全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)的方法學(xué)性能驗(yàn)證

黃永攀　韋榮國(guó)　覃 政　李 靈　宋波權(quán)

全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)的方法學(xué)性能驗(yàn)證

黃永攀①韋榮國(guó)①覃 政②李 靈③宋波權(quán)①

目的：對(duì)新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)的方法學(xué)性能進(jìn)行驗(yàn)證。方法：按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦方法測(cè)定的生物參考區(qū)間指標(biāo)，采用MAGLUMI4000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNP)、Ⅳ型膠原(C Ⅳ)的批內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍及靈敏度等進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：MAGLUMI分析儀測(cè)定HA、LN、PⅢNP、C Ⅳ批內(nèi)和日間精密度變異系數(shù)(CV)分別為3.01%～4.82%和3.77%～4.69%；相對(duì)偏倚(%)為-5.3%～0.2%；測(cè)定線性范圍與廠商要求相近；HA、LN、PⅢN-P和C Ⅳ的測(cè)定數(shù)值與廠商提供的參考區(qū)間符合，檢測(cè)的靈敏度分別為1.30 ng/ml、0.9 ng/ml、0.49 ng/ml和0.54 ng/ml。結(jié)論：MAGLUMI化學(xué)發(fā)光免疫分析儀可直接用于對(duì)人血清中肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PⅢNP及C Ⅳ的含量進(jìn)行定量分析，批內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、靈敏度以及參考區(qū)間均較好，報(bào)告結(jié)果準(zhǔn)確可靠。MAGLUMI分析儀是一種較理想的適用于判斷肝纖維化程度的檢測(cè)儀，值得推廣應(yīng)用。

化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；肝纖維化指標(biāo)；性能評(píng)價(jià)

[First-author’s address] Department of Clinical Laboratory, Langdong Hospital of the First People’s Hospital of Nanning, Nanning 530000, China.

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化[1-3]。肝纖維化常見檢查方法有組織病理學(xué)檢查、影像學(xué)診斷和血清學(xué)診斷。組織病理學(xué)檢查是判斷慢性肝病是否已導(dǎo)致肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而肝活檢是一種創(chuàng)傷性檢查，存在較大疼痛和并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，不方便反復(fù)取樣檢查，且存在取樣誤差[4-6]。影像學(xué)評(píng)估以超聲較普遍，但目前影像學(xué)技術(shù)不能評(píng)估肝纖維化的早期階段，具有一定局限性。血清學(xué)診斷具有取樣方便，可隨時(shí)多次采血、價(jià)格低以及無(wú)創(chuàng)傷等優(yōu)勢(shì)，利于早期發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝纖維化，是目前應(yīng)用最廣泛的肝纖維化檢查方法[7]。

肝纖維化標(biāo)志物包括透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原(C Ⅳ)、Ⅲ型前膠原氨基端肽(N-terminal peptide of procollagen Ⅲ，PⅢNP)及血清甘膽酸(cholyglycine，CG)等[8]。通過對(duì)肝纖維化標(biāo)志物進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，能對(duì)慢性肝病纖維化病變發(fā)展程度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。為了保證檢驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果的質(zhì)量，本研究對(duì)HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)MAGLUMI化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、靈敏度以及參考區(qū)間等性能進(jìn)行驗(yàn)證。

1　資料與方法

1.1標(biāo)本來源

收集符合肝纖維化指標(biāo)標(biāo)本要求的門診或住院患者送檢的標(biāo)本，并按肝纖維化檢測(cè)指標(biāo)的要求及時(shí)分析或處理標(biāo)本。

1.2儀器和試劑

MAGLUMI 4000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)，檢測(cè)試劑，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品均由深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供，并嚴(yán)格按照儀器及試劑說明書的操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3檢測(cè)方法

按照儀器的作業(yè)指導(dǎo)書對(duì)儀器進(jìn)行系統(tǒng)維護(hù)保養(yǎng)，待常規(guī)室內(nèi)質(zhì)量控制完成后按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦方法測(cè)定HA、LN、PⅢNP和CⅣ的批內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、靈敏度以及生物參考區(qū)間等指標(biāo)，并進(jìn)行驗(yàn)證，且于檢測(cè)過程中不定時(shí)地插入室內(nèi)質(zhì)控物進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，確保整個(gè)分析過程中儀器處于質(zhì)量控制的良好狀態(tài)。

1.3.1精密度驗(yàn)證

批內(nèi)精密度：參照NCCI SEP5-A[11]文件，隨機(jī)抽取一盒試劑，按試劑盒說明書規(guī)定檢測(cè)，用各自的質(zhì)控品連續(xù)重復(fù)測(cè)試20次，分別計(jì)算其均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)和變異系數(shù)(coefficient variation，CV)值(%)。日間精密度：每日測(cè)定1次質(zhì)控品，連續(xù)測(cè)定20 d，分別計(jì)算x-±s和CV值。

1.3.2準(zhǔn)確度驗(yàn)證

用校準(zhǔn)品校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)后，對(duì)定值質(zhì)控品進(jìn)行HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與定值質(zhì)控品的靶值進(jìn)行對(duì)照，計(jì)算檢測(cè)值與靶值的相對(duì)偏倚(%)，即為公式1：

1.3.3線性范圍驗(yàn)證

按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)NCCISEP6-A2[12]文件評(píng)價(jià)方案，選取高值血清樣本(H)和低值血清樣本(L)各1份，濃度分別接近儀器給定的測(cè)量線性范圍的兩側(cè)，將樣本H和樣本L按5 H、4 H+L、3 H+2 L、2 H+3 L、H+4 L及5 L的比例混合成6個(gè)樣品，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均值(x-)。將實(shí)測(cè)值與理論值相比較驗(yàn)證線性范圍。

1.3.4靈敏度驗(yàn)證

分別取10份HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ空白液連續(xù)測(cè)定3次，取其平均值(x-)作為相應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的靈敏度。

1.3.5參考區(qū)間驗(yàn)證

按照NCCIS C28-A2文件[13]要求進(jìn)行驗(yàn)證。選擇健康人群標(biāo)本20份，在MAGLUMI 4000分析儀上進(jìn)行測(cè)定，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并與儀器說明書提供的參考范圍比較。測(cè)定HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ項(xiàng)目，要求20個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)中只允許有1個(gè)數(shù)據(jù)在給定的生物參考區(qū)間之外，否則需要進(jìn)行檢測(cè)項(xiàng)目參考范圍的建立。

表1　MAGLUMI 4000分析儀測(cè)定肝纖4項(xiàng)精密度(%)

2　結(jié)果

2.1精密度

MAGLUMI 4000分析儀檢測(cè)HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ批內(nèi)精密度分別為3.01%、3.90%、3.70%和1.81%，日間的精密度分別為3.86%、4.69%、4.01%和3.77%，均符合要求，見表1。

2.2準(zhǔn)確度

MAGLUMI 4000分析儀檢測(cè)HA、LN、PⅢPN-P和C Ⅳ的校正品結(jié)果與靶值的相對(duì)偏倚分別為0.09%、-4.4%、0.2%和-5.3%，均在MAGLUMI 4000分析儀允許范圍內(nèi)。

2.3線性范圍

MAGLUMI 4000分析儀檢測(cè)HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的線性范圍分別為4.46～1986.99 ng/ml，2.00～999.25 ng/ml，0.50～1983.34 ng/ml和2.00～1990.21 ng/ml，均符合要求。與廠商提供的線性范圍相近，表明廠商提供的線性范圍可靠，可直接用于臨床。

2.4靈敏度

MAGLUMI 4000分析儀檢測(cè)HA、LN、PⅢPN-P和C Ⅳ靈敏度分別為1.30 ng/ml、0.9 ng/ml、0.49 ng/ml和0.54 ng/ml，與廠商提供的靈敏度相一致。

2.5參考區(qū)間

MAGLUMI 4000分析儀檢測(cè)HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的結(jié)果均與儀器廠商提供的參考區(qū)間符合，儀器廠商提供的參考區(qū)間適合本地區(qū)人群。

3　討論

肝纖維化標(biāo)志物HA主要由間質(zhì)細(xì)胞合成，經(jīng)淋巴循環(huán)入血，由肝臟內(nèi)皮細(xì)胞攝取，由特異的HA酶水解，可較準(zhǔn)確靈敏地反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞受損狀況，是肝纖維化和肝硬變的敏感指標(biāo)。LN廣泛分布于基底膜的透明層，緊貼細(xì)胞基底部，與C Ⅳ結(jié)合形成基底膜股價(jià)，影響細(xì)胞的粘附、運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，并與肝纖維化發(fā)生、腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)是PⅢNP的前體，PC Ⅲ分泌到細(xì)胞外后，經(jīng)內(nèi)切酶酶切后裂解下來的氨基端多肽形成PⅢNP，PⅢNP在肝纖維化早期即可能升高，血清含量與肝纖維化程度一致。C Ⅳ為構(gòu)成基底膜主要成分，在細(xì)胞內(nèi)合成，直接以前膠原形式參與細(xì)胞外間質(zhì)的構(gòu)成。正常肝臟C Ⅳ含量極微，肝臟發(fā)生纖維化后，早期即見其增生，且轉(zhuǎn)換率快，最后與持續(xù)沉積的層粘連蛋白形成完整的基底膜。血清C Ⅳ水平升高可較靈敏反映出肝纖維化過程，在肝纖維化時(shí)出現(xiàn)最早，是肝纖維化的早期標(biāo)志之一[7-10]。

肝臟遭到各種致病原侵襲時(shí)，引起肝臟損害與炎癥反應(yīng)，肝組織免疫系統(tǒng)同時(shí)被激活，進(jìn)行組織修復(fù)。肝纖維化是指這種組織修復(fù)過程過度及失控時(shí)，肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度增生與異常沉積所致肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能異常改變的一種病理過程[14-15]。HA是基質(zhì)成分，可較準(zhǔn)確靈敏的反映肝內(nèi)已生成的纖維量及肝細(xì)胞受損情況。有資料認(rèn)為，血清HA動(dòng)態(tài)檢測(cè)較之肝活檢更能完整反映出肝全貌，是肝纖維化和肝硬變的敏感指標(biāo)，尤其在肝纖維化時(shí)，血清HA升高幅度與病變程度相關(guān)。LN為基底膜中特有的非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，與肝纖維化活動(dòng)程度及門靜脈壓力呈正相關(guān)，此外，LN水平越高肝硬化患者的食管靜脈曲張?jiān)矫黠@。正常肝臟間質(zhì)含少量LN，在肝纖維化和肝硬化時(shí)，肌成纖維細(xì)胞增多，大量合成和分泌膠原、LN等間質(zhì)成分，形成完整的基底膜。PⅢNP反映肝內(nèi)Ⅲ型膠原合成，血清含量與肝纖維化程度一致。持續(xù)PⅢNP升高的慢性活動(dòng)性肝炎，提示病情可能會(huì)惡化并向肝硬化形成發(fā)展，而PⅢNP降至正常可預(yù)示病情緩解。C Ⅳ為構(gòu)成基底膜主要成份，反映基底膜膠原更新率，含量增高可較靈敏反映出肝纖維化過程[16-18]。

目前，測(cè)定肝纖維化四項(xiàng)血清含量的方法主要有化學(xué)發(fā)光法和放射免疫分析法。有研究表明，化學(xué)發(fā)光法是檢測(cè)血清肝纖維化四項(xiàng)較為特異和準(zhǔn)確的方法，其效果明顯優(yōu)于放射免疫分析法[9]。新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI化學(xué)發(fā)光分析儀，運(yùn)用先進(jìn)的直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、線性范圍廣、孵育時(shí)間短、靈敏度高及檢測(cè)項(xiàng)目多(如肝纖維化、腫瘤標(biāo)志物、甲狀腺、性激素、糖代謝、心肌損傷標(biāo)志物、貧血、骨代謝及傳染病等121個(gè)項(xiàng)目)的特點(diǎn)。但不同實(shí)驗(yàn)室之間因條件的差異，如工作人員操作習(xí)慣、水質(zhì)、溫度、濕度及電壓穩(wěn)定性等諸多因素存在差異性，因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有必要按各自的系統(tǒng)建立和驗(yàn)證方法學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)MAGLUMI化學(xué)發(fā)光分析儀各項(xiàng)性能是否符合要求，檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠[19]。

精密度是定量測(cè)定中最基本的性能指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，MAGLUMI 4000化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ批內(nèi)精密度分別為3.01%、3.9%、3.70%和1.81%，均小于廠商說明書給定的允許范圍(＜5%)，表明該儀器在本室的檢測(cè)環(huán)境中系統(tǒng)重復(fù)性符合要求，精密度良好，能滿足臨床檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

準(zhǔn)確度是通過定值質(zhì)控品或校準(zhǔn)品的測(cè)定并計(jì)算其偏倚(%)，若測(cè)定結(jié)果在廠商規(guī)定的限值之內(nèi)，準(zhǔn)確度可被確認(rèn)。按照NCCLS EP15-A[20]文件和ISO15189文件中對(duì)準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)要求，可通過比對(duì)定值質(zhì)控品或校正品來對(duì)系統(tǒng)的準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，MAGLUMI 4000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的校正品結(jié)果與靶值的相對(duì)偏倚分別為0.09%、-4.4%、0.2%和-5.3%，均在允許范圍之內(nèi)，表明其檢測(cè)HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ準(zhǔn)確度性能符合廠商及實(shí)驗(yàn)室要求。

4　結(jié)語(yǔ)

在確保使用原裝配套試劑的前提下，本研究驗(yàn)證的HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ線性范圍與廠商提供的線性范圍相近，均在廠商提供線性范圍之內(nèi)。按照NCCLSC28-A2[13]文件要求，本研究對(duì)HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ的正常參考范圍進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，MAGLUMI 4000化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定本區(qū)健康人群血清中HA、LN、PⅢ PN-P和C Ⅳ的含量均與廠商推薦的參考區(qū)間相符合，可直接引用廠商的參考范圍。新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PⅢNP和C Ⅳ的方法性能良好，可滿足要求，能夠?yàn)榕R床診斷提供準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

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Research on performance verification methodology for testing hepatic fibrosis indicators by Snibe MAGLUMI chemiluminescence immunoassay analyzer

HUANG Yong-pan, WEI Rong-guo, QIN Zheng, et al// China Medical Equipment,2016,13(11):43-46.

Objective: To detect hepatic fibrosis parameter methodology performance for validation of Snibe MAGLUMI automatic chemiluminescence immunoassay analyzer. Methods: Recommended by the American association of clinical laboratory standardization (CLSI) method, we detected the determination of hyaluronic acid (HA), Laminin (LN), Ⅲ procollagen N-terminal peptide (PⅢ PN-P), Ⅳcollagen (C Ⅳ), and the precision, accuracy, linear range, sensitivity and biological reference range by MAGLUMI analyzer. Results: MAGLUMI determination of HA, LN, PⅢ PN-P, C Ⅳ and precision, and the daytime in this batch variation coefficient were 3.01～4.82% and 3.77～4.69%. Relative bias must lean between -5.3% and 0.2%. The scope of determination of linear range and the manufacturer were similar. The value of HA, LN, PⅢ PN-P, C Ⅳ and reference interval coincidence rate provided by manufacturers were all 100%. And the sensitivities were 1.30ng/ml, 0.9ng/ml, 0.49ng/ml and 0.54ng/ml. Conclusion: MAGLUMI can be used in quantitative analysis of the content of HA, LN, PⅢ PN-P and C Ⅳ directly, which are indicators of liver fibrosis in human serum. Precision, accuracy, linear range, sensitivity and biological reference range show good performance in this methodology. The results of report are accurate and reliable. MAGLUMI is an ideal way to determine the degree of liver fibrosis.

Chemiluminescence immunoassay analyzer; Hepatic fibrosis indicators; Performance evaluation

黃永攀,男,(1976- ),大專，主管技師。南寧市第一人民醫(yī)院埌東醫(yī)院檢驗(yàn)科，從事臨床檢驗(yàn)工作。

1672-8270(2016)11-0043-04

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.013

①南寧市第一人民醫(yī)院埌東醫(yī)院檢驗(yàn)科 廣西 南寧 530000

②南寧市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 廣西 南寧 530000

③南寧市第一人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 廣西 南寧 530000

2016-05-10