長期耐力運動對大鼠右心室MMP-2和TIMP-2的影響

王世強常蕓饒志堅馬曉雯

1國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）2湖南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院（株洲 412008）

長期耐力運動對大鼠右心室MMP-2和TIMP-2的影響

王世強1，2常蕓1饒志堅1馬曉雯1

1國家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）2湖南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院（株洲 412008）

目的：通過建立長期大強度運動模型，研究長期不同強度耐力運動對大鼠右心室心功能和羥脯氨酸的含量影響以及基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和金屬蛋白酶抑制劑2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）的調(diào)節(jié)作用，為運動性心肌纖維化和心律失常的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。方法：24只健康成年雄性SD大鼠隨機分為安靜對照組、中強度運動組和大強度運動組，每組8只。中強度組和大強度組進行16周的運動，每周訓(xùn)練5天，休息2天，每次1 h。16周后采用小動物超聲心動儀檢測大鼠右心室心功能。隨后，立刻麻醉處死大鼠，摘取心臟，分離出右心室。采用樣本堿水解法檢測羥脯氨酸的含量；熒光定量PCR檢測MMP-2和TIMP-2 mRNA的相對表達。Western Blot檢測MMP-2和TIMP-2蛋白的表達。結(jié)果：（1）與安靜組相比，中強度組右室射血分數(shù)（RVEF）和右室縮短分數(shù)（RVFS）增加，但無顯著性差異。大強度組RVEF顯著低于安靜組和中強度組（P＜0.05），大強度組RVFS均低于安靜組和中強度組，但無顯著性差異。（2）中強度組羥脯氨酸的含量高于安靜對照組，但無顯著性差異；而大強度組羥脯氨酸的含量顯著高于安靜組和中強度組（P＜0.01）。（3）與安靜組相比，中強度組MMP-2 mRNA和蛋白的表達具有增加趨勢，但無顯著性差異。大強度組MMP-2 mRNA的表達顯著高于安靜組（P＜0.05），大強度組MMP-2蛋白的表達顯著高于安靜組和中強度組（P＜0.01）；與安靜組比較，中強度組和大強度組TIMP-2 mRNA的表達均無顯著性差異；通過計算發(fā)現(xiàn)，三組間MMP-2/TIMP-2 mRNA的比值無明顯差異，大強度組MMP-2/TIMP-2蛋白的比值顯著高于安靜組和中強度組（P＜0.01）。結(jié)論：長期大強度運動造成大鼠右心室羥脯氨酸含量顯著增加，心肌MMP-2的表達增加，MMP-2/TIMP-2比例失調(diào)可能是右心室心功能異常和運動性心肌纖維化的發(fā)生機制之一。

運動；大鼠；右心室；羥脯氨酸；基質(zhì)金屬蛋白酶2

運動性心律失常一直是運動醫(yī)學(xué)和體育科學(xué)備受關(guān)注的問題。常蕓等針對我國優(yōu)秀運動員潛在的心臟隱患的調(diào)研也證實了長期從事大強度運動的優(yōu)秀運動員存在較高的心律失常風險。部分運動性心律失常的發(fā)生與長期反復(fù)大強度運動對心臟的病理性損傷有關(guān)[1，2]。近期，人體和動物研究均證實，長期大強度運動導(dǎo)致心肌纖維化，可能是運動性心律失常的主要病理改變[3-6]。Chang最新研究結(jié)果也證實，4周反復(fù)力竭運動會導(dǎo)致大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)纖維化的發(fā)生[7]。

心肌纖維化是指心肌中的膠原纖維異常增加的現(xiàn)象。過度增加的膠原纖維影響心肌細胞間的電信號傳導(dǎo)，促進心律失常的發(fā)生與維持[8]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，16周的大強度運動導(dǎo)致大鼠右心室膠原纖維過度增加、發(fā)生纖維化，而左心室未發(fā)現(xiàn)纖維化存在[9]。La等發(fā)現(xiàn)，高強度耐力導(dǎo)致運動員右心室射血功能降低，而左心室功能正常[10]。最近的人體實驗研究表明，受過長期訓(xùn)練的耐力運動員運動后促炎因子顯著增加，右心室心功能降低[11]。

MMP-2能夠降解心肌間質(zhì)中膠原蛋白，是心肌間質(zhì)重塑的重要調(diào)節(jié)因子。TIMP-2是MMP-2的特異性抑制劑，能與MMP-2特異性結(jié)合，抑制MMP-2的活性。MMP-2/TIMP-2的比例失調(diào)是造成心肌膠原蛋白重塑、心肌纖維化和心肌功能下降的重要原因[12]。以往研究證實，在容量負荷過載[13]、心肌梗死[14]和高血壓[15]等因素誘導(dǎo)的心肌肥厚發(fā)病過程中，均發(fā)現(xiàn)MMP-2/ TIMP-2的比例失調(diào)。而長期不同強度耐力運動對心室MMP-2/TIMP-2的影響如何，是否參與了長期大強度運動，尚不清楚。因此，本研究擬通過觀察不同強度運動對大鼠右心室MMP-2和TIMP-2的影響，探討運動性心肌纖維化的發(fā)生機制，為篩選安全有效的預(yù)防和治療運動性心律失常的有效治療靶點和干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

8周齡SPF級健康雄性SD大鼠24只，體重為（220±8 g），購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXX（京）2012-0001。所有大鼠均以嚙齒類動物普通飼料喂養(yǎng)，在國家體育總局體育科學(xué)研究所ABSL-3級動物房飼養(yǎng)，室溫為22±2℃，空氣濕度為45%～55%，每天光照12小時。

1.2 分組和運動方案

適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，所有大鼠進行一周適應(yīng)性跑臺訓(xùn)，每天訓(xùn)練15 min，跑臺速度為15 m/min，跑臺坡度為0°。隨機分為安靜對照組、中等強度訓(xùn)練組和大強度訓(xùn)練組，每組8只。運動方案參照Bedford研究[16]，中強度組跑臺速度為15.2 m/min，坡度為5°（最大攝氧量約58.4±1.7 VO2max），大強度組跑臺速度為28 m/min，坡度為10°（最大攝氧量81.00%±3.5 VO2max）。大強度組先以15 m/min速度跑5 min，隨后在5 min內(nèi)逐漸增至28 m/min，維持直至16周訓(xùn)練結(jié)束。

1.3 大鼠右心室心功能指標檢測

取材前，采用10%水合氯醛將大鼠麻醉后，胸部去毛，用小動物心功能分析（加拿大ULTRASONIX）探頭置于大鼠胸前。測量大鼠右心室舒張末期容積和收縮末期容積，并計算右室射血分數(shù)（RVEF）；測量右心室舒張末期短軸距離和收縮末期短軸距離，并計算右室縮短分數(shù)（RVFS）。

1.4 取材

大鼠運動16周后進行取材。迅速取出心臟，切取

右心室，每塊組織分為2份，一份用于羥脯氨酸含量的測定，一份用于基因和蛋白的測定。

1.5 羥脯氨酸含量的檢測（樣本堿水解法）

羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫色，根據(jù)其呈色的深淺可推算其含量。稱量組織放入試管中，加入水解液，混勻，加蓋后95℃或者沸水浴水解20 min。調(diào)PH值至6.0～6.8左右，加入雙蒸水，混勻，加入適量活性炭，混勻。按表1添加完3種試劑后，60℃水浴15 min，冷卻后3500轉(zhuǎn)/分離心10 min，取上清在波長550 nm處測定各管吸光度值。試劑盒購于南京建成生物工程研究所（貨號A030-2）。操作表如下：

1.6 RT-PCR檢測MMP-2和TIMP-2 mRNA的含量

采用Trizol法（購于美國Life Technologies）提取總RNA，每個樣本按照0.5 μg RNA作為初始模板，配置10 μl的總反應(yīng)體系，應(yīng)用cDNA合成試劑盒（RR370A，購于TaKaRa公司）在核酸擴增儀（Gene Amp PCR System 9700，美國ABI公司）進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為37℃，15 min；85℃5 s；4℃保持。以合成的cDNA作為模板，以β-actin作為內(nèi)參，配置20 μl反應(yīng)體系，每個樣本檢測3個復(fù)孔，在實時熒光定量PCR系統(tǒng)（7300，美國ABI）進行擴增熒光定量，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30 s，PCR反應(yīng)95℃5 s，60℃31 s，40個循環(huán)。熒光定量試劑盒為TaKaRa公司的RR820A。根據(jù)收集的數(shù)據(jù)通過2-△△CT公式計算樣本中mRNA的相對含量，其中△△CT=（CT實驗組目的基因-CT實驗組內(nèi)參基因）-（CT對照組目的基因-CT對照組內(nèi)參基因）。實驗所需引物由上海生工生物合成。

1.7 Western Blot法檢測MMP-2和TIMP-2蛋白的含量

提取總蛋白后用BCA法測定并調(diào)整蛋白濃度一致，加入上樣緩沖液沸水中10 min使蛋白變性。120 V恒壓SDS-PAGE電泳1 h后，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉（購于美國BD公司）封閉1 h，一抗（Anti-MMP-2和Anti-TIMP-2，內(nèi)參為β-actin，均購于美國Abcam公司）置于搖床4℃過夜。TBST洗滌3次后，加HRP標記的二抗（1∶5000，購于美國Abcam公司），室溫搖床孵育1 h。TBST洗膜3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑（購于美國Millipore），室溫2 min，濾紙吸干后置于保鮮膜內(nèi)封存，置于暗匣內(nèi)，X光片曝光約2 min，顯影液中顯影1 min，定影數(shù)十秒，條帶用Quntity One軟件進行圖像分析。計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的積分光密度（IOD）的相對值。

表2 Real-time PCR基因引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用GraghPad Prism 6.0軟件轉(zhuǎn)換作圖。所有數(shù)據(jù)均用SPSS18.0進行分析處理，結(jié)果采用平均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析組間差異。

2 結(jié)果

2.1 心功能測定結(jié)果

結(jié)果（圖1）顯示，與安靜組比，中強度組RVEF增加，但無顯著性差異。高強度組RVEF顯著低于安靜組和中強度組（P＜0.05）；與安靜組相比，中強度組RVFS增高，但無顯著性差異。大強度組RVFS均低于安靜組和中強度組，但無顯著性差異。結(jié)果表明，長期中強度運動能增加右心室心肌功能，而長期大強度運動反而有損右心室心肌功能。

表1 Hyp含量測定操作表

圖1 右心功能指標變化（n=5）

2.2 羥脯氨酸的含量變化

結(jié)果（圖2）顯示，中強度組羥脯氨酸的含量高于安靜對照組，但無顯著性差異；而大強度組羥脯氨酸的含量顯著高于安靜組和中強度組（P＜0.01）。

圖2 心肌羥脯氨酸的含量變化

2.3 MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA及其比值的變化

結(jié)果（圖3）顯示，與安靜組相比，中強度組MMP-2 mRNA的表達具有增加趨勢，但無顯著性差異，大強度組MMP-2 mRNA的表達顯著增加（P＜0.05）；與安靜組比較，中強度組和大強度組TIMP-2 mRNA的表達均無顯著性差異；通過計算發(fā)現(xiàn)，三組間MMP-2/TIMP-2的比值無明顯差異。

圖3 MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA及MMP-2/TIMP-2比值的變化（n=8）

2.4 MMP-2、TIMP-2蛋白及其比值的變化

圖4顯示，與安靜組相比，中強度組MMP-2蛋白的表達略有增加，但無顯著性差異。大強度組MMP-2蛋白的表達顯著高于安靜組和中等強度組（P＜0.01）；與安靜組相比，中強度組TIMP-2蛋白表達降低，而高強度組升高，但均無顯著性差異；通過計算MMP-2/ TIMP-2的比值，發(fā)現(xiàn)與安靜組相比，中強度組MMP-2/ TIMP-2略有增加，但無明顯差異。大強度組MMP-2/ TIMP-2顯著高于安靜組和中強度組（P＜0.01）。

圖4 MMP-2、TIMP-2蛋白及MMP-2/TIMP-2比值的變化（n=8）

3 討論

3.1 長期大強度運動導(dǎo)致心肌纖維化和心功能降低

研究表明，長期適宜強度的運動能改善心臟功能，降低心血管疾病的發(fā)病率，延緩心臟衰老。然而，長期的大強度運動或過度運動則會導(dǎo)致心肌損傷乃至發(fā)生

纖維化，誘發(fā)心律失常，嚴重的心律失常甚至可能造成運動猝死。以往多數(shù)研究認為長期大強度運動造成的心肌炎癥反應(yīng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生變化和電解質(zhì)紊亂是造成運動性心律失常的重要發(fā)生機制[17-19]。

近期，人體研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期大強度運動誘發(fā)心肌纖維化，可能是心律失常易感性增加的重要原因[20]。Breuckmann采用延遲釓增強-心臟核磁共振（late gadoliniumenhancement-cardiacmagneticresonance，LGE-CMR）技術(shù)檢查了102名馬拉松運動員是否存在心肌纖維化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在被調(diào)查的102名健康的業(yè)余男性馬拉松運動員中，12%的運動員存在心肌纖維化，而僅有4%的正常對照人群存在心肌纖維化[4]。同樣使用LGE-CMR技術(shù)，Wilson等檢測查了12名馬拉松運動員（50-67歲）的心臟。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中6名運動員（50%）存在心肌纖維化，而同年齡的對照人群和年輕運動員無心肌纖維化。同時，研究還發(fā)現(xiàn)耐力運動員心肌纖維化的發(fā)生率與年齡、身高、體重和體表面積等因素無關(guān)，而與運動年限和參加馬拉松運動的次數(shù)緊密相關(guān)[6]。同樣，La等研究了40名耐力運動員，發(fā)現(xiàn)5名運動員（13%）存在心肌纖維化，且發(fā)生部位都在右心室，同時發(fā)現(xiàn)右心室射血分數(shù)降低[10]。

動物研究也證實，長期大強度運動導(dǎo)致心肌纖維化。Benito等首次發(fā)現(xiàn)16周大強度運動誘導(dǎo)大鼠右心室而非左心室發(fā)生纖維化[3]。Guasch的研究也揭示，16周每天進行1小時大強度跑臺訓(xùn)練大鼠心房纖顫的易感性較安靜組顯著增加（64%vs 15%）。同時，天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)心房纖維化程度增加了60%，顯著高于對照組[21]。最近，Aschar-Sobbi的研究發(fā)現(xiàn)，6周力竭游泳運動誘導(dǎo)了心房纖維化的發(fā)生[20]。本研究通過測量心肌中的羥脯氨酸的含量反映膠原蛋白的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大強度組羥脯氨酸的含量顯著高于安靜組合中強度組。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，16周長期大強度運動造成大鼠右心室膠原分數(shù)（CVF）顯著高于安靜組和中強度組，表明具有心肌纖維化的發(fā)生[9]。過度增加的膠原纖維不僅會影響心肌細胞間的電信號傳導(dǎo)，引起心律失常。另外，增生的膠原纖維還導(dǎo)致心肌的舒縮功能降低，心功能發(fā)生異常。本研究采用小動物超聲心動儀檢測了大鼠右心室舒張末期容積和收縮末期容積，并計算右室射血分數(shù)（RVEF）。測量右心室舒張末期短軸距離和收縮末期短軸距離，并計算右室縮短分數(shù)（RVFS）。結(jié)果顯示，與安靜組相比，中強度組RVEF增加，但無顯著性差異。大強度組RVEF顯著低于安靜組和中強度組。研究表明，長期大強度導(dǎo)致大鼠右心室射血功能降低。與本研究一致，最近的人體實驗研究也證實，受過長期訓(xùn)練的耐力運動員存在右心室功能障礙[11]。

3.2 長期大強度運動上調(diào)大鼠心肌MMP-2/TIMP-2的比值

MMP-2是心肌組織中活性最強的一種MMP，為內(nèi)源性蛋白水解酶，幾乎可以降解細胞外基質(zhì)的所有組分，主要降解變性膠原、明膠和基膜的主要成分Ⅵ膠原。TIMP-2能特異性的與MMP-2結(jié)合，抑制其活性。正常生理狀態(tài)下，心臟ECM的合成和降解維持動態(tài)平衡，其成分的過度生成或異常降解均會導(dǎo)致心肌的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，影響心臟的功能[22]。

MMP-2和TIMP-2異常表達，導(dǎo)致MMP-2/TIMP-2的比例失調(diào)，是引起心肌結(jié)構(gòu)重塑和心功能衰退的重要原因[23]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠心室MMP-2和TIMP-2的表達顯著性增加，MMP-2的比值升高[15]。Morishita人體研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死后血液中MMP-2的表達變化與左心室射血分數(shù)的下降緊密相關(guān)[24]。Arumugam等研究通過異丙腎上腺素誘導(dǎo)建立心肌肥厚大鼠模型，心肌MMP-2高表達，而TIMP-2呈低表達，MMP-2/TIMP-2的比例顯著升高[23]。臨床研究和動物實驗結(jié)果均顯示，MMP-2的活性增高或MMP-2/TIMP-2比值升高可能是心肌缺血再灌注損傷的病理機制之一[25，26]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與安靜組相比，經(jīng)過16周大強度運動后大鼠心肌MMP-2的基因和蛋白表達均顯著增加，而TIMP-2無明顯變化。經(jīng)計算發(fā)現(xiàn)，MMP-2/TIMP-2的比值顯著升高。前期研究表明，16周的大強度運動導(dǎo)致右心室纖維化，其可能與增高的MMP-2和MMP-2/ TIMP-2的比值升高有關(guān)[9]。研究表明，正常的膠原蛋白可以被升高的MMP-2降解，然后被缺乏連接結(jié)構(gòu)的膠原纖維所取代，結(jié)果表現(xiàn)為MMP-2表達的增高伴隨心肌纖維化程度的增加。MMP-2的表達受到轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的調(diào)控[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，長期大強度運動可造成大鼠心肌TGF-β1的持續(xù)高表達[27]。據(jù)此，可以推測，長期大強度運動導(dǎo)致MMP-2的高表達，可能受到了TGF-β1的正向調(diào)節(jié)。

綜上所述，長期大強度運動誘導(dǎo)右心室MMP-2的表達增加，MMP-2/TIMP-2的比例失調(diào)，導(dǎo)致心肌纖維化，心肌收縮和舒張功能下降，同時造成心電傳導(dǎo)異常，可能是長期大強度運動后心功能異常和心律失常的病理機制。

4 結(jié)論

（1）中等強度運動對大鼠羥脯氨酸和右心室心功能的影響不顯著。長期大強度運動導(dǎo)造成大鼠右心室羥脯氨酸含量顯著增加，導(dǎo)致右心室心功能異常。

（2）長期大強度運動誘導(dǎo)大鼠心肌MMP-2的表達

顯著增加，對TIMP-2的影響不顯著，MMP-2/TIMP-2的比值顯著增加，可能是造成右心室心功能異常和運動性心肌纖維化的機制之一。

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Effects of Long-term Endurance Exercise on the Right Ventricular MMP-2 and TIMP-2 of Rats

Wang Shiqiang1，2，Chang Yun1，Rao Zhijian1，Ma Xiaowen1
1 China Institute of Sport Science，Beijing，China 100061 2 Intitute of Sports，Hunan University of Technology，Shanghai，China 412008 Corresponding Author：Chang Yun，Email：changyun2518@vip.sina.com

Objective To explore the effects of long-term exercise on the content of hydroxyproline and right ventricular function，and to investigate the role of matrix metalloproteinase-2（MMP-2）and matrix metalloproteinase tissue inhibitor-2（TIMP-2）during the exercise in order to provide experimental evidence for clarifying the mechanism of exercise-induced myocardial fibrosis and arrhythmia.Methods 24 SD rats were divided into control group（C），moderate intensity exercise group（M，15.2 m/min，5°slope）and high intensity exercise group（H，28 m/min，10°slope）.Rats in groups M and H were conditioned to run 1 hour per day，5 days per week for a total of 16 weeks.The right ventricular function of the rats was measured by echocardiography.The rats were euthanized within 24 h after the last exercise，and their right ventricles were

exercise，rat，right ventricle，hydroxyproline，MMP-2

2015.12.07

國家體育總局體育科學(xué)研究所基本業(yè)務(wù)經(jīng)費（15-37）

常蕓，Email：changyun2518@vip.sina.com

collected.Ventricular hydroxyproline was measured by alkaline hydrolysis method.MMP-2 and TIMP-2 gene expression were evaluated by real-time PCR.MMP-2 and TIMP-2 proteins were quantified by Western Blot. Results（1）There was significant difference in ventricular ejection fraction（RVEF）between group H and groups C and M（P＜0.05），and insignificant difference in RVEF and right ventricular fractional shortening（RVFS）between group C and group M，and in RVFS between group H and groups C and M.（2）There was significant difference in hydroxyproline content between group H and groups C and M（P＜0.01），while insignificant difference between group C and group M.（3）There was significant difference in the expression of MMP-2 mRNA between group H and group C（P＜0.05），and in the expression of MMP-2 protein between group C and group H（P＜0.01），while insignificant difference between group H and group C.Though there was no significance in the MMP-2/TIMP-2 mRNA and MMP-2/TIMP-2 mRNA among the three group，while significant significance in the MMP-2/TIMP-2 mRNA between group H and groups C and M（P＜0.01）. Conclusion Long-term intensive exercise induce increase in hydroxyproline content in right ventricle of rats，resulting in right ventricular dysfunction，increased MMP-2，and disproportionality of MMP-2/TIMP-2，which probably is one of the factors that cause the exercise-induced cardiac dysfunction and arrhythmia.