黃連解毒湯的體外抑菌試驗及拆方研究

王 維，李 丹，劉 洋，李俊姣，范 萌，師琦鵬，楊國棟

(河南科技大學(xué)，河南洛陽 471003)

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黃連解毒湯的體外抑菌試驗及拆方研究

王 維，李 丹，劉 洋，李俊姣，范 萌，師琦鵬，楊國棟*

(河南科技大學(xué)，河南洛陽 471003)

為了研究黃連解毒湯的體外抑菌效果，本試驗采用平板打孔法和試管二倍稀釋法研究黃連解毒湯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌的體外抑菌作用。平板打孔法試驗結(jié)果表明,黃連解毒湯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌的抑菌圈直徑依次為7.50 mm±0.50 mm、14.00 mm±0.80 mm、10.63 mm±0.89 mm。試管二倍稀釋法試驗結(jié)果表明,黃連解毒湯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)依次為250.0、31.25、250.0 g/L；最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)依次為500.0、250.0、250.0 g/L。對黃連解毒湯進行拆方試驗研究結(jié)果表明，黃芩單味藥對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與黃連解毒湯原方的抑菌效果相接近，黃芩是原方中發(fā)揮抑菌作用的主藥。黃芩、黃連兩藥配伍有拮抗作用，使其抑菌作用減弱。本研究為獸醫(yī)臨床上用中藥方劑防治細菌性疾病提供理了論依據(jù)。

黃連解毒湯；體外抑菌；拆方

根據(jù)2012年美國《科學(xué)》雜志報道，中國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)和消費國，中國抗生素原料的年產(chǎn)量約21萬噸，其中有9.7萬噸用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，占年總產(chǎn)量的46.2%[1]?？股卦陬A(yù)防、治療畜禽疾病等方面發(fā)揮著積極作用，同時在生物體和環(huán)境中殘留所引起的負面效應(yīng)也日益增大?？股氐臑E用產(chǎn)生了“耐藥菌”。多重耐藥菌的出現(xiàn)導(dǎo)致抗菌藥在獸醫(yī)臨床上療效減弱或消失，畜禽病程延長，并引起相應(yīng)的并發(fā)癥，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2-4]。與抗生素相比，細菌對抗感染中藥及其復(fù)方不易產(chǎn)生耐藥性，且部分中藥具有延緩、消除、逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的作用[5]。因此，開展中藥復(fù)方的抗菌作用研究對于保障畜禽健康養(yǎng)殖、可持續(xù)地發(fā)展具有重要意義。本試驗以臨床上常用于治療細菌性感染的方劑黃連解毒湯為研究對象，研究其對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌的體外抑菌作用，以期為獸醫(yī)臨床上用中藥方劑防治細菌性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材和主要試劑 黃連解毒湯方劑組成：黃連9 g，黃芩6 g，黃柏6 g，梔子9 g， 所用藥材均買自北京同仁堂飲片有限公司洛陽分店。蛋白胨、酵母膏(批號：20130620、20130323)，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠產(chǎn)品；牛肉粉、酸水解酪蛋白(批號：20151104、1108B0314)，Solarbio公司產(chǎn)品；營養(yǎng)瓊脂(批號：20130208)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；可溶性淀粉(批號：20150406)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品；氯化鋇(批號：1311101)，西隴化工股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；YXQ.SG41.280A型高壓滅菌鍋，上海寰熙醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；HHA-12型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海喆鈦機械制造有限公司產(chǎn)品；BSA124S-CW電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗菌種 大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門菌(Salmonella) 均由河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院微生物實驗室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 中藥及復(fù)方提取液的制備 采用水煎法制備中藥提取液，按照黃連解毒湯的配方將購買好的中藥用電子天平稱??；將量取好的藥劑加入清洗干凈的煎藥鍋中，在煎藥鍋中加500 mL蒸餾水并侵泡30 min，武火加熱至沸后，文火保持微沸30 min，用兩層無菌紗布過濾，濾出煎液，放置到提前準(zhǔn)備好的三角瓶中，隨后將藥渣二次水煮，合并濾液，過濾，調(diào)整藥液濃度至含生藥量1 g/mL，滅菌后低溫保存。拆方試驗中的其他中藥提取液按上述同樣的步驟進行。

1.2.2 供試菌液的制備 將保存在冰箱的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，搖床上以150 r/min、37℃搖24 h。取出后，用滅菌的生理鹽水稀釋，以0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，調(diào)其含菌量為1.5×108CFU/mL。然后用滅菌的生理鹽水將菌種稀釋1 000倍，使其含菌量為105CFU/mL～106CFU/mL備用[6]。

1.2.3 體外抑菌試驗 抑菌試驗采用瓊脂平板打孔法，將制備好的MH瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂布供試菌液，用直徑6 mm的打孔器打孔，每個平皿打3孔，孔距>20 mm，將中藥提取液灌注到孔中，每孔灌注中藥提取液50 μL。將平皿放置到37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，觀察試驗結(jié)果，測量抑菌圈直徑，取平均值，試驗重復(fù)5次。

1.2.4 測定最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC) 采用試管2倍稀釋法。試驗共設(shè)4組，第1組試驗取10支經(jīng)過高壓滅菌的試管，在第1～9管中均加入無菌的肉湯培養(yǎng)基2 mL，在第1個管中加入中藥提取液2 mL，混勻后取2 mL加入第2管，以此類推，至第 9管取2 mL廢去。第10個試管做陽性對照，即不加中藥提取液，添加無菌的肉湯培養(yǎng)基2 mL。最后向10支試管中分別加入50 μL供試菌液并震蕩使其均勻。第2組為陰性對照組，區(qū)別在于試管中不加供試菌液，其他和第1組相同。第3組，第4組為重復(fù)試驗組，加樣過程同第1組。將試管放置到恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)18 h。陽性對照組出現(xiàn)細菌生長的渾濁現(xiàn)象，陰性對照組無細菌生長的渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)，則試驗成立，觀察其他試管狀況。不出現(xiàn)渾濁的濃度是該復(fù)方的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。將所有清晰無菌生長的試管培養(yǎng)液以劃線法接種于普通瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，以菌落不超過5個為該藥物最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)[7]。

1.2.5 拆方試驗 拆方試驗是為進一步研究復(fù)方中各單味藥的抗菌作用，以及某兩個或幾個單味藥之間的相互作用，以期了解單味藥的抗菌作用以及不同藥之間是否存在協(xié)同作用。鑒于此，對黃連解毒湯方劑進行了拆方。復(fù)方組成以及方劑拆方設(shè)計見表1。根據(jù)排列組合對黃連解毒湯進行拆方，可分為15種新的組合分別為：組合1： 黃連9 g；組合2：黃芩6 g；組合3：黃柏6 g；組合4：梔子9 g；組合5：黃連9 g，黃芩6 g；組合6：黃連9 g，黃柏6 g；組合7：黃連9 g，梔子9 g；組合8：黃芩6 g，黃柏6 g；組合9：黃芩6 g，梔子9 g；組合10：黃柏6 g，梔子9 g；組合11：黃連9 g，黃芩6 g，黃柏6 g；組合12：黃連9 g，黃芩6 g，梔子9 g；組合13：黃連9 g，黃柏6 g，梔子9 g；組合14：梔子9 g，黃柏6 g，黃芩6 g；組合15：黃柏6 g，黃芩6 g，梔子9 g，黃連9 g。

表1 黃連解毒湯的拆方組合

注： 表中“+”表示組合中含有該種中藥，表中“0”表示組合中不含有該種中藥。

Note:"+"in table shows that this combination contains the traditional Chinese medicine, "0"in table shows that this combination does not contain the traditional Chinese medicine.

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯的抑菌作用

利用平板打孔法，將培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，將其取出，觀察培養(yǎng)皿上各個部分接種菌種的生長情況，在培養(yǎng)基表面距離打孔位置比較遠的地方可以清晰的看到分布均勻，邊緣整齊的菌落。而在打孔周圍部分則出現(xiàn)大小不等的邊界較為清晰的抑菌圈。黃連解毒湯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌的抑菌圈直徑依次為7.50 mm±0.50 mm、14.00 mm±0.80 mm、10.63 mm±0.89 mm，從試驗結(jié)果來看金黃色葡萄球菌對黃連解毒湯有較高的敏感性，與大腸埃希菌、沙門菌相比差異極顯著(P<0.01)。

2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度的測定

采用試管二倍稀釋法，測定黃連解毒湯的MIC和MBC。試驗結(jié)果顯示黃連解毒湯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)依次為250.0、31.25、250.0 g/L；最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)依次為500.0、250.0、250.0 g/L。

2.3 黃連解毒湯的拆方試驗

將新拆方出來的組合方劑對金黃色葡萄球菌再次進行體外抑菌試驗，試驗方法步驟與1.2.3中所述一致。試驗測得黃連解毒湯原方(組合15)的抑菌圈直徑為14.0 mm，其對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC為31.25 g/L和250.0 g/L；組合2的抑菌圈直徑為13.83 mm，組合2對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為125.0 g/L和125.0 g/L。上述試驗結(jié)果表明，單從對金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗效果來看，黃芩單味藥的抑菌效果與黃連解毒湯原方的抑菌效果相接近，黃芩是原方中發(fā)揮抑菌作用的主藥。此外，組合1的抑菌圈直徑為9.63 mm，其對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC為125.0 g/L和250.0 g/L，這表明黃連單味藥對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，其他方劑抑菌效果不明顯。15種組合對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小以及MIC、MBC數(shù)據(jù)見表2和表3。

表2 黃連解毒湯拆方組合對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05);大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Values with different small letters in the same column mean significant difference (P<0.05);and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

3 討論

3.1 關(guān)于中藥的體外抑菌作用

數(shù)千年來，中獸醫(yī)藥在治療各種動物疾病方面發(fā)揮著重要作用，特別是在防治疫癘及實熱證等動物病證的實踐過程中積累形成了一些有效的經(jīng)典方藥。而動物的疫癘及實熱證多為現(xiàn)代獸醫(yī)學(xué)中的感染性疾病[6]?，F(xiàn)代藥理實驗證明，很多中藥在抑菌方面效果明顯，而其中清熱解毒藥的抗菌作用尤為突出[8-10]。黃連解毒湯首載于東晉名醫(yī)葛洪編著的《肘后備急方》，但原書中給未出方名，直到唐代王燾的《外臺秘要》才冠名為黃連解毒湯。該方由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥按照3∶2∶2∶3的比例配伍組成，是清熱解毒類方劑的代表方，具有清熱、瀉火、解毒的功效，主治實熱火毒、三焦熱盛之證。本試驗研究了黃連解毒湯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌的體外抑菌作用。結(jié)果表明黃連解毒湯對這3種細菌都有較明顯的抑菌作用，尤其對金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌效果，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致[11]。

表3 黃連解毒湯拆方組合對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定結(jié)果

注：“-”表示在所設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)未測出該藥的MIC和MBC。

Note:"-"in table shows that at the certain concentration range, the MIC or MBC were not detected.

3.2 黃連解毒湯抑菌試驗的拆方研究

在臨床上，中藥的使用主要以復(fù)方的形式出現(xiàn)，一個中藥復(fù)方由多種單味藥構(gòu)成，相互之間按照一定的比例配伍。相同的復(fù)方，由于各單味藥之間的比例不同，其藥效也會有很大的差異。中藥方劑的配伍理論是祖國醫(yī)學(xué)智慧的結(jié)晶。多年來，人們一直試圖運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法, 從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度揭示其科學(xué)內(nèi)涵。拆方是目前應(yīng)用于中藥復(fù)方組方理論研究的最為常用的方法[12]。本試驗對黃連解毒湯對金黃色葡萄球菌的抑菌作用進行了拆方研究，從試驗結(jié)果可以看出黃連解毒湯原方(組合15)的抑菌圈直徑為14.0 mm，其對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC為31.25 g/L和250.0 g/L；組合2的抑菌圈直徑為13.83 mm，其對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為125.0 g/L和125.0 g/L。即單從對金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗效果來看，黃芩單味藥的抑菌效果與黃連解毒湯原方的抑菌效果相接近，黃芩是原方中發(fā)揮抑菌作用的主藥。此外，黃連單味藥對金黃色葡萄球菌也有明顯的抑菌作用。組合3、組合4、組合10的試驗結(jié)果顯示，黃柏、梔子無論是單味藥，還是兩者的組合方劑在體外對金黃色葡萄球菌的抑菌作用都不明顯。組合15、組合2、組合5、組合11、組合12的試驗結(jié)果顯示盡管黃芩、黃連單味藥對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌效果，但是黃芩、黃連兩者組合，黃芩、黃連與梔子或者黃柏組成的三味藥的組合對金黃色葡萄球菌的抑菌作用都比較弱。據(jù)徐君等人報道黃芩、黃連配伍后，各成分生物利用度均降低。配伍后黃芩苷吸收速率減慢，同時吸收度降低[13]。馮瑾[14]等研究也出現(xiàn)類似的結(jié)果，黃芩黃連配伍使用，各成分生物利用度均不同程度降低。另據(jù)文獻報道，黃連與黃芩共同煎煮可產(chǎn)生沉淀，沉淀物主要由黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿、黃芩甙和漢黃芩甙等組成。產(chǎn)生沉淀的原因是由于黃連中含有的原小檗堿型生物堿與黃芩中含有的多酚類化合物黃芩苷相互結(jié)合，生成分子量較大的水不溶物，而沉淀煎出液中黃連生物堿和黃芩中黃酮化合物的含量均有不同程度下降[15]。由此可見，黃芩、黃連兩者組合對金黃色葡萄球菌的抑菌作用減弱可能是由于兩種中藥的化學(xué)成分在煎煮過程中形成沉淀造成的。本研究結(jié)果可為獸醫(yī)臨床上用黃連解毒湯防治動物細菌性疾病提供理論依據(jù)。

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InVitroAntibacterial Experiment of Huanglian Jiedu Decoction and Decomposed Recipes Experiment

WANG Wei, LI Dan, LIU Yang, LI Jun-jiao, FAN Meng, SHI Qi-peng, YANG Guo-dong

(HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang，Henan，471003,China)

Huanglian Jiedu decoction was employed to test its antibacterial effect on the common clinical pathogenic bacteria (E.coli,S.aureus,Salmonella) by using agar diffusion plate method and tube twice times dilution methodinvitro.Results of agar diffusion plate method showed that the inhibition zone diameters ofE.coli,S.aureus,Salmonellawere 7.50 mm±0.50 mm, 14.00 mm±0.80 mm, 10.63 mm±0.89 mm, respectively.Results of tube twice times dilution method showed that the minimal inhibitory concentrations (MIC) ofE.coli,S.aureus,Salmonellawere 250.0, 31.25, 250.0 g/L, respectively; and the minimum bactericidal concentrations(MBC) ofE.coli,S.aureus,Salmonellawere 500.0, 250.0, 250.0 g/L, respectively.Results of decomposed recipes experiment showed that antibacterial effect of Radix Scutellariae onS.aureusbasically coincided with that of Huanglian Jiedu decoction.Radix Scutellariae is the principal agent of Huanglian Jiedu decoction in the antibacterial experiment.Rhizoma Coptidis had obvious antagonism against Radix Scutellariae on the antibacterial effect.The results provided theoretical basis for clinical application of Huanglian Jiedu decoction.

Huanglian Jiedu decoction；antibacterial testinvitro；decomposed recipe

2016-06-16

河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計劃(SRTP)項目(2014266)；國家自然科學(xué)基金項目(31302133)；河南科技大學(xué)博士啟動基金項目(09001731)；河南省產(chǎn)學(xué)研合作項目(162107000031)

王 維(1992-) 女，河南新鄉(xiāng)人，學(xué)士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。*通訊作者

S853.7

A

1007-5038(2016)11-0065-05