膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測尿液中α1-微球蛋白的含量

蔣澤軍　蔣慶姣　冼慶勇*　劉云鵬　何金洋　韋秋云

膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測尿液中α1-微球蛋白的含量

蔣澤軍①蔣慶姣①冼慶勇①*劉云鵬①何金洋①韋秋云①

目的：對自主研制的尿α1-微球蛋白(α1-MG)檢測試劑盒進(jìn)行綜合性能評價，并與進(jìn)口試劑進(jìn)行臨床對比。方法：采用尿α1-MG檢測試劑盒，對收集的101例腎病患者晨尿進(jìn)行α1-MG的含量檢測。將α1-MG的多克隆抗體包被在膠乳微粒上，添加相應(yīng)的穩(wěn)定劑得到試劑R2，采用適合的緩沖體系、增敏劑及穩(wěn)定劑得到試劑R1。評價由試劑R1和試劑R2組成試劑盒的定標(biāo)曲線、穩(wěn)定性、干擾試驗(yàn)及回收率等檢測性能。結(jié)果：試劑盒的測量范圍在2.0～160 mg/ L，回收率為94.0%～106.0%，對不同濃度的臨床樣本測試20次，其變異系數(shù)(CV)＜5.0%；與日本進(jìn)口試劑相比較，測試臨床標(biāo)本101例，其相關(guān)系數(shù)r2＝0.9854。結(jié)論：該試劑盒具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，線性范圍寬，符合臨床檢測需要，可用于尿液中α1-MG的含量檢測。

免疫；比濁；α1-微球蛋白；尿液；膠乳

[First-author’s address] Reagent R&D Center, Guilin URIT Medical Electronics co., LTD, Guilin 541004, China.

尿液檢驗(yàn)對于泌尿系統(tǒng)感染性和非感染疾病的篩查、輔助診斷、病程和療效監(jiān)測，以及對其他系統(tǒng)疾病(如糖尿病、高血壓、遺傳性疾病及藥物不良反應(yīng)等)的篩查，療效或并發(fā)癥的監(jiān)測都具有重要意義[1-4]。臨床上有些藥物的排泄通過腎小球?yàn)V過和近端腎小管分泌，這些藥物的使用增加了腎功能下降和慢性腎臟疾病的風(fēng)險，從而可能引起尿液中特種蛋白含量的增加[5-6]。

尿液蛋白的檢測多采用化學(xué)比色法，隨著科技的進(jìn)步，蛋白種類得以分類，并具有相應(yīng)的臨床意義[7-9]。特種蛋白的免疫測定得到快速發(fā)展，是利用抗原-抗體的特異反應(yīng)檢測臨床樣本中微量蛋白的分析方法，而此種方法最大的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高，以及使用的簡便和快速[10-11]。

尿液α1-微球蛋白(α1-microglobulin，α1-MG)的相對分子量為27000，是一種相對較小的糖蛋白，等電點(diǎn)(isoelectric point，PI)為4.5～5.5[12]。該蛋白產(chǎn)生恒定，在機(jī)體內(nèi)廣泛分布，易通過腎小球?yàn)V過膜，其中絕大部分被腎小管重新吸收，且不受pH值變化的影響。尿液α1-MG的升高，常提示腎小管與間質(zhì)損害[13-14]。尿液α1-MG測定有利于鑒別上、下尿路感染、腎性與腎后性蛋白尿及血尿[15]。為此，本研究自主研制尿液α1-MG的檢測試劑盒并對其進(jìn)行綜合性能評價，為臨床疾病診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2014年8-9月桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的101例腎病患者，其中男性57例，女性44例；年齡23～74歲；均為腎臟疾病或其他疾病引起的腎功能損害患者，收集患者晨尿進(jìn)行α1-MG含量檢測。

1.2儀器與試劑

(1)采用7180型全自動生化分析儀(日本，HITACHI)；TG21KR型高速離心機(jī)(長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；XC-CD型細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波市先倡電子科技有限公司)。

(2)α1-MG多克隆抗體(丹麥)；聚苯乙烯膠乳、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、表面活性劑及穩(wěn)定劑，日本進(jìn)口α1-MG檢測試劑盒；本研究研制的α1-MG檢測試劑盒。

1.3試劑盒制備方法

將1 ml的α1-MG多克隆抗體、0.5 ml膠乳微球(固含量5%)及2%的碳化二亞胺20 μl加入到2 ml濃度為0.05 mol/L的PBS緩沖液中，放置于25 ℃環(huán)境下攪拌30 min，以15000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min分離后加入分散緩沖液，再加入阻斷劑封閉膠乳，超聲10 min后膠乳均勻懸浮，即為R2試劑；R1為試劑自配：在100 ml的濃度為0.15 mol/L的PBS緩沖體系中加入0.1 g表面活性劑、0.25 g聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)6000及0.08 g穩(wěn)定劑等。

1.4檢測方法

采用全自動生化分析儀測試試劑性能及臨床樣本，參數(shù)設(shè)置：R1試劑200 μl，R2試劑50 μl，樣本、標(biāo)準(zhǔn)樣本及水均為12 μl，檢測主波長為600 nm，副波長為700 nm。

2　結(jié)果

2.1檢測性能

使用自制的R1和R2試劑及外購的α1-MG校準(zhǔn)品，用7180型日立全自動生化分析儀定標(biāo)測試，定標(biāo)曲線如圖1所示。由曲線可見自制試劑盒在對α1-MG的檢測反應(yīng)良好，并呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，r2=0.998。

圖1　α1-MG的定標(biāo)曲線圖

2.2穩(wěn)定性分析

將自制試劑盒的R1和R2密封放置于溫度為40 ℃，濕度為80%的恒溫恒濕箱中，負(fù)荷7 d后測試，對比測試負(fù)荷前后試劑盒的檢測性能。結(jié)果顯示，負(fù)荷后試劑盒的吸光度值略有降低，但α1-MG校準(zhǔn)品的濃度在2.0～160 mg/L的范圍時，降低的吸光度值＜10%，且仍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r2=0.998)，如圖2所示。

圖2　α1-MG檢測試劑盒負(fù)荷前后的定標(biāo)曲線對比圖

2.3精密度分析

分別選取3個不同水平(低值、中值、高值)的尿液樣本，連續(xù)測試20次，計(jì)算測量值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其測試變異系數(shù)(coefficient variation，CV)值均在5%以內(nèi)，見表1。

表1　精密度分析測試結(jié)果

2.4干擾測試

分別選用2個不同水平(高值、低值)的混合尿液樣本，加入不同濃度的干擾物，以等體積的生理鹽水作為無干擾樣本，同時測定這些標(biāo)本的濃度，結(jié)果以干擾程度10%作為該系統(tǒng)對干擾物的最高限。結(jié)果顯示，在血紅蛋白≤10 g/L、膽紅素≤0.6 g/L、維生素C≤0.6 g/L以及肌酐≤10 g/L時，對于測定尿液中α1-MG無影響。

2.5加標(biāo)回收率

將已知α1-MG濃度的混合尿液樣本分成3等份，分別添加一定量的α1-MG校準(zhǔn)品，進(jìn)行測試3次，平均回收率為94.0%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，符合實(shí)驗(yàn)要求，見表2。

表2　加標(biāo)回收率測試結(jié)果

2.6臨床對比測試

對101例臨床尿液樣本分別使用自制α1-MG試劑與日本進(jìn)口試劑進(jìn)行臨床對比測試，其結(jié)果顯示呈現(xiàn)較好的相關(guān)性(r2=0.9854)，如圖3所示。

圖3　自制α1-MG試劑與日本進(jìn)口試劑臨床測試對比圖

3　討論

尿液特種蛋白的檢測被認(rèn)為是反映早期腎損傷的靈敏指標(biāo)，人體內(nèi)α1-MG的產(chǎn)生恒定，尿液中α1-MG的排出量較少受腎外因素的影響，尿液α1-MG檢測可為腎小管損傷診斷提供參考依據(jù)，被認(rèn)為是較特異的腎功能損傷診斷試驗(yàn)[16-18]。因此，α1-MG檢測試劑盒的綜合性能在臨床測試中尤為重要，本研究中尿液α1-MG檢測試劑盒在2～160 mg/ L范圍內(nèi)，α1-MG的濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，r2=0.998。此外，試劑盒密封放置于溫度為40℃，濕度為80%的恒溫恒濕箱中負(fù)荷7 d，試劑盒與尿液中α1-MG的反應(yīng)仍具有較高的吸光度，且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r2=0.9982。由此可見，本研究中的α1-MG試劑盒具備較好的穩(wěn)定性。

本研究對該方法的檢測試劑盒進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，在已知α1-MG濃度(18.5 mg/L)的尿液樣本中添加不定量的α1-MG校準(zhǔn)物，分別添加10 mg/L、20 mg/L及35 mg/L，重復(fù)3次測試，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其回收率為94.0%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%。同時，對尿液中較常見的干擾物質(zhì)進(jìn)行干擾試驗(yàn)，包括10 g/L血紅蛋白、0.6 g/L膽紅素、0.6 g/ L維生素C以及10 g/L肌酐，均對本測試方法無影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究中的α1-MG檢測試劑盒在尿液中的檢測應(yīng)用具有較好的可行性。

使用自制的α1-MG檢測試劑盒和日本進(jìn)口的α1-MG檢測試劑盒分別對101例臨床樣本進(jìn)行平行檢測，其結(jié)果顯示，臨床樣本的α1-MG含量均在試劑盒的檢測范圍內(nèi)，兩種方法的測試結(jié)果對比，呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，r2=0.9854。在本研究α1-MG試劑盒精密度實(shí)驗(yàn)中，分別對3個不同水平的尿液樣本進(jìn)行重復(fù)測試20次，其標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在0.21～1.76范圍內(nèi)，其CV值＜5%，表明本研究的試劑盒能夠滿足臨床測試的需要。

綜上所述，本研究利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法研制了檢測尿液中α1-MG的試劑盒，并對試劑盒的檢測性能、精密度、穩(wěn)定性、干擾試驗(yàn)、回收率以及臨床對比等進(jìn)行分析測試。結(jié)果表明，本研究研制的尿液α1-MG檢測試劑盒，測試性能良好，能夠滿足臨床檢測的需要，可為腎臟疾病患者的臨床診斷和治療提供更多可靠的參考依據(jù)。

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Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay method for the determination of α1-microglobulin in urine

JIANG Ze-jun, JIANG Qing-jiao, XIAN Qing-yong, et al// China Medical Equipment,2016,13(11):47-50.

Objective: The comprehensive performance of self-developed urine alpha 1 -microglobulin (α1-MG) testing kit was evaluated and compared with imported reagents kit for clinical samples. Methods: The method is detecting the content of trace α1-MG in urine by the test kit, which included reagents R2 and R1. The reagents R2 of the test kit contained stabilizer and latex particles, which is packaged on the polyclonal antibody of α1-MG. The main component of the reagents R1 of the test kit was suitable buffer system, sensitization agent and stabilizer. Evaluation of the detection performance of the test kit was completed, including calibration curve, stability, interference test, and recovery rate, detecting the content of urinary α1-MG in 101 patients with kidney disease. Results: The measurement range of the test kit is 2.0～160 mg/L, and the recovery is 94.0%～106.0%. Testing the different concentrations of clinical samples(n=20), the coefficient of variation is less than 5.0%. Compared with the imported reagent from Japan, the correlation coefficient of 101 clinical samples is 0.9854. Conclusion: The test kit with fine repeatability, veracity and wide measurement range can be used for clinical detection of α1-MG in urine.

Immunoassay; Turbidimetric; α1–microglobulin; Urine; Latex

蔣澤軍,男,(1986- ),碩士，工程師。桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司試劑研發(fā)中心，從事尿液特種蛋白含量分析及尿質(zhì)控品研究。

1672-8270(2016)11-0047-04

R446.6

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.014

①桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司試劑研發(fā)中心 廣西 桂林 541004

xianqingyong@uritest.com.cn

2016-05-10