黃曲霉素B1對雞骨髓源樹突狀細胞成熟能力的影響

孫志永 姚海飛 陳奇 袁永莉

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黃曲霉素B1對雞骨髓源樹突狀細胞成熟能力的影響

孫志永①姚海飛②陳奇③袁永莉②

（①江蘇省洪澤縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 223100 ②江蘇省洪澤縣動物疫病預防控制中心 ③江蘇省清浦區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所）

黃曲霉素B1是威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的主要毒素之一，然而對禽免疫細胞-樹突狀細胞的免疫功能調(diào)控尚不明確。本試驗通過B1作用體外誘導培養(yǎng)的雞樹突狀細胞，測定其表型標志CD40和CD86的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B1作用樹突狀細胞24h后，顯著上調(diào)了CD40和CD86的表達(P<0.05)，卻顯著下調(diào)MHCII的表達(P<0.05)。表明B1促進雞樹突狀細胞不完全的功能成熟。

黃曲霉素 雞樹突狀細胞 表型

禽飼料中的黃曲菌能夠產(chǎn)生大量的黃曲霉素。黃曲霉素B1是其主要形式。在家禽中，B1可以引起家禽胃腸道前段的腺胃和肌胃發(fā)生炎癥、肝毒性、血液毒性等。此外，B1對免疫系統(tǒng)也具有抑制作用，是導致家禽疫苗免疫接種頻頻失敗的重要原因[1]。

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是激活宿主早期天然免疫和后期獲得性免疫的重要抗原提呈細胞[2]。在家禽中，DCs的免疫功能，特別是功能成熟方面，是保證各種疫苗免疫效力的關鍵。因此本研究旨在闡明黃曲霉素B1對雞DCs成熟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

黃曲霉素B1從A. flavus NRRL 5518菌株純化(美國國家利用研究中心)。完全細胞培養(yǎng)液：細胞培養(yǎng)基(RPMI1640，life)、抗生素(青鏈霉素，南京生興)、10%胎牛血清(Gbico)、重組雞GM-CSF(Abcam)和IL-4(Kingfisher)各50ng/ml?？贵w：抗雞FITC-MHCII(Abcam)、鼠抗雞CD40和CD86(AbD serotec)、PE標記羊抗鼠二抗(Mul-tiscience)2周SPF雞購自江南家禽育種有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雞骨髓DCs的培養(yǎng) 依照文獻進行適當改進[3]，首先無菌剝離2周SPF雞的股骨和脛骨，將骨髓用RPMI1640培養(yǎng)基沖出，離心收集細胞，應用密度梯度離心法(Histopaque-1119,1.119g/ml, 25℃;Sigma)純化目的細胞。隨后，應用完全培養(yǎng)液重懸細胞并鋪板，放置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。每隔兩天(第2天和第4天)半量換液，第7天收集懸浮細胞并進行形態(tài)學觀察鑒定。

1.2.2 雞DCs表型測定 黃曲霉素B1(10ng/ml)與DCs作用24h后，收集細胞，分別應用FITC-MHCII直接免疫熒光染色、CD40和CD86間接免疫熒光染色，最后洗滌細胞3次后，轉(zhuǎn)入流式專用管，應用流式細胞儀進行上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞DCs形態(tài)學鑒定

骨髓前體細胞經(jīng)過7天的細胞因子誘導培養(yǎng)，逐漸由體型較小圓形細胞分化為較大的并具有典型樹突樣結(jié)構(gòu)的細胞(圖1)，以上為雞DCs的典型形態(tài)學特征。

圖1 雞DCs形態(tài)學特性鑒定（注：DCs樹突(箭頭)）

2.2 雞DCs表型變化

由圖2所示，黃曲霉素B1刺激DCs 24 h后，與對照組(Mediun)相比，CD40和CD86的表達顯著上調(diào)(P<0.05)，而MHCII的表達顯著下調(diào)(P<0.05)，表明黃曲霉素B1促進DCs不完全成熟。

圖2 雞DCs表型標志變化（注：*表示組間差異顯著(P<0.05)）

3 討論

家禽從飼料中攝入的黃曲霉素B1水平一般處于較低濃度，并不致死。但嚴重影響家禽的生產(chǎn)性能和免疫接種效力。當疫苗接種后，DCs作為重要的抗原遞呈細胞，攝取抗原并快速功能成熟和活化，并向附近引流淋巴結(jié)遷移，向淋巴細胞遞呈抗原，最終啟動獲得性免疫應答[2]。因此，DCs功能成熟程度是關鍵。在成功誘導培養(yǎng)具有典型特征雞DCs的基礎上，評價了B1對DCs功能成熟的影響。結(jié)果表明DCs僅能上調(diào)CD40和CD86，而不能上調(diào)MHCII分子。MHCII是DCs將抗原遞呈給T細胞的第一信號，CD40和CD86是第二接頭信號，根據(jù)免疫學原理，只有雙信號均能有效啟動，DCs才能完成抗原的遞呈[4]。因此本研究結(jié)果最終表明B1受損了DCs的抗原遞呈功能。張鑫雷等[5]發(fā)現(xiàn)B1受損雞DCs對T細胞增殖能力也驗證了以上結(jié)論。

[1] 馮建蕾. 黃曲霉毒素的危害和防治[J]. 中國畜牧獸醫(yī). 2005(12).

[2] Chang SY, Ko HJ, Kweon MN. Mucosal dendritic cells shape mucosal immunity. Experimental & molecular medicine. 2014;46:e84.

[3] 李冉, 王桂軍, 王漢清等. 雞骨髓源樹突狀細胞的誘導分化及鑒定[J]. 中國預防獸醫(yī)學報. 2011(09).

[4] 馮鐘煦, 劉劍勇. 樹突狀細胞的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述. 2012(20).

[5] 張鑫雷, 應志豪.。黃曲霉素B1對雞骨髓源樹突狀細胞抗原遞呈能力的影響[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2015(3).

（2016–06–23）

S852.69

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1007-1733(2016)09-0024-02