實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板核酸提取方法的比較

羅忠永，王 印，楊澤曉

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板核酸提取方法的比較

羅忠永，王 印*，楊澤曉

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130)

對(duì)病料核酸提取前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，選擇酚/氯仿法、試劑盒提取法和DNA/RNA同提取法，比較提取效果，為實(shí)驗(yàn)室核酸提取提供參考。配制模擬樣品，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較3種方法提取效果。結(jié)果表明，提取純度為試劑盒提取法>酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法。提取效率為酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法>試劑盒提取法。表明各提取方法效果差異顯著(P<0.01)，為實(shí)驗(yàn)室核酸提取提供了參考。

核酸提取方法；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；提取效果

核酸提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，能否提取高質(zhì)量的核酸分子直接關(guān)系試驗(yàn)的成敗。1869年，F(xiàn)riedrich Miescher首次成功的提取了核酸[1]。經(jīng)典的核酸提取主要包括密度梯度離心法、胍鹽裂解法、堿裂解法、CTAB裂解法和酚抽提法[2]。目前核酸提取的研究方向是尋找特異的核酸提取材料，并逐步實(shí)現(xiàn)核酸提取的自動(dòng)化，避免干擾；實(shí)現(xiàn)快速高質(zhì)量的核酸自動(dòng)提??；技術(shù)的關(guān)鍵是尋找特異的核酸提取材料，并運(yùn)用工程學(xué)原理實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[3-7]?；诖判暂d體開發(fā)的各種磁珠法具有很好應(yīng)用前景[8-12]?？紤]到提取效果和成本，目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣的仍是胍鹽裂解法和酚抽提法，結(jié)合醇或二氧化硅基質(zhì)純化法，組成了最常用的抽提試劑盒。本文比較研究酚/氯仿法、試劑盒提取法和DNA/RNA同提取法，以期為實(shí)驗(yàn)室核酸提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

RNAiso plus 、SYBR○Rpremix dimer eraserTM(Perfect real time)購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；Tris-平衡酚購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DP304-02 DNA 提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料核酸提取前處理方法優(yōu)化 病料核酸提取前通常對(duì)病料的處理為反復(fù)凍融研磨和適當(dāng)稀釋，筆者在長(zhǎng)期病料核酸提取過程中發(fā)現(xiàn)病料稀釋對(duì)病料核酸提取效果影響很大，基于此，本實(shí)驗(yàn)室在病料液氮反復(fù)凍融研磨3次的基礎(chǔ)上，使用滅菌生理鹽水對(duì)病料凍融研磨液進(jìn)行稀釋，使用酚/氯仿法研究不同稀釋度對(duì)病料核酸提取的影響，探究最適的稀釋度。按病料凍融研磨液：滅菌生理鹽水(V/V)=1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5稀釋記為樣品，使用改進(jìn)酚/氯仿法提取樣品核酸，通過觀測(cè)proteinase K水浴3 h后消化情況和無水乙醇沉淀效果探究最適的稀釋度。

1.2.2 3種核酸提取方法對(duì)比

1.2.2.1 模擬樣品制備 PRRSV陰性樣品(使用農(nóng)業(yè)部推薦RT-PCR檢疫標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證)液氮反復(fù)凍融研磨3次，按病料凍融研磨液：滅菌生理鹽水(V/V)=1∶4稀釋，取200 μL樣品加入2 μL質(zhì)粒(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，核酸濃度為54.6 ng/μL)，混合均勻記為模擬樣品。

1.2.2.2 模擬樣品核酸提取 取模擬樣品，分別使用改進(jìn)酚/氯仿法[3]，天根 DP304-02試劑盒提取法(具體方法參考試劑盒說明書)和DNA/RNA同提取法[6]提取核酸，50 μL滅菌超純水溶解制成DNA提取液。以上所有操作在同一試驗(yàn)中平行完成，同試驗(yàn)每種方法3次重復(fù)，并不同日做3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.2.3 DNA提取液純度測(cè)定 使用Thermo Nanodrop 2000核酸蛋白儀測(cè)定DNA提取液核酸純度，數(shù)據(jù)使用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)提取效率 利用筆者建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(已投稿，未發(fā)表；根據(jù)編碼PRRSV M蛋白的基因序列設(shè)計(jì)；引物序列F：ACCTCCAGATGCCGTTTGT，R：ATGTGC CGTTGACCGTAGT)檢測(cè)提取效率。PCR反應(yīng)體系：Dimer Eraser(Perfect real time)2×10 μL，滅菌雙蒸水 6 μL，引物F(濃度10 μmol/L) 1 μL，引物R(濃度10 μmol/L) 1 μL，DNA提取液2 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 3 min；95℃ 10 s,54.4℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定DNA提取液的DNA模板拷貝數(shù),計(jì)算提取效率。

1.2.3 試驗(yàn)重復(fù)及數(shù)據(jù)處理 3種提取方法均在同次試驗(yàn)中完成，每種方法同次試驗(yàn)均做3次重復(fù)，并做不同日3次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用生物學(xué)軟件SPSS分析，數(shù)據(jù)處理中遵循生物統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

2 結(jié)果

2.1 病料核酸提取前處理方法優(yōu)化

通過酚/氯仿法比較不同稀釋度對(duì)病料核酸提取的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)病料凍融研磨液滅菌生理鹽水(V/V)≤1∶4時(shí)，Proteinase K可以較好地消化樣品，無水乙醇沉淀后無明顯雜質(zhì)沉淀，提取的DNA較純；綜合考量核酸提取量和核酸提取純度，本試驗(yàn)結(jié)果表明1∶4為最適稀釋度(圖1和圖2)。

圖1 Proteinase K水浴3 h消化情況

圖2 無水乙醇沉淀效果

Fig.2 Precipitation effect by anhydrous alcohol

2.2 DNA提取液純度測(cè)定

使用Thermo Nanodrop 2000核酸蛋白儀測(cè)定DNA提取液純度，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析取，同一試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示， OD260/OD230均大于2.0，DNA提取液中有機(jī)大分子、鹽離子等殘留較少；以A260/A280=1.8～1.9為較好純度[2]，改進(jìn)酚/氯仿法偏移8.1%，試劑盒提取方法偏移3.7%，DNA/RNA同提取法偏移20.5%(結(jié)果見表1)。同次試驗(yàn)3次重復(fù)，改進(jìn)酚/氯仿法差異4.7%，試劑盒提取方法差異2.0%，DNA/RNA同提取法差異6.3%，同次試驗(yàn)3次重復(fù)各提取方法組內(nèi)數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)；不同日3次重復(fù)改進(jìn)酚/氯仿法差異10.3%，試劑盒提取方法差異2.3%，DNA/RNA同提取法差異15.6%，不同日3次重復(fù)組內(nèi)數(shù)據(jù)試劑盒提取方法差異不顯著(P>0.05)，改進(jìn)酚/氯仿法差異顯著(P<0.05)，DNA/RNA同提取法差異極顯著(P<0.01)。提取純度：試劑盒提取法>酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法(表1)。

表1 DNA提取液純度測(cè)定

2.3 提取效率比較

利用筆者建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)提取效率；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，同一試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果取平均值。結(jié)果如下：改進(jìn)酚/氯仿法提取效率：95.22%；天根DP304-02試劑盒方法提取效 率：33.88%；Trizol法提取效率：78.75%，3種提取方法提取效率差異極顯著(P<0.01)；同次試驗(yàn)3次重復(fù)，改進(jìn)酚/氯仿法差異3.9%，試劑盒提取方法差異1.3%，DNA/RNA同提取法差異4.6%，同次試驗(yàn)3次重復(fù)各提取方法組內(nèi)數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)；不同日3次重復(fù)改進(jìn)酚/氯仿法差異14.7%，試劑盒提取方法差異1.4%，DNA/RNA同提取法差異14.5%，不同日3次重復(fù)組內(nèi)數(shù)據(jù)試劑盒提取方法差異不顯著(P>0.05)，改進(jìn)酚/氯仿法和DNA/RNA同提取法差異顯著(P<0.05)。提取效率：酚/氯仿法>DNA/RNA同提取法>試劑盒提取法(表2)。

表2 提取效率比較

3 討論

本試驗(yàn)比較不同稀釋度Proteinase K消化情況和無水乙醇沉淀效果，不同稀釋度各試驗(yàn)組結(jié)果差異顯著，相對(duì)于Trizol法提取DNA，酚/氯仿法提取DNA過程各試劑處理效果容易通過Proteinase K消化情況、苯酚變性蛋白情況、無水乙醇沉淀效果觀測(cè)，是比較不同稀釋度對(duì)病料核酸提取影響較好的檢測(cè)方法。通過純度和效率兩個(gè)方面比較提取方法的提取效果，結(jié)果顯示3種核酸提取方法提取效果差異極顯著(P<0.01)，酚/氯仿法提取效率最高，不受材料量的影響，但提取純度有限，主要?dú)埩舻鞍踪|(zhì)，是由Proteinase K消化或苯酚變性蛋白質(zhì)不足造成的，蛋白殘留對(duì)于一些對(duì)核酸純度要求較高的下游試驗(yàn)如SNP分析影響較大。天根生化科技DNA提取試劑盒利用硅膠材料在高鹽離子條件下特異性地吸附核酸，低鹽離子條件下解吸附，因此可以實(shí)現(xiàn)純度較高的核酸提??；然而硅膠吸附材料吸附核酸量有限，提取效率較低，不適合大量樣品的提??；DNA/RNA同提取法利用DNA和RNA等電點(diǎn)的不同分離DNA和RNA，受樣品pH影響較大，提取效率和提取核酸純度均低于酚/氯仿法，優(yōu)點(diǎn)在于DNA/RNA同時(shí)提取，節(jié)省材料，對(duì)珍稀材料尤為適用。3次重復(fù)試驗(yàn)表明，酚/氯仿法和DNA/RNA同提取法重復(fù)性較差，需要試驗(yàn)者根據(jù)材料情況設(shè)定試劑使用量和處理時(shí)間；提取試劑盒法重復(fù)性很好，組間差異差異不顯著(P>0.05)。

目前對(duì)采用的核酸提取方法主要有手工提取法和全自動(dòng)儀器提取法，基層實(shí)驗(yàn)室較多采用的是手工提取法[6]。酚/氯仿法被實(shí)驗(yàn)室廣泛用于DNA的提取，但存在步驟多，對(duì)操作者熟練程度要求高等缺陷[13-14]。目前市售的核酸提取試劑盒，提取的原理主要是利用特異性物質(zhì)吸附核酸，然后去除雜質(zhì)，洗脫獲得純凈核酸[15-16]。使用胍鹽裂解細(xì)胞，利用DNA和RNA等電點(diǎn)的不同，調(diào)節(jié)裂解液pH,加入有機(jī)溶劑氯仿實(shí)現(xiàn)DNA/RNA同提取，以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用[17-18]。筆者對(duì)酚/氯仿法、試劑盒提取法和DNA/RNA同提取法進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，3種核酸提取方法在提取核酸純度和提取效率方面有較大差異。基于本試驗(yàn)結(jié)果，研究者應(yīng)根據(jù)不同試驗(yàn)要求選擇合適的核酸提取方法，才能獲得滿意的試驗(yàn)結(jié)果。

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Comparison of 3 Nucleic Acid Extraction Methods Using Real-time Fluorescent Quantitative PCR

LUO Zhong-yong，WANG Yin，YANG Ze-xiao

(AnimalQuarantineLaboratory,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgricultureUniversity,Wenjiang,Chengdu,611130,China)

To obtain the appropriate nucleic acid sample，the pretreatment method for extracting nucleic acid from the disease-tissue is optimized, the extraction efficiencies of phenol/chloroform method, reagent box extraction method and extraction method with DNA and RNA were compared by simulated samples and Green I SYBR real-time PCR.The results showed that the extraction purity(Reagent box extraction method>Improved phenol/chloroform method>Extraction method with DNA and RNA)and the extraction efficiency(Improved phenol/chloroform method>Extraction method with DNA and RNA >Reagent box extraction method)were different.The experiment showed that the extraction methods had a significant difference, which provided a reference for laboratory nucleic acid extraction.

nucleic acid extraction method; real-time PCR; extraction effect

2015-10-21

“十二五”國(guó)家科技支持計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD12B04)

羅忠永(1992-)，男，河南潢川人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S854.4;Q52

A

1007-5038(2016)11-0053-04