傳統(tǒng)稀釋液配方中添加不同保護(hù)劑對(duì)藏羊精液冷凍效果的影響

馬元梅，張晉青，常永梅，扈添琴，趙 靜，張 楠

（青海省家畜改良中心，西寧 810016）

傳統(tǒng)稀釋液配方中添加不同保護(hù)劑對(duì)藏羊精液冷凍效果的影響

馬元梅，張晉青，常永梅，扈添琴，趙 靜，張 楠

（青海省家畜改良中心，西寧 810016）

為探索在傳統(tǒng)稀釋液配方中添加保護(hù)劑對(duì)藏羊精子的冷凍保存效果，在傳統(tǒng)稀釋液配方（果糖-蔗糖-檸檬酸鈉-甘油）中，由Tris（三羥甲基氨基甲烷）代替檸檬酸鈉，乙二醇代替甘油，在果糖-蔗糖-Tris-乙二醇基礎(chǔ)上添加維生素B12、維生素E、維生素C、復(fù)合維生素B等，以增強(qiáng)精子緩沖力，減少毒性，提高精子活力、頂體完整率及受精力。結(jié)果表明：精液冷凍保存稀釋液中添加Tris比添加檸檬酸鈉有更好的冷凍保存效果，能有效改善凍后精子活力和頂體完整率；精液冷凍保存稀釋液中添加維生素B12對(duì)精子有良好的保護(hù)作用；用等體積乙二醇代替甘油作為防凍劑，對(duì)精子冷凍時(shí)的保護(hù)作用不亞于甘油；藏羊細(xì)管冷凍精液的制作中，用果糖-蔗糖-Tris-乙二醇-維生素B12組合稀釋液配方進(jìn)行2次稀釋?zhuān)?min冷凍，其冷凍效果最佳，頂體完整率最高。

傳統(tǒng)稀釋液；保護(hù)劑；藏羊；冷凍效果

精液保存時(shí)，精清對(duì)精子的保護(hù)作用是有限的，需要對(duì)精液進(jìn)行稀釋來(lái)保護(hù)精子，尤其在精液降溫平衡、冷凍、解凍過(guò)程中，稀釋可在一定程度上減輕對(duì)精子的損傷。精子復(fù)蘇率與頂體完整率的高低完全取決于精液稀釋液中營(yíng)養(yǎng)保護(hù)劑對(duì)精子保護(hù)和減少冷打擊的作用，進(jìn)而保護(hù)精子細(xì)胞免受應(yīng)激［1］。有資料表明：綿羊精液有其特殊性，有較高的代謝水平，在氧的作用下可以迅速氧化導(dǎo)致精子中毒和死亡［2］。稀釋液中添加保護(hù)劑三羥甲基氨基甲烷（Tris）對(duì)代謝酸中毒和酶活動(dòng)具有良好的緩沖作用，維生素類(lèi)的添加劑具有改進(jìn)精子活率，提高受胎率的作用［3］，用乙二醇作為精液冷凍保護(hù)劑具有比甘油更好的效果，且能明顯提高凍后精子的頂體完整率［4］。

為此，本試驗(yàn)以傳統(tǒng)稀釋液配方為基礎(chǔ)液，在藏羊精液稀釋液中先添加緩沖劑Tris，再用滲透性保護(hù)劑乙二醇代替甘油，最后逐個(gè)加入營(yíng)養(yǎng)添加劑維生素B12、維生素E、維生素C和復(fù)合維生素B，以研究不同保護(hù)劑對(duì)精液精子活力、頂體完整率及受精力的影響，旨在為提高藏羊的受胎率和繁殖率提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑及設(shè)備

蔗糖、果糖、檸檬酸鈉，均由北京化學(xué)試劑二廠生產(chǎn)；三羥甲基氨基甲烷、乙二醇，由上海山浦化工有限公司生產(chǎn)；維生素B12、維生素E、維生素C、復(fù)合維生素B，由石藥銀湖制藥有限公司生產(chǎn)；純化水，由青海省家畜改良中心凍精生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；姬姆薩染液由西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司提供。

相差顯微鏡（型號(hào)為BX43），由OLYMPUS公司生產(chǎn)；密度測(cè)定儀、卡蘇細(xì)管凍精（灌裝、封口、印字）一體機(jī)、程控冷凍儀，均由法國(guó)卡蘇科技有限公司提供?；瘜W(xué)試劑均為分析純以上。

1.2試驗(yàn)羊只和方法

1.2.1羊只從青海省內(nèi)種羊場(chǎng)引進(jìn)1.5～2歲藏羊種公羊6只，在青海省家畜改良中心全舍飼飼喂青海省三江源飼料公司生產(chǎn)的肉羊混合飼料，經(jīng)過(guò)3～5個(gè)月的馴化、調(diào)教，采集精液。

1.2.2方法以傳統(tǒng)稀釋液配方為基礎(chǔ)液，藏羊精液稀釋液中先添加緩沖劑Tris，再用滲透性保護(hù)劑乙二醇代替甘油，最后逐個(gè)加入營(yíng)養(yǎng)添加劑維生素B12、維生素E、維生素C和復(fù)合維生素B，進(jìn)行精子活力、頂體完整率及受精能力研究。采集精液，鏡檢鮮精活力在65%以上，精子密度每毫升20億以上，凍精生產(chǎn)嚴(yán)格按NY/T 1234—2006牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程。在不同稀釋液配方、相同的平衡時(shí)間、相同的冷凍曲線和冷凍時(shí)間、相同的解凍溫度和時(shí)間條件下冷凍保存。隨機(jī)抽取不同稀釋液配方細(xì)管凍精2劑。解凍后剪去超聲波封口端，用推針從棉塞端將精液推入小試管中混勻，從中層吸取5μL，進(jìn)行活力觀察，剩余的精液用2.9%檸檬酸鈉進(jìn)行1∶5稀釋混勻，在其中層取一小滴精液，于潔凈的玻片一端，常規(guī)抹片、染色，觀察精子頂體完整性。試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3稀釋液配方篩選

本試驗(yàn)的稀釋液配方見(jiàn)表1。

表1　藏羊細(xì)管凍精稀釋液配方

1.4精液的采集與精液品質(zhì)測(cè)定

1.4.1采精前準(zhǔn)備清潔種公羊體表，清洗包皮。

1.4.2采精頻率每星期采精3次，每次可根據(jù)體質(zhì)等情況，連續(xù)排精2次（間隔時(shí)間15～20min）。

1.4.3采精方法采用真臺(tái)羊、假陰道方法。采精室及用具須清潔，消毒；假陰道溫度適中（36～39℃），氣壓、潤(rùn)滑劑調(diào)試正常。

1.4.4精液品質(zhì)檢查鮮精采集后，先用10μL移液槍取5μL于載玻片上，蓋上蓋玻片，放入38℃恒溫相差顯微鏡下觀察活力，再用電子天平稱(chēng)重法計(jì)算出采精量，最后用法國(guó)卡蘇公司1181密度儀測(cè)定精液密度。藏羊鮮精品質(zhì)檢查結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　藏羊鮮精品質(zhì)檢查參數(shù)及結(jié)果

1.5精液冷凍保存與解凍

1.5.1精液的稀釋與平衡 基礎(chǔ)液的配制：各配方基礎(chǔ)液所用化學(xué)藥品精確稱(chēng)量后，放入容器為100mL的量筒內(nèi)，加蒸餾水50mL左右，用消毒過(guò)的玻璃棒攪拌，待溶解后再加蒸餾水定容至100mL，混勻后用濾紙過(guò)濾于三角燒杯中，扎好瓶口，置水浴鍋中隔水煮沸消毒30min。冷卻后加入青、鏈霉素各10萬(wàn)IU即構(gòu)成基礎(chǔ)液。基礎(chǔ)液加15%（V/V）卵黃即為Ⅰ液，用于2次稀釋處理的第1次稀釋。取第Ⅰ液45mL，加入隔水煮沸消毒好的5%（V/V）甘油（乙二醇），充分?jǐn)嚢杈鶆蚣礃?gòu)成Ⅱ液。用于兩次稀釋處理的第2次稀釋。

稀釋保護(hù)劑要現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.2稀釋、平衡采用2次稀釋法。先用第Ⅰ液等溫1∶1稀釋?zhuān)湃?4℃的水浴鍋中，10min后加至稀釋總量一半，移至5℃冰箱平衡2.5 h，冷凍前0.5 h再用含有甘油（乙二醇）第Ⅱ液加至最終稀釋量。

1.5.3精液的冷凍與保存 采用細(xì)管一體機(jī)灌裝，灌裝后的細(xì)管即可用程控冷凍儀進(jìn)行冷凍，首先在電腦中設(shè)置好冷凍的最佳溫度曲線，開(kāi)啟液氮罐閥門(mén)把冷凍儀的溫度降到4℃，將排好細(xì)管的細(xì)管棉塞封口端對(duì)著操作者，超聲波封口端遠(yuǎn)離操作者。冷凍程序如下：4℃→3min -10℃→2min→-100℃→2min→-140℃。冷凍時(shí)間7min。冷凍結(jié)束后取出并迅速浸泡在液氮中。

1.5.4精液的解凍38～40℃水浴30 s解凍。取公羊細(xì)管凍精迅速泡入38～40℃水中并晃動(dòng)，待溶解后立即取出，擦干細(xì)管水珠，剪去細(xì)管封口端，取5μL精液，在恒溫38℃裝置的相差顯微鏡上檢查精子活力，合格凍精入庫(kù)保存。

1.5.5精子活率評(píng)定 用10μL移液器取解凍后的精液5μL置于載玻片上，加蓋玻片后立即在100倍顯微鏡下觀察活力，顯微鏡載物臺(tái)溫度保持38℃。每樣片觀察3個(gè)視野，并應(yīng)觀察不同液層內(nèi)精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行全面評(píng)定。

1.5.6精子活力計(jì)算 3個(gè)視野精子活力評(píng)價(jià)的平均值。

1.6精子染色

1.6.1抹片取稀釋后鮮精或凍精一滴滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈35°夾角，將樣品均勻地涂布于載玻片上，自然風(fēng)干（約5min）。每樣品制作2個(gè)抹片。

1.6.2固定在已風(fēng)干的抹片上滴1.0～2.0mL中性福爾馬林固定液，固定15min后用清水緩緩沖去固定液，吹干或自然風(fēng)干。

1.6.3染色將固定好的抹片反扣在帶有平槽的有機(jī)玻璃面上，把姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿(mǎn)平槽并使抹片接觸染液，染色1.5 h后用水緩緩沖去染液，涼干待檢。

1.7精子頂體觀察

將制備好的抹片在顯微鏡（400倍）下觀察。根據(jù)精子頂體完整和損傷與否，將精子頂體形態(tài)分為5種類(lèi)型：

（1）精子頂體完整型：精子頭部外形正常，有明顯的頂脊，頂體部分呈均勻一致的紫紅色，邊緣整齊，赤道帶清晰。

（2）精子頂體輕微膨脹：頂脊不明顯或部分消失，頂體部分的紫紅色深淺不一，邊緣不整齊；精子尾部與頭部的連接點(diǎn)不在精子頭的對(duì)稱(chēng)軸上；精子頭的基部狹窄。

（3）精子頂體嚴(yán)重膨脹型：頂脊完全消失；頂體嚴(yán)重膨脹后出現(xiàn)皺折，染色后出現(xiàn)明顯的條紋或精子頂體膨大呈冠狀；精子頭部與尾部連接點(diǎn)呈明顯的偏軸狀態(tài)。

（4）精子頂體部分脫落：頂體嚴(yán)重膨脹到一定程度后，開(kāi)始脫離精子，露出被頂體覆蓋的細(xì)胞核。

（5）精子頂體完全脫落：頂體完全脫落精子，精子核裸露。

1.8精子頂體完整率計(jì)算

每個(gè)樣品制作2個(gè)抹片，每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上的精子（分左右兩個(gè)區(qū)），取2片的平均值，2片的變異系數(shù)不得大于20%，若超過(guò)應(yīng)重新制片。

精子頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/總精子數(shù)× 100%

2　結(jié)果與分析

從表3看出，試驗(yàn)組冷凍效果均優(yōu)于對(duì)照組，配方3冷凍效果最好。解凍后精子活力與頂體完整率，配方3與其他配方間均差異極顯著（P＜0.01）；配方2與配方1間差異不顯著（P＞0.05），但與配方4、配方5、配方6間差異顯著（P＜0.05），與配方3間差異極顯著（P＜0.01）；配方4、配方5、配方6之間均差異不顯著（P＞0.05）。

表3　不同稀釋液凍精精子活力、頂體完整率%

3　討論

（1）稀釋液中添加Tris對(duì)精子有良好的保護(hù)作用，能提高精子活力和頂體完整率。綿羊精液有其特殊性，有較高的代謝水平，在氧的作用下可以迅速氧化導(dǎo)致精子中毒和死亡［5］。Tris還具有良好的緩沖性和滲透性，并且高濃度時(shí)對(duì)精子毒性也降低。

（2）目前綿羊精液稀釋液中，最常用的抗凍保護(hù)劑是甘油，但在常溫下甘油對(duì)精子有毒害作用，對(duì)凍后精子活力和頂體完整率具有很大的負(fù)面影響。本試驗(yàn)使用乙二醇滲透性好，對(duì)細(xì)胞毒性小，可在常溫時(shí)加入，用等體積乙二醇代替甘油作為防凍劑，解凍后精子活力和頂體完整率無(wú)明顯差異。

（3）資料表明，按每100mL稀釋液中添加4~6mL維生素類(lèi)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)劑，精液冷凍、解凍過(guò)程中對(duì)精子活力、頂體完整率及精子生存指數(shù)都有保護(hù)作用。試驗(yàn)證明，每100mL稀釋液中添加5mL維生素類(lèi)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)劑，冷凍后精液品質(zhì)都有所提高，但種類(lèi)不同保護(hù)效應(yīng)不同，維生素B12保護(hù)效果最顯著。

4　結(jié)論

（1）精液冷凍保存稀釋液中加0.2 g/100mL Tris比加3.7 g/100mL檸檬酸鈉冷凍效果更好，凍后精子活力增加了3個(gè)百分點(diǎn)，頂體完整率增加了4.45個(gè)百分點(diǎn)。

（2）精液冷凍保存稀釋液中加5 g/100mL維生素B12液對(duì)精子有良好的保護(hù)性。

（3）用等體積乙二醇代替甘油作為防凍劑，對(duì)精子冷凍時(shí)保護(hù)作用不亞于甘油。

（4）藏羊細(xì)管冷凍精液的制作中，用果糖-蔗糖-Tris-乙二醇-維生素B12組合稀釋液配方進(jìn)行2次稀釋?zhuān)?min冷凍，冷凍效果最佳，精子頂體完整率最高。

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1.3數(shù)據(jù)處理

表中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2　結(jié)果

表2顯示，舍飼4年羊晝夜采食、反芻、靜臥和睡眠時(shí)間分別為372.33、417.98、333.23和410.61min，放牧羊分別為481.05、498.24、247.18和212.54min。即舍飼羊晝夜平均采食和反芻時(shí)間分別比放牧羊少108.72min（P＜0.01）和80.62min（P＜0.01），而舍飼羊靜臥和睡眠時(shí)間分別比放牧羊多86.08min（P＜0.01）和198.07min（P＜0.01）。

舍飼羊與放牧羊在晝夜采食、反芻、靜臥、睡眠時(shí)間比例分別為0.77、0.84、1.35和1.93。

舍飼母羊共20只，產(chǎn)羔13只，產(chǎn)羔率65%；放牧母羊產(chǎn)羔率90%。舍飼母羊臨床表現(xiàn)為食欲不振，行動(dòng)遲緩，目光無(wú)神，眼結(jié)膜稍有充血，嗜好靜臥。舍飼羊瘤胃pH值平均5.6（酸中毒），而放牧羊pH值6.7（正常范圍）。

表2　哈薩克羊的晝夜采食、反芻、靜臥、睡眠等行為

3　分析與討論

3.1綿羊酸中毒

上述觀察統(tǒng)計(jì)研究結(jié)果顯示，舍飼4年以上成年母羊，其臨床表現(xiàn)為酸中毒癥狀，瘤胃液pH值5.6，也屬于酸中毒pH值范圍內(nèi)。韓正康等［7］指出，綿羊瘤胃液pH值一般在5.0～7.5范圍內(nèi)，而當(dāng)瘤胃液pH值低于6.5時(shí)，已不利于纖維素的消化，而在6以下可導(dǎo)致酸中毒，當(dāng)pH值為4時(shí)，其過(guò)量的乳酸可致綿羊死亡。楊占春［8］的研究結(jié)果表明，綿羊酸中毒，其瘤胃液pH值范圍在4.5～6.0之間，也證實(shí)了pH值為5.6屬于酸中毒的pH值范圍之內(nèi)。有研究［9-13］報(bào)道，綿羊酸中毒輕者可以導(dǎo)致體況消瘦，發(fā)情繁殖率降低，生產(chǎn)水平下降，重者甚至導(dǎo)致死亡。本次試驗(yàn)雖然日糧配方全價(jià)，草料優(yōu)質(zhì)，但舍飼羊食欲較差，羊體消瘦，5歲活重僅在45 kg左右。本觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果與前者研究結(jié)果相符。

3.2與舍飼綿羊酸中毒及低繁殖率的關(guān)聯(lián)因素

與放牧羊比較，舍飼綿羊酸中毒和低繁殖率時(shí)，往往伴隨晝夜靜臥和嗜睡時(shí)間顯著增加，采食、反芻和活動(dòng)時(shí)間明顯減少等行為，導(dǎo)致瘤胃食物排出速度降低，滯留時(shí)間長(zhǎng)，致使瘤胃pH值大幅下降，當(dāng)其pH值小于5.9時(shí)，多表現(xiàn)出瘤胃酸中毒臨床癥狀。

綜上所述，參考有關(guān)學(xué)者研究成果和本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，為了減輕草場(chǎng)放牧壓力，理應(yīng)提倡綿羊舍飼，但最好不要超過(guò)3年。而綿羊短期和半舍飼方法是較好的技術(shù)選擇，既能減輕草場(chǎng)壓力，又能有效避免綿羊生產(chǎn)力的下降，同時(shí)也可以充分利用秸稈農(nóng)作物資源，降低飼養(yǎng)成本，提高綿羊生產(chǎn)潛力。

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S826.3

A

2095-3887（2016）06-0057-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.06.016

2016-08-23

青海省科學(xué)技術(shù)廳科技促進(jìn)新農(nóng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（2014-NS-504）

馬元梅（1968-），女，高級(jí)畜牧師，農(nóng)學(xué)學(xué)士。研究方向：動(dòng)物遺傳、育種及改良。