披針葉黃華生物堿的毒性試驗(yàn)研究

李 勇，魏彥明，石雅芳

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，寧夏銀川 750021；3.寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校，寧夏銀川 750021)

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披針葉黃華生物堿的毒性試驗(yàn)研究

李 勇1,2，魏彥明1*，石雅芳3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，寧夏銀川 750021；3.寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校，寧夏銀川 750021)

通過披針葉黃華堿對(duì)小鼠毒性試驗(yàn)的研究，復(fù)制出喹喏里西啶類生物堿中毒病理學(xué)模型。結(jié)果表明，小鼠一次性灌服總堿200 mg/kg時(shí)，即出現(xiàn)急性中毒死亡，由此大致推斷其LD50≤200 mg/kg；對(duì)慢性中毒小鼠的血液生化檢查中發(fā)現(xiàn)，披針葉黃華堿可使小鼠體內(nèi)血紅蛋白、紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量升高,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)含量升高，尿素氮(BUN)濃度下降; 對(duì)慢性中毒小鼠的臨床病理學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)，以心、肝、肺、腎實(shí)質(zhì)器官的細(xì)胞變性壞死為主，尤其是以肝臟、腎臟的損傷較為嚴(yán)重，也說明披針葉黃華堿毒性作用的靶器官可能是肝臟和腎臟。

披針葉黃華堿；毒性；試驗(yàn)

披針葉黃華(Thermopsislanceolata)別名“牧馬豆”，屬豆科野決明屬植物，廣泛分布于我國的內(nèi)蒙古、陜西、山西、寧夏、甘肅等地區(qū)[1]。披針葉黃華屬于有毒植物，家畜采食其全草或種子后會(huì)引起中毒[2]。披針葉黃華既是一種有毒植物，同時(shí)也是一種藥用植物。資料顯示，在我國《中藥學(xué)大辭典》中記載了披針葉黃華的3個(gè)種，寧夏中草藥手冊(cè)也有相關(guān)記載，西北民間常用其治療咳嗽痰喘[3]。披針葉黃華引起家畜中毒的主要生物活性成分是生物堿。據(jù)報(bào)道[4]，此類植物富含喹喏里西啶(quinolizidine)類生物堿，地上部分的全草主要含有的生物堿是黃華堿(thermopsine)、臭豆堿(anagyrine)、阿良亭堿(argentine)、羽扇豆堿(lupanine)、金雀花堿(cytisine)等；種子部分主要為金雀花堿，其次為黃華堿、鷹爪豆堿(sparteine)、N-甲基金雀花堿(N-methylcytisine)等[3]。此類生物堿具有抗癌、抗心率失調(diào)、抗微生物、抗?jié)兒蜕甙准?xì)胞等作用[6]。本試驗(yàn)通過披針葉黃華總堿對(duì)小鼠毒性的研究，復(fù)制喹喏里西啶類生物堿中毒病理模型，搞清喹喏里西啶類生物堿的毒性特點(diǎn)，為闡明披針葉黃華的主要有毒成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 披針葉黃華全草 由寧夏鹽池縣草原站提供并鑒定。將披針葉黃華洗凈、曬干、粉碎后備用。

1.1.2 試驗(yàn)用藥物 采用超聲波輔助甲醇浸提法對(duì)披針葉黃華進(jìn)行提取處理，再經(jīng)酸溶解、堿處理，用氯仿萃取出得到披針葉黃華堿混合物[7]。定量稱取總堿，用滅菌注射用水溶解，配制成所需濃度的藥液，高溫滅菌，5℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 滅菌注射用水，石家莊四藥有限公司產(chǎn)品；氯仿(AR)，批號(hào)20140618，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇(AR)，批號(hào)20140706，天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品；其余均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 AR1140電子天平；回流裝置，減壓蒸餾裝置；2XZ-2旋片式真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠生產(chǎn)；RE52-05型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；Db-2型不銹鋼電熱板，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司產(chǎn)品；VGT-1620QTD型超聲波清洗機(jī)，深圳市興宏業(yè)投資有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠35只，體重18 g～22 g，雌雄各半，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于室溫下自由飲水采食，飼喂全價(jià)飼料。

1.2 方法

1.2.1 披針葉黃華堿對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn) 取小鼠5只，按照200 mg/kg體重的給藥劑量灌服總堿溶液，給藥后觀察小鼠的臨癥狀，并記錄中毒表現(xiàn)與死亡時(shí)間。

1.2.2 披針葉黃華堿對(duì)小鼠的慢性毒性試驗(yàn) 取小鼠30只，隨機(jī)分成6組，每組5只。分別按75、100、125、150、175、200 mg/kg體重劑量每天灌服總堿水溶液，觀察小鼠的臨床表現(xiàn)，每7 d測(cè)量體重1次，詳細(xì)記錄小鼠的中毒表現(xiàn)和死亡時(shí)間。對(duì)于已經(jīng)發(fā)生中毒死亡的小鼠立即剖檢，觀察主要臟器的病理表現(xiàn)，將其肝、肺、腎組織用100 mL/L福爾馬林固定，石蠟包埋HE染色，觀察組織學(xué)變化[8]。

1.2.3 血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的測(cè)定 分別在試驗(yàn)開始前以及試驗(yàn)的第10、20、30、40、50、60天，每天上午進(jìn)食前空腹采血，每只小鼠采血2份，1份肝素鈉抗凝血，用于血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定，檢測(cè)指標(biāo)包括血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞比積(HCT)、紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)。另1份靜置 1 h 后以 5 000 r/min 離心15 min 分離血清，用美國 MD 公司 1800型自動(dòng)血液生化儀進(jìn)行血清生化指標(biāo)的測(cè)定， 檢測(cè)指標(biāo)包括谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、血清中白蛋白(ALB)、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(CREA)、血清鈣(CA)、血清磷(P)含量。以上指標(biāo)均按照儀器使用說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

通過試驗(yàn)觀察，不同劑量的總堿對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果見表1。小鼠中毒表現(xiàn)為狂燥不安，神經(jīng)癥狀明顯,全身肌肉陣縮，呈犬坐姿勢(shì)，無法站立, 共濟(jì)失調(diào)，渾身上下抽搐, 瀕死前呈現(xiàn)蛙跳動(dòng)作。

2.2 慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 死亡時(shí)間與中毒癥狀 披針葉黃華堿對(duì)小鼠的毒性呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(表2)。隨著給藥劑量的不斷增加，中毒小鼠出現(xiàn)死亡的時(shí)間明顯提前。從開始灌服的第15天開始，F(xiàn)組的小鼠全部死亡，E組僅死亡1只，A至D組均無出現(xiàn)死亡；第30天時(shí)，A、B、C組無死亡，D死亡1只，E組全部死亡；第45天時(shí)，A組無死亡，B有1只死亡，C組有2只死亡，D組累計(jì)死亡3只；第60天時(shí)，A至F組則全部死亡。發(fā)生慢性中毒的小鼠，主要表現(xiàn)為全身被毛粗亂，無光澤，呆立，拱背，共濟(jì)失調(diào)，無法站立，精神不振，目光呆滯，嗜睡，臥地不起，呼吸急促，犬坐姿勢(shì)，瀕死期甚至出現(xiàn)垂直跳躍等。灌服到第45天時(shí),C、D組個(gè)別懷孕的小鼠發(fā)生了流產(chǎn)死胎現(xiàn)象。

2.2.2 血液常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果 小鼠血紅蛋白與白細(xì)胞數(shù)量升高，與試驗(yàn)前比較差異顯著(P<0.05)；小鼠紅細(xì)胞數(shù)量升高，與試驗(yàn)前比較差異顯著(P<0.05)，在第30天時(shí)，與試驗(yàn)前比較差異極顯著(P<0.01)；紅細(xì)胞比積(壓積)的變化，與試驗(yàn)前后比較無顯著差異(P>0.05)(表3)。

2.2.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果 小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性升高，與試驗(yàn)前比較差異顯著(P<0.05)；小鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性、肌酸激酶(CK)明顯升高，與試驗(yàn)前比較差異極顯著(P<0.01)；小鼠血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量在試驗(yàn)過程中均表現(xiàn)差異不顯著(P>0.05)(表4)。小鼠的血鈣(CA)、血磷(P)濃度與試驗(yàn)前比較差異不顯著(P>0.05)；血清中的尿素氮(BUN)濃度從第20天開始出現(xiàn)顯著下降，與試驗(yàn)前比較差異極顯著(P<0.01)(表5)。

表1 披針葉黃華堿對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

表2 披針葉黃華堿對(duì)小鼠慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

表3 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

表4 血清生化檢測(cè)結(jié)果

注：“a”t檢驗(yàn)，P<0.05。

Note:"a" shows t test,P<0.05.

表5 血清生化檢測(cè)結(jié)果

注：“a”t檢驗(yàn)，P<0.05；“b”t檢驗(yàn)，P<0.01。

Note:"a" shows t test,P<0.05;"b" shows t test,P<0.01.

2.2.4 病理剖檢結(jié)果 發(fā)生慢性中毒的死亡小鼠，其腸黏膜充血、出血明顯，部分腸系膜發(fā)生脫落壞死。肝臟腫大明顯，邊緣鈍圓，且質(zhì)地變脆。腎臟腫大，顏色變淺，髓質(zhì)有壞死灶。肺臟充血腫大，有大量滲出液。腸系膜淋巴結(jié)腫大。心臟體積增大，出現(xiàn)心包積液，且有大量纖維蛋白滲出。

2.2.5 病理組織學(xué)檢查結(jié)果 肝臟：肝細(xì)胞腫大，并發(fā)生凝固性壞死。肝竇隙狹窄，中央靜脈和葉下靜脈、小葉間靜脈多呈擴(kuò)張淤血(圖1和圖2)。

肺臟：泡壁毛細(xì)血管和肺動(dòng)脈、肺靜脈擴(kuò)張充血，有些肺泡內(nèi)有少量紅細(xì)胞,呈輕度肺出血。肺間質(zhì)細(xì)胞增生、水腫明顯(圖3和圖4)。

腎臟：腎小球血管輕度擴(kuò)張充血，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹填充腎小囊。腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔狹窄，上皮細(xì)胞脫落，僅留一些細(xì)胞核落入管腔，間質(zhì)毛細(xì)血管充血,有的呈點(diǎn)狀出血(圖5和圖6)。

心臟：心肌纖維腫脹，肌漿內(nèi)出現(xiàn)多量紅色細(xì)小顆粒，有的橫紋不清，間質(zhì)毛細(xì)血管充血(圖7和圖8)。

圖1 肝小葉變成“島嶼狀”(100×)

Fig.1 Liver lobule structure disordered(100×)

圖2 竇狀隙中充滿血細(xì)胞 (400×)

Fig.2 Hyperaemia in liver sinusoids(400×)

圖3 肺部充血水腫(100×)

圖4 肺泡內(nèi)有水腫液,肺靜脈擴(kuò)張充血(400×)

圖5 腎小球毛細(xì)血管充血,內(nèi)皮細(xì)胞腫脹 (100×)

圖6 腎小管上皮細(xì)胞脫落(400×)

Fig.6 The desquamation of epithelial cells in renal tubules(400×)

圖7 心肌擴(kuò)張出血(100×)

Fig.7 The expanding and bleeding in myocadia(100×)

圖8 心肌壞死(400×)

Fig.8 Myocardial necrosis(400×)

3 討論

3.1 披針葉黃華堿對(duì)小鼠的急性中毒試驗(yàn)

據(jù)《中華本草》記載，披針葉黃華所含的生物堿對(duì)小鼠腹腔注射的LD50為1 938 mg/kg[9-10]；以靜脈注射的方式對(duì)家兔垂頭的劑量為603 mg/kg±73 mg/kg，對(duì)其呼吸麻痹的劑量為862 mg/kg；以靜脈注射的方式對(duì)犬的垂頭劑量為416 mg/kg±21 mg/kg[10-13]。本試驗(yàn)給小鼠一次性灌服總堿200 mg/kg時(shí)，即出現(xiàn)急性中毒癥狀，在2 min～3 min之內(nèi)迅速死亡，中毒表現(xiàn)為狂躁不安，渾身抽搐，共濟(jì)失調(diào)，瀕死前呈蛙跳動(dòng)作，由此可以大致推斷其LD50≤200 mg/kg。

3.2 披針葉黃華堿對(duì)小鼠的慢性中毒試驗(yàn)

試驗(yàn)按75、100、125、150、175、200 mg/kg劑量給小鼠每天灌服總堿水溶液，復(fù)制了慢性中毒的模型，結(jié)果200 mg/kg劑量組的小鼠在15 d內(nèi)全部死亡。其他5組的試驗(yàn)小鼠分別在45 d和60 d內(nèi)全部死亡。臨床病理學(xué)檢查表明，披針葉黃華堿對(duì)小鼠血常規(guī)和血液生化指標(biāo)均有不同程度的影響，可使血紅蛋白含量、紅細(xì)胞及白細(xì)胞數(shù)量升高；可引起谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)的含量升高，尿素氮(BUN)濃度出現(xiàn)顯著下降。病理學(xué)檢查中還發(fā)現(xiàn)，以心、肝、肺、腎實(shí)質(zhì)器官的細(xì)胞變性壞死為主，尤其是以肝臟、腎臟的損傷較為嚴(yán)重，這也說明披針葉黃華堿的毒性作用的靶器官可能是肝臟和腎臟。

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Study on Toxicity of Alkaloids ofThermopsislanceolata

LI Yong1，2, WEI Yan-ming1, SHI Ya-fang3

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu，730070,China; 2.NingxiaVocationalandTechnicalCollege,Yinchun,Ningxia,750021,China; 3.AgriculturalSchoolofNingxia,Yinchun,Ningxia,750021,China)

The aim of the paper was to study the toxicity of alkaloids ofThermopsislanceolataand copy out here in quinolizidine poisoning pathology model.The results showed that mice drenched with 200 mg/kg of alkaloids fromThermopsislanceolatawere all dead.As results,LD50was less than 200 mg/kg.Blood biochemical examination of chronic intoxication in mice found that alkaloids ofThermopsislanceolataincreased HGB,RBC,WBC,ALT,AST and CK,but decreased BUN.The cells in heart,liver,kidney were appeared degeneration and necrosis,especially in liver and kidney,these two organs are the target organs.

alkaloid ofThermopsislanceolata; toxicity；test

2016-05-11

寧夏高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NGY2016251)

李 勇(1980-),男,寧夏銀川人,副教授,主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

S859.87；S853.7

A

1007-5038(2016)11-0078-05