UPLC快速測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)的方法

張星星，郭安鵲,2，韓富亮,2，張予林,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)中心，陜西 楊陵 712100)

UPLC快速測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)的方法

張星星1，郭安鵲1,2，韓富亮1,2，張予林1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊陵 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)中心，陜西 楊陵 712100)

建立一種新型、快速測(cè)定葡萄酒中多種單體酚的超高效液色譜方法。采用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；色譜條件：流動(dòng)相A為1%乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速為0.2 mL/min；檢測(cè)波長為210～400 nm；梯度洗脫15 min。方法精密度（n=6）實(shí)驗(yàn)的17 種酚類物質(zhì)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%～0.66%，對(duì)葡萄酒進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的17 種酚類物質(zhì)回收率范圍為85.10%～102.33%。該方法簡(jiǎn)單省時(shí)、精確可靠、重復(fù)性好，非常適用于葡萄酒中酚類物質(zhì)的定性與定量分析。

超高效液相色譜；葡萄酒；單體酚；測(cè)定方法

適量規(guī)律性地飲用葡萄酒有益身體健康，葡萄酒特別是紅葡萄酒中種類、含量豐富的酚類物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化及預(yù)防心血管疾病等多種功能，是葡萄酒中營養(yǎng)成分的主要來源[1-3]。同時(shí)，作為葡萄酒的“骨架”成分，酚類物質(zhì)不僅決定著葡萄酒澀味和苦味的強(qiáng)弱，而且影響著葡萄酒的色澤及生物化學(xué)穩(wěn)定性[4-5]，也是決定葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素。因此，建立快速、準(zhǔn)確分析葡萄酒中酚類物質(zhì)的方法對(duì)全面評(píng)價(jià)葡萄酒營養(yǎng)價(jià)值、進(jìn)而提高葡萄酒的質(zhì)量具有重要意義。

葡萄酒中酚類物質(zhì)主要的測(cè)定方法有光譜法[6]、電化學(xué)法[7-8]、色譜法[9-18]，其中色譜法是目前酚類物質(zhì)最常用的檢測(cè)方法。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）結(jié)合多種檢測(cè)器可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄酒中多種酚類物質(zhì)的定性與定量分析[9-13]，但該法存在分析時(shí)間長、有機(jī)溶劑消耗多等缺點(diǎn)。超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）柱采

用粒徑為1.7 μm的填料，柱效高，能獲得更好的線速度范圍從而提高分析速率與靈敏度，具備快速、靈敏、分離度高的技術(shù)特點(diǎn)[14]，國外已有將其應(yīng)用于葡萄酒中酚類物質(zhì)檢測(cè)的研究[15-18]。國內(nèi)利用UPLC主要用于葡萄酒中食品添加劑、工業(yè)色素等物質(zhì)的檢測(cè)分析[19-21]，有關(guān)酚類物質(zhì)分析的較少。趙建勇等[14]建立了一種測(cè)定葡萄酒中7 種單體酚含量的UPLC檢測(cè)方法。

本研究利用離心代替?zhèn)鹘y(tǒng)分液漏斗萃取，通過改進(jìn)成宇峰等[22]的前處理方法，有效降低有機(jī)溶劑與酒樣的使用量。同時(shí)，采用多波長檢測(cè)，提高不同種類酚類物質(zhì)定量檢測(cè)的精確性和準(zhǔn)確性；建立UPLC測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)色譜條件，提高色譜峰分離度并縮短測(cè)定時(shí)間；最終建立一種能夠快速、高效測(cè)定葡萄酒中單體酚的UPLC分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)中一共10 款供試酒樣，酒樣具體信息如表1所示。

表1 葡萄酒供試樣品Table 1 Information of wine samples

標(biāo)準(zhǔn)樣品：香草酸、阿魏酸、水楊酸 美國Fluka公司；安息香酸、反式白藜蘆醇 美國Alorich公司；綠原酸、香豆素、桑色素、蘆丁、咖啡酸、香豆酸、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、槲皮素、橘皮素、山奈酚、丁香酸 美國Sigma公司。

甲醇、乙腈（色譜級(jí)），乙酸、乙酸乙酯（分析純），均為國產(chǎn)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC I-Class儀（Empower色譜工作站、二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器） 美國Waters公司；BT25S 十萬分之一天平 德國Startorius公司；A.9901S真空抽濾器、AS 3120B超聲波脫氣機(jī) 奧特賽恩斯公司；watef Millipore純水機(jī) 英國Millipore公司；RE-52AA薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

單體酚單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：用十萬分之一天平，準(zhǔn)確稱取17 種單體酚的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別加入10 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容至10 mL，配成不同質(zhì)量濃度不同單體酚的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。

單體酚混合標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：用十萬分之一天平，準(zhǔn)確稱取17 種單體酚的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入10 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容至10 mL，配成混合標(biāo)準(zhǔn)樣品母液。配制的單體酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度質(zhì)量濃度如表2所示。

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品不同濃度梯度Table 2 Different levels of mixed standard solutions

1.3.2 前處理

實(shí)驗(yàn)改進(jìn)成宇峰等[22]單體酚提取方法；取10 mL酒樣加入等體積的乙酸乙酯旋渦振蕩后離心，取上層清液于100 mL圓底燒瓶，重復(fù)萃取3 次合并上清液于減壓蒸餾旋干（35 ℃），甲醇溶解殘?jiān)?20 ℃冰箱保存，留作色譜分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：BEH C18反相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長210～400 nm；流動(dòng)相：A相為體積分?jǐn)?shù)為1%乙酸，B相為乙腈；梯度洗脫。

梯度洗脫程序：0～3 min，B相3%～6%，3～7 min，B相為6%～15%，7～11 min，B相為15%～30%，11～13 min，B相為30%，13～15 min，B相為30%～3%。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC測(cè)定葡萄酒酚類物質(zhì)色譜條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相與洗脫梯度的確定

圖1 不同乙酸體積分?jǐn)?shù)條件下混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（λ=280 nm）0 nmFig. 1 Chromatogram of mixed standard in acetic acid solutions of different concentrations (λ = 280 nm)

根據(jù)張予林等[23]測(cè)定單體酚HPLC色譜條件，利用HPLC-UPLC方法器轉(zhuǎn)換得到初級(jí)洗脫梯度：0～3 min，B相為3%～6%；3～7 min，B相為6%～15%；7～11 min，B相為15%～30%；11～13 min，B相為30%；13～16 min，B相為30%～3%。采用2%乙酸-乙腈流動(dòng)相體系，為使峰分離效果更好，實(shí)驗(yàn)調(diào)整乙酸溶液的質(zhì)量濃度，將流動(dòng)相A調(diào)整為體積分?jǐn)?shù)3%、2%、1%、0.5%乙酸溶液，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行色譜分析。由圖1可知，流動(dòng)相乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，17 種單體酚均達(dá)到基線峰分離，分離效果最佳。因此選擇A（1%乙酸）-B（乙腈）作為流動(dòng)相。在原有的洗脫梯度上調(diào)整，得到最終流動(dòng)相及洗脫梯度如表3所示。

表3 流動(dòng)相與洗脫梯度Table 3 Mobile phase composition for gradient elution

2.1.2 色譜柱檢測(cè)溫度

圖2 不同柱溫條件下混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（ =280 nm）Fig. 2 Chromatograms of mixed standard at different column temperatures (λ = 280 nm)

UPLC柱檢測(cè)溫度一般設(shè)定為高于室溫5 ℃，過高溫度對(duì)酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)有影響，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)定2 個(gè)柱溫：35 ℃與30℃，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。當(dāng)色譜柱檢測(cè)溫度為35 ℃，較高的柱溫導(dǎo)致物質(zhì)分配系數(shù)減小，17 種單體酚標(biāo)樣色譜峰未達(dá)到基線分離；當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí)，17 種單體酚色譜峰均達(dá)到基線分離。因而最終選擇30 ℃作為色譜柱檢測(cè)溫度。

2.1.3 UPLC測(cè)定酚類物質(zhì)色譜條件

最終確定的UPLC條件如表4所示，在此色譜條件下分別對(duì)17 種單體酚單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)樣，確定每種物質(zhì)最大吸收波長與保留時(shí)間，如表5所示。根據(jù)單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的最大吸收波長與保留時(shí)間對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品中17 種單體酚進(jìn)行定性，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

表4 測(cè)定17 種單體酚最終UPLC色譜條件Table 4 Optimal UPLC chromatographic conditions for 17 monophenols

表5 17 種單體酚最大吸收波長、保留時(shí)間與相對(duì)分子質(zhì)量Table 5 Maximum absorbance wavelengths, retention times, and molecular weights of 17 mono-phenols

圖3 17 種單體酚測(cè)定色譜圖（λ=2800 nnmm）Fig. 3 Chromatogram of a mixture of 17 standards (λ = 280 nm)

2.2 UPLC測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)方法評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

按照表2配制7 種不同質(zhì)量濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照表4色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到17 種單體酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如表6所示。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可知，17 種單體酚線性關(guān)系決定系數(shù)均在0.999 8～1.000 0，說明單體酚在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表6 17 種單體酚最大吸收波長、保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 6 Maximum absorbance wavelengths, retention times, and regression equations for 17 monophenols

2.2.2 方法精密度

表7 17 種單體酚精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of precision for 17 monophenols (n = 6)

在確定的UPLC條件下測(cè)定高中低3 個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），如表7所示。17 種單體酚在高中低3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度峰面積的平均RSD范圍為0.25%～0.66%，說明方法精密度良好。

2.2.3 方法回收率

加標(biāo)葡萄酒與原葡萄酒利用改進(jìn)前處理方法提取單體酚，利用UPLC測(cè)定17 種單體酚含量，計(jì)算每種單體酚的回收率，如表8所示。UPLC測(cè)定葡萄酒中17 種單體酚加標(biāo)回收率范圍為85.10%～102.33%，說明方法的準(zhǔn)確度高。

表8 17 種單體酚回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n==33）Table 8 Results of recovery for 17 monophenols (n == 33))

2.2.4 方法重復(fù)性

表9 17 種單體酚重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n =3)Table 9 Results of repeatability for 17 monophenols (n =3)

同一葡萄酒酒樣利用改進(jìn)的前處理方法提取單體酚，重復(fù)處理3 次，UPLC測(cè)定得到17 種單體酚含量，計(jì)算3 次測(cè)定結(jié)果RSD，如表9所示。UPLC測(cè)定葡萄酒中17 種單體酚，結(jié)果表明含量RSD為0.394%～10.367%，說明方法的重復(fù)性較好。

2.3 UPLC測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)含量結(jié)果

圖4 葡萄酒樣2色譜圖（λ=2800 nnmm）Fig. 4 Chromatogram of wine sample (λ = 280 nm)

表10 10 種葡萄酒樣單體酚含量（n==33）Table 10 Contents of 17 monophenols in 10 different wine samples (n == 33)) mg/L

利用改進(jìn)的前處理方法提取葡萄酒中單體酚，重復(fù)處理3 次，利用確定的UPLC條件測(cè)定葡萄酒中17 種單體酚含量，計(jì)算3 次處理單體酚含量的RSD。如圖4、表10所示，10 種葡萄酒中17 種單體酚總含量在13.82～253.56 mg/L，其中酒樣7為威代爾白葡萄酒單體酚總含量較低為13.82 mg/L；紅葡萄酒單體酚總含量較高在131.93～253.56 mg/L。供試酒樣中桑色素均未檢測(cè)出。

3 討 論

前處理方法是UPLC法測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)的關(guān)鍵步驟[1]，實(shí)驗(yàn)利用離心代替分液漏斗萃取。分液漏斗萃取過程單體酚與空氣接觸時(shí)間長易與氧氣反應(yīng)，造成損失[24]。實(shí)驗(yàn)采用離心降低單體酚在前處理過程中的損失，提高了測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。

利用色譜法對(duì)多組分體系進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于各組分的最大吸收波長不盡相同，利用恒定波長很難準(zhǔn)確測(cè)定組分的真實(shí)含量[25]。實(shí)驗(yàn)選擇二極管陣列檢測(cè)器，在波長210～400 nm處對(duì)17 種待測(cè)單體酚進(jìn)行全波長掃描，根據(jù)測(cè)定結(jié)果在每種單體酚的最大吸收波長處對(duì)其定性與定量分析，提高了測(cè)定方法的準(zhǔn)確度與靈敏度。

本實(shí)驗(yàn)利用建立的UPLC條件對(duì)10 種供試葡萄酒單體酚進(jìn)行測(cè)定，桑色素均未檢出。桑色素化學(xué)名為3,5,7,2’,4’-五羥基黃酮，屬黃酮醇類物質(zhì)，空氣中易氧化為黃色。目前測(cè)定葡萄酒中桑色素結(jié)果大都表明未檢出[26-27]。分析原因主要是酒樣中桑色素含量很少，可通過擴(kuò)大樣品數(shù)量，進(jìn)一步研究葡萄酒中桑色素的含量。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了分析葡萄酒中單體酚的UPLC條件，對(duì)葡萄酒中17 種單體酚進(jìn)行分析檢測(cè)，主要研究結(jié)果如下：

確定了UPLC分析葡萄酒中17 種單體酚的方法。前處理方法：取10 mL酒樣加入等體積的乙酸乙酯旋渦振蕩后離心，重復(fù)萃取3 次合并上清液于減壓蒸餾旋干（35 ℃），甲醇溶解殘?jiān)?.22 μm膜過濾，-20 ℃保存。色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）反相色譜柱；流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫梯度為B相0～3 min為3%～6%，3～7 min為6%～15%，7～11 min，為15%～30%，11～13 min為30%，13～15 min為30%～3%；進(jìn)樣量0.5 μL；流速0.2 mL/min；色譜柱檢測(cè)溫度30 ℃；色譜柱平衡時(shí)間2.1 min；梯度洗脫時(shí)間15 min。

建立的UPLC測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)方法，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，17 種單體酚含量的RSD在0.25%～0.66%；加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)表明，加標(biāo)回收率在85.10%～102.33%之間；方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，單體酚含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.394%～10.367%，說明方法的精密度、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高。

通過對(duì)10 種供試葡萄酒單體酚測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄酒中單體酚含量豐富，不同單體酚質(zhì)量濃度差異較大；供試葡萄酒酒樣中桑色素均未檢出。

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Fast Determination of Phenolics and Polyphenolics in Wine by Ultra Performance Liquid Chromatography

ZHANG Xingxing1, GUO Anque1,2, HAN Fuliang1,2, ZHANG Yulin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

The aim of study was to develop a novel method using ultra-performance liquid chromatography (UPLC) to rapidly determine monophenols in wine. The UPLC system equipped with C18BEH analytical column (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) was kept at 30 ℃ by column oven, utilizing A 1% acetic acid and B acetonitrile mobile phase in the gradient elution mode within 15 min. The fl ow rate was 0.2 mL/min. A diode array detector (DAD) was used to monitor signals at 210□400 nm. The method precision (n = 6) for 17 compounds expressed as RSD was 0.25%□0.66% and average recovery rates of spiked wine samples were 85.10%□102.33%. The new method was simple, time-saving, accurate, reliable and prefect reproducible. Therefore, it is a promising method for the identifi cation and quantitation of phenolic compounds in wine.

ultra performance liquid chromatography (UPLC); wine; monophenols; assay

10.7506/spkx1002-6630-201610022

O657.7

A

1002-6630（2016）10-0128-06

張星星, 郭安鵲, 韓富亮, 等. UPLC快速測(cè)定葡萄酒中酚類物質(zhì)的方法[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 128-133. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610022. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Xingxing, GUO Anque, HAN Fuliang, et al. Fast determination of phenolics and polyphenolics in wine by ultra performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(10): 128-133. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610022. http://www.spkx.net.cn

2015-09-27

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-30-zp-9）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（QN2011098）

張星星（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程專業(yè)。E-mail：18740351864@163.com

*通信作者：張予林（1975—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槠咸丫品治雠c檢驗(yàn)。E-mail：zhangyl@nwsuaf.edu.cn