液，考察超聲時間分別為10, 20, 30，60，120 min 時的CS含量，得最佳提取時間。

1.3.4 堿濃度優(yōu)化

稱取適量鱘魚骨粉五份，按一定料液比加入10%乙腈水溶液，考察分別加入0.1%，0.5%，1%，2%，5% 的氫氧化鈉，超聲相同時間后的CS含量，得最佳堿濃度。

1.3.5 料液比優(yōu)化

稱取適量鱘魚骨粉五份，按 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9的料液比加入10%乙腈水溶液，考察加入相同濃度堿，超聲相同時間的CS含量，得最佳料液比。

1.3.6 色譜條件

色譜柱：月旭C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈/戊烷磺酸鈉溶液=10/90; 流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫35 ℃；檢測波長：195 nm。

2 結果與討論

2.1 超聲提取時間對CS含量的影響

表1 超聲提取時間對CS含量的影響

從表1可知，超聲時間在0～30 min范圍內時，CS含量隨時間延長而增加，30 min是達到峰值,可能是隨著超聲處理時間的延長，超聲的空化作用和機械震蕩作用等，使得細胞破碎越來越完全，CS含量也隨之增大。而時間繼續(xù)延長，CS含量變化并不明顯，考慮到成本和效率等因素，確定最佳超聲提取時間為30 min。

2.2 堿濃度對CS含量的影響

表2 堿濃度對CS含量的影響

由表2可知，在一定范圍內，CS含量隨NaOH濃度升高而增加，當NaOH濃度達到2.0%后，CS含量的增加趨勢放緩?？赡苁荂S在組織中多以蛋白多糖的形式存在，而堿性條件可以使糖蛋白發(fā)生水解，破壞多糖鏈與蛋白質之間的共價鍵，將硫酸軟骨素以游離態(tài)釋放出來。但實驗中也發(fā)現堿濃度越高，導致目標物的雜志干擾越嚴重，考慮到后續(xù)純化的復雜性，本實驗中NaOH最適濃度定為2.0%。

2.3 料液比對CS含量的影響

表3 料液比對CS含量的影響

由表3可知，當料液比為1:8之前，隨著料液比的增大，CS含量有明顯增加，而之后CS含量并沒有顯著提高?？赡苋軇┲刑崛∥餄舛容^低，與鱘魚骨中形成濃度差，擴撒推動力大。隨著料液比的增大，增加了溶質即CS的擴散速度，但增大到一定程度，這種作用相對變弱，增加也就不明顯。綜合考慮，確定最佳料液比為1:8。

2.4 實際樣品含量測定

本文按照上述色譜條件，將硫酸軟骨素標準溶液進行上機分析，如圖1所示，峰形對稱度高，峰底寬度小。取鱘魚骨粉樣品，按照上述最優(yōu)化條件提取后上機測定，色譜圖見圖2，可見基線平穩(wěn)，峰形良好，與其它雜質基線分離。

圖1 標準溶液的液相色譜圖

圖2 鱘魚樣品的液相色譜圖

2.5 線性范圍

使用1.3.1配制的標準工作溶液按上述優(yōu)化的方法進行測定，以硫酸軟骨素色譜峰的面積為縱坐標(Y)，標準質量濃度(X)為橫坐標，求得線性方程為Y=10.925X-14.701，r2=0.9998，結果表明，在10.0～1000 mg/L范圍內，線性良好。硫酸軟骨素檢出限為2.0 mg/kg(信噪比S/N=3)。

2.6 精密度試驗

選取濃度為250.0 μg/mL的標準使用液，進樣量10 μL，連續(xù)進樣7次，求得相對標準偏差RSD為 0.28%。結果表明儀器的精密度良好。

2.7 重復性實驗

取同一批樣品6份，按照上述優(yōu)化的條件進行測定，計算其相對標準偏差RSD為1.07%。結果表明該方法重復性較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

選取濃度為250.0 μg/mL的標準使用液，在室溫分別放置0、2、4、6、8、12、24 h后進樣10 μL，測量其峰面積，求得相對標準偏差RSD為1.76%，表明標準使用液在24 h內穩(wěn)定。

2.9 加標回收率

精密稱取適量鱘魚骨樣品6份，并且加入一定量的硫酸軟骨素對照品溶液，按照上述優(yōu)化條件處理，測定硫酸軟骨素含量，求得加標回收率為92%～101%。方法的準確度良好，可滿足測定要求。

3 結 論

本文采用超聲波堿提法，結合高效液相色譜，建立了完整的從鱘魚軟骨中提取硫酸軟骨素和準確測定的方法，并對提取條件進行了優(yōu)化。該方法簡便準確，靈敏度較高，重復性良好，因此鱘魚軟骨可作為重要的硫酸軟骨素資源，也可為進一步研究提供理論依據。

[1] 于海州,范慧紅,宋玉娟,等.硫酸軟骨素含量測定方法研究進展[J].中國生化藥物雜志,2011, 32(2):160-162.

[2] 李鑫,姚開,賈冬英,等.硫酸軟骨的提取和純化分離技術[J].天然產物研究與開發(fā),2004,16(6):597-600.

[3] 郝淑賢,石紅,楊賢慶,等.鱘魚軟骨成分分析及營養(yǎng)評價[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(9):72-74.

[4] 尹孝萍,黨斌.牦牛氣管中硫酸軟骨素提取工藝研究[J].食品工業(yè),2015,36(9):88-91.

[5] 宋居易,桂萌,馬長偉,等. 鱘魚硫酸軟骨素制備工藝優(yōu)化[J].中國農業(yè)大學學報,2014,19(5):116-123.

[6] 鄭江,關瑞章,黃世玉.鱘魚和鯊魚硫酸軟骨素紅外光譜特性的比較研究[J].光譜學與光譜分析,2008,28(1):106-109.

[7] 鮑倫軍,楊建成,何振華,等.魚翅中硫酸軟骨素的酶解-高效液相色譜法測定[J].分析測試學報,2002,21(5):59-61.

[8] Li S N, Tian M L, Row K H. Effect of mobile phase additives on the resolution of four bioactive compounds by RP-HPLC[J].Int. J. Mol. Sci,2010,11:2229-2240.

Extraction and Determination of Chondroitin Sulfate from Sturgeon*

LISheng-nan,CAIDa-chuan,ZHENGJia-gai,ZHANGFei,FUQiang,CHENJia-xun

(China National Analytical Center Guangzhou, Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals, Guangdong Guangzhou 510070, China)

The method of extraction of chondroitin sulfate from sturgeon by ultrasonic was developed. The effects of ultrasonic treatment time, the concentration of NaOH and material liquid ratio on chondroitin sulfate content were studied, and then detected by high performance liquid chromatography. The results showed that the optimum conditions were as follows: the ultrasonic treatment time was 30 min, the concentration of NaOH was 2.0% and the material liquid ratio was 1:8. The calibration curve of chondroitin sulfate was good in the range of 10.0～1000 mg/L. The determination of limit was 2.0 mg/kg. The average recoveries were in the range of 92%～101% and RSD was 1.07%. This method is simple, accurate and reliable, it can be used for extraction and determination of chondroitin sulfate from sturgeon.

sturgeon; chondroitin sulfate; ultrasonic extraction; high-performance liquid chromatography (HPLC)

廣東省水產專業(yè)鎮(zhèn)產品安全與質量控制創(chuàng)新發(fā)展聯盟建設(No: 2015B090906023)；海產品辨別與品質檢測技術研究(No: 2013B020501005)；動物源性食品安全監(jiān)測技術研究和公共服務平臺(No: 粵科規(guī)財字【2014】208號)。 第一作者：李圣男 (1985-)，男，碩士，主要從事高效液相色譜法在食品檢測中的應用。

O657.7+2

B

1001-9677(2016)021-0111-03