異常黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥和成熟藥對奶牛乳房炎致病菌體外抑菌試驗

努爾艾力·麥提尼亞孜，阿依姑麗·買買提明，阿得力江·吾斯曼，德力拜爾，李建軍，賽福丁·阿不拉*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

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異常黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥和成熟藥對奶牛乳房炎致病菌體外抑菌試驗

努爾艾力·麥提尼亞孜1，阿依姑麗·買買提明1，阿得力江·吾斯曼1，德力拜爾1，李建軍2，賽福丁·阿不拉1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

為研究異常黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥和成熟藥對奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性，分別篩選10味屬于異常黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥和異常黑膽成熟藥，并以乙醇和水為溶媒分別進行提取，通過體外抑菌試驗，檢測引起奶牛乳房炎常見致病菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌的抑菌作用。結(jié)果表明，歐煙堇水提物對3種致病菌均具有廣譜的抗菌作用，達到中敏，抑菌圈直徑為12.60 mm±0.62 mm～10.45 mm±0.33 mm。甘草和歐煙堇醇提物對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為18.03 mm±0.60 mm～18.77 mm±0.21 mm。本試驗為研究治療奶牛乳房炎維藥制劑及抗菌維藥的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

奶牛乳房炎；異常黑膽質(zhì)；病原菌

奶牛乳房炎病例中80%以上是由鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌引起[1]。治療奶牛乳房炎應(yīng)用最多的是抗生素類藥，但它嚴重影響了牛奶的品質(zhì)，人們開始關(guān)注用天然藥物防治奶牛乳房炎。郭慶等[2]檢測8味中藥對奶牛乳房炎病原菌體外抗菌活性，其中金銀花、連翹乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌濃度均為15.63 mg/mL。Kinde H等[3]選取3種藥用植物檢測其抗奶牛乳房炎病原菌的效果，其中蒼耳醇提物在高濃度時對金黃色葡萄球菌的抑菌圈達20.5 mm。異常黑膽質(zhì)是因機體的任何一種體液如果遇到過多的熱燒焦后引起的質(zhì)量和數(shù)量的變化而致[4]。黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥具有降低過盛的黑膽質(zhì)、恢復(fù)黑膽質(zhì)的正常狀態(tài)；黑膽質(zhì)成熟藥具有成熟異常黑膽質(zhì)，并為異常黑膽質(zhì)的順利清除創(chuàng)造必有的條件[5]。研究發(fā)現(xiàn)，維吾爾醫(yī)學(xué)臨床上常以“異常黑膽質(zhì)成熟，清除療法”防治乳腺增生癥；且異常黑膽質(zhì)成熟劑能改善乳腺增生癥，使大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)發(fā)生改變[6-7]。本研究選取香青蘭、破布木實、歐煙堇3味異常黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥及牛舌草、貓兒草、甘草、蘆根、菊苣子、天山堇菜花、龍葵果7味異常黑膽質(zhì)成熟藥，通過體外抑菌試驗，檢測各單味藥水提物和醇提物對奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果，篩選出對奶牛乳房炎致病菌具有較強抑菌活性的單味藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 歐煙堇(Fumariaofficinalis)，牛舌草(Anchusaitalica)，破布木實(Cordiadichotoma)，香青蘭(Dracocephalummoldavica)，貓兒草(Origanummajorana)，甘草(Glycyrrhizauralensis)，蘆根(Phragmitescommunis)，菊苣子(Cichoriumintybus)，天山堇菜花(Violatianshanica)，龍葵果(Solanumnigrum)，以上藥物購自新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院。

1.1.2 菌株 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌均由新疆畜牧科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 水提物的制備 稱取已粉碎過24目篩的藥材20 g，經(jīng)蒸餾水浸泡2 h，在95 ℃條件下1∶15料比蒸餾水回流提取2 h，再經(jīng)過1∶10的料比蒸餾水回流提取2 h，合并提取液，離心，濾紙過濾，濃縮至1 g/mL，冷卻后置于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.2.2 醇提物的制備 稱取已粉碎過24目篩的藥材20 g，經(jīng)750 mL/L的乙醇浸泡2 h，在85℃條件下1∶10料比乙醇回流提取2 h，再經(jīng)過1∶8的料比乙醇回流提取2 h，合并提取液，離心，濾紙過濾，濃縮至1 g/mL，冷卻后置于4℃冰箱中保藏備用。

1.2.3 供試菌的制備 將菌種接種于平板，置于37 ℃條件下培養(yǎng)18 h后挑取典型的單菌落接種至肉湯中，于37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，用平板計數(shù)法計數(shù)，用無菌生理鹽水稀釋至105CFU/mL～109CFU/mL備用。

1.2.4 抑菌圈測定 采用瓊脂平板打孔法[8]。取滅菌平皿加入50 μL供試菌，然后將45 ℃左右的培養(yǎng)基倒入平皿，使培養(yǎng)基與菌液均勻混合。待培養(yǎng)基凝固后，用直徑7 mm的無菌打孔器在瓊脂平板上打6個孔，用無菌針頭挑出孔內(nèi)瓊脂，每個孔分別加入100 μL不同的藥液，每個藥物重復(fù)3次，以無菌水、750 mL/L乙醇為空白對照組，以慶大霉素為陽性對照組。在37 ℃的恒溫條件下，培養(yǎng)18 h～24 h，后測量抑菌圈直徑。

1.2.5 最低抑菌濃度(MIC)的測定 通過打孔法篩選出抑菌作用較強的單味藥，采用試管二倍稀釋法[9]進行MIC的測定。取1 mL裝有滅菌肉湯培養(yǎng)基的試管共12支，第1支試管加入滅菌處理的藥液1 mL(藥液濃度：0.5 g/mL)，混勻后吸取1 mL放置于第2支試管，以此類推，直到第9支吸取1 mL棄去，第10支只加菌不加藥物作為對照管，第11支只加肉湯培養(yǎng)，第12支中加受試藥液1 mL，混勻后吸取1 mL棄去，不加細菌，然后取20 μL的供試菌分別加入到前10支試管中，搖勻后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，并觀察結(jié)果。

1.2.6 最低殺菌濃度(MBC)的測定 取所有無菌生長試管中的肉湯50 μL，劃線接種于瓊脂平板上，在37 ℃的條件下孵育18 h，平板上菌落生長數(shù)小于3個對應(yīng)的最低藥物濃度作為MBC。

2 結(jié)果

2.1 打孔法試驗結(jié)果

由表1可知同種藥水提物和醇提物對3個菌株抑菌效果有很大差異。10味藥對金黃色葡萄球菌的抑菌效果為：甘草醇提物、歐煙堇醇提物為高敏；甘草水提物、龍葵果醇提物、貓兒草水提物、龍葵果水體物、香青蘭水提物、歐煙堇水體物為中敏；破布木實水體物為低敏；牛舌草、蘆根、菊苣子和天山堇菜花的水體物及醇提物為無抑菌作用。10味藥對大腸埃希菌的抑菌效果為：歐煙堇水提物為中敏；香青蘭醇提物、歐煙堇醇提物為低敏；其余8味藥無抑菌作用。10味藥對無乳鏈球菌的抑菌效果為：甘草醇提物為高敏；甘草水提物、歐煙堇水提物為低敏；牛舌草水提物為低敏；其余7味藥無抑菌作用。

表1 10味異常黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥及成熟藥的抑菌結(jié)果(抑菌圈直徑/mm)

注:“15 mm～19 mm”表示高敏；“10 mm～14 mm”表示中敏；“<10 mm”表示低敏；“-”表示無抑菌圈。

Note:"15 mm-19 mm" means highly sensitive；"10 mm-14 mm" means moderate sensitive；"<10 mm" means low sensitive；"-" means not detected.

2.2 MIC和MBC測定結(jié)果

大部分單味藥對3種致病菌均有不同程度的抑菌作用,其中歐煙堇水提物對3種致病菌的MIC為125 mg/mL～250 mg/mL，對大腸埃希菌的MBC為250 mg/mL；甘草水提物及醇提物對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌均有抑菌作用，MIC和MBC分別為62.5 mg/mL～250 mg/mL和125 mg/mL～250 mg/mL；歐煙堇醇提物、貓兒草水提物、龍葵果醇提物對金黃色葡萄球菌的MIC為125 mg/mL～250 mg/mL，MBC為31.25 mg/mL～250 mg/mL。說明上述藥物濃度達到250 mg/mL時均能抑制3種致病菌的生長，且能夠殺滅3種致病菌,其中歐煙堇水提物對3種致病菌均有較好的抑菌作用(表2)。

表2 MIC和MBC測定結(jié)果(mg/mL)

3 討論

關(guān)于天然藥物抗奶牛乳房炎病原菌作用機制的研究已經(jīng)有很多報道。Rakhshandeh H等[11]研究黑種草苜蓿甲醇提取物對奶牛乳房炎病原菌的體內(nèi)和體外抗菌作用，結(jié)果表明，黑種草苜蓿甲醇提取物能夠良好的抑制病原微生物的生長，還能誘發(fā)疾病的愈合。楊玉艾等[12]提取了黃芪多糖，檢測其對奶牛乳房炎病原菌的抑菌效果。試驗表明，黃芪多糖對奶牛乳房炎主要致病菌均有不同的抑菌作用，且隨多糖濃度增大而抑菌作用增強，對大腸埃希菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小分別為11.05 mm±0.31 mm，8.50 mm±0.71 mm，9.32 mm±0.21 mm。高桂生等分別測定了20味中草藥水提物對奶牛隱性乳房炎主要病原菌的體外抗菌效果，結(jié)果顯示各單味草藥對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌均有一定的抗菌活性，尤其是蒲公英、黃連、連翹、穿心蓮、黃芩、紅花、野菊花等7味中草藥的抗菌效果明顯[13]。

本次試驗探討了異常黑膽質(zhì)調(diào)節(jié)藥和異常黑膽質(zhì)成熟藥對奶牛乳房炎致病菌的抗菌作用，分別提取10味藥水提物和醇提物，并通過體外抑菌試驗進行檢測其抗菌活性，從中篩選出了具有抗奶牛乳房炎主要致病菌的單味藥提取物。打孔法檢測10味藥粗提物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和無乳鏈球菌的抑菌作用。結(jié)果顯示，甘草醇提物和水提物均對金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌有良好的抑菌作用，而對大腸埃希菌未檢測到抑菌作用。歐煙堇水提物對3種致病菌均有一定的抗菌作用，抑菌圈大小為12.60 mm±0.62bmm～10.45±0.33fmm。所有藥物中甘草醇提物、歐煙堇醇提物、龍葵果醇提物、貓兒草水提物、龍葵果水體物、香青蘭水提物和破布木實水提物對金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，其中甘草和歐煙堇醇提物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用與慶大霉素的抑菌作用相接近，抑菌圈直徑分別為18.77 mm±0.21bmm、18.03 mm±0.60cmm。本試驗在同一條件下，檢測了10味藥的水提物和醇提物對乳房炎病原菌的敏感性，為防治奶牛乳房炎維吾爾藥制劑的開發(fā)提供理論和參考依據(jù)。

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Inhibition Effects of Abnormal Savda Munziq and Mulayyin Medicines on Pathogenic Bacteria of Cow Mastitis in Vitro

NUERAILI Maitiniyazi1, AYIGULI Maimaitiming1, ADELIJIANG Wusiman1, DELIBAIER1,Li Jian-jun2, SAIFUDING-Abula1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China； 2.InstituteofVeterinaryMedicine,XinjiangAcademyofAnimalScience,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

To study the Abnormal Savda Munziq and Mulayyin medicine against pathogenic bacteria of cow mastitisinvitro,water extracts and alcoholic extracts were taken from 10 kinds of single herbals.The inhibition effect of different extracts to the main pathogens of cow mastitis (Staphylococcusaureus,EscherichiacoliandStreptococcusagalactiae) were observedinvitro.The results showed that, the water extract ofFumariaofficinalishad broad spectral antibacterial activity on the all kinds of pathogens of cow mastitis,and the sensitivity is moderate, the range of antibacterial diameters was 12.60 mm±0.62 mm-10.45 mm±0.33 mm.The alcoholic extracts ofGlycyrrhizauralensisandFumariaofficinaliswere more effective on the inhibition ofStaphylococcusaureus, the range of antibacterial diameters was 18.03 mm±0.60 mm-18.77 mm±0.21 mm.This study provided a scientific basis for the development of traditional Uighur medicines in the external treatments of the mastitis in dairy cows and antibacterial medicines.

cow mastitis；Abnormal Savda；pathogenic bacteria

2016-05-16

新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目(201531130)；新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項目(xjaucxy-yjs-20152005)

努爾艾力·麥提尼亞孜(1995-)，男(維吾爾族)，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S859.3

A

1007-5038(2016)11-0083-04