黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響*

董雅潔，高維娟，盧鍇鋒，謝亞芹，朱炎杰（.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德　067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院）

黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響*

董雅潔1，高維娟2△，盧鍇鋒1，謝亞芹1，朱炎杰1
（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院）

目的:觀察黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響。方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組、黃芪注射液溶劑組、黃芪注射液組，采用四血管阻斷法建立腦缺血再灌注模型，分別采用免疫組化法和Western blot法檢測海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比，模型組Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2/Bax明顯降低(P＜0.05)；與模型組比，黃芪注射液組Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax明顯升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論：黃芪注射液可通過升高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax、Caspase-3的表達(dá)，抑制腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

腦缺血再灌注；黃芪注射液；Bcl-2；Bax；Caspase-3

缺血性腦血管病是神經(jīng)內(nèi)科的常見病，缺血后再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成腦損傷進(jìn)一步加重的主要原因，Bcl-2和Caspase家族在促進(jìn)神經(jīng)元凋亡中起關(guān)鍵作用[1]。本課題組前期研究證實，黃芪注射液可提高原代培養(yǎng)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，從而抑制海馬神經(jīng)元凋亡[2]。但在體情況下，黃芪注射液是否通過以上靶點發(fā)揮抗凋亡作用，尚屬未知。本研究通過觀察黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的影響，探討黃芪注射液發(fā)揮腦保護(hù)作用的具體作用靶點。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑兔抗大鼠Bcl-2多抗、兔抗大鼠Bax單抗、兔抗大鼠Caspase-3單抗、DAB顯色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；黃芪注射液，成都地奧制藥廠。MK3酶標(biāo)儀，上海雷勃公司；DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2實驗動物分組、模型建立及取材SPF級2月齡雄性SD大鼠48只，天津山川紅實驗動物有限公司，合格證號SCXK（津）2009-001。隨機(jī)分為四組（n=12）：假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組、黃芪注射液溶劑組、黃芪注射液組。除假手術(shù)外，其余各組均用四血管阻斷法制備模型[3]：大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，頸背側(cè)正中縱切，電凝針燒灼第一頸椎橫突翼狀孔內(nèi)的椎動脈；頸前縱切，分離雙側(cè)頸總動脈，動脈夾夾閉，0.5h后去除恢復(fù)血流，以翻正反射消失作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)[4]。假手術(shù)組僅行血管分離術(shù)。假手術(shù)組及模型組于造模前0.5h腹腔注射生理鹽水6ml/kg；黃芪注射液組及溶劑組分別用等量黃芪注射液和無菌去離子水代替。各組大鼠均于再灌注后24h取材。

每組隨機(jī)選取6只大鼠，10%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定后取腦，截取視交叉至大腦橫裂的腦組織，10%多聚甲醛后固定24h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。每組剩余的6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，分離海馬，-80℃凍存。

1.3免疫組織化學(xué)SP法檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)取腦組織石蠟切片，采用SP免疫組化法檢測目的蛋白的表達(dá)，分別滴加一抗（Bcl-2 1:500、Bax 1:300、Caspase-3 1:500），以PBS代替一抗做為陰性對照，DAB顯色。采用Mivnt圖像分析系統(tǒng)對陽性結(jié)果行半定量分析：每只大鼠隨機(jī)抽取5張切片，每張切片在高倍鏡下（×400）選取海馬CA1區(qū)3個非連續(xù)視野，每個視野計算陽性產(chǎn)物面積占總視野面積的比值，取平均值。

1.4Western blot法檢測海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)稱取海馬組織提取總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取25μg樣品，95℃加熱變性，12% SDS-PAGE電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%奶粉液封閉2h，加入Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗（稀釋倍數(shù)同SP法），4℃過夜。加入二抗（1：5000），孵育1h后，用化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin為內(nèi)參。膠片經(jīng)掃描后，用Quantity One 軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析，計算目的蛋白條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為各目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間計量資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

與假手術(shù)組比，模型組大鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高，Bcl-2/Bax明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，黃芪注射液組大鼠海馬Bcl-2蛋白的表達(dá)、Bcl-2/Bax明顯升高，Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。見附表：

附表　黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響（，n=6）

附表　黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響（，n=6）

與假手術(shù)組相比：△P＜0.05；與模型組比：*P＜0.05

假手術(shù)組　模型組　溶劑對照組 黃芪注射液組免疫組化染色Bcl-2　0.380±0.062 0.521±0.090△0.542±0.084 0.597±0.791*Bax　0.446±0.078 0.798±0.046△0.804±0.048 0.695±0.037*Bcl-2/Bax　0.863±0.036 0.662±0.047△0.685±0.039 0.846±0.052*Caspase-3 0.339±0.049 0.659±0.031△0.651±0.057 0.542±0.061*Western blot法Bcl-2　0.382±0.061 0.542±0.052△0.558±0.030 0.601±0.046*Bax　0.402±0.042 0.795±0.061△0.808±0.054 0.709±0.033*Bcl-2/Bax　0.935±0.041 0.662±0.035△0.683±0.047 0.844±0.038*Caspase-3 0.435±0.049 0.788±0.032△0.791±0.045 0.577±0.031*

3　討論

腦缺血再灌注損傷過程中細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致缺血性腦血管病死亡率增高的主要原因。Bcl-2家族是線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的調(diào)控基因，家族成員間的相互作用在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中起重要作用?？沟蛲龀蓡T的代表Bcl-2主要定位于線粒體膜，促凋亡成員的代表Bax主要位于胞質(zhì)中，正常情況下二者比例恒定，當(dāng)受到凋亡信號刺激后，兩蛋白含量發(fā)生變化，決定細(xì)胞的生命走向[5]。研究表明[6-8]，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，可抑制Bax的作用，起抗凋亡作用，而沉默Bcl-2基因，Bax/Bax同源二聚體增多，Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)程序啟動，發(fā)生細(xì)胞凋亡。

黃芪注射液中含皂苷、多糖、氨基酸等多種有效成分，生理活性多樣，研究發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)血管、抗自由基損傷以及抑制神經(jīng)元凋亡等多種藥理作用[9]。

本研究采用四血管阻斷法建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高，但Bcl-2 /Bax比值明顯下降；與模型組相比，黃芪注射液組Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低。本研究結(jié)果提示，海馬神經(jīng)元在缺血再灌注刺激后，凋亡信號開始啟動，Bcl-2、Bax均升高，但Bax占據(jù)優(yōu)勢，因而有利于在線粒體膜上形成通透性孔道，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡執(zhí)行蛋白酶Caspase-3活化，發(fā)生細(xì)胞凋亡[10]。黃芪注射液可通過提高Bcl-2的表達(dá)、降低Bax表達(dá)，進(jìn)而使Bcl-2/Bax比值升高，阻止Bax孔道形成，使細(xì)胞免于凋亡。因此推測，黃芪注射液可能是以Bcl-2、Bax為靶點進(jìn)而抑制Caspase-3表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用。

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EFFECTS OF ASTRAGALUS INJECTION ON BCL-2, BAX AND CASPASE-3 EXPRESSION IN HIPPOCAMPUS OF CEREBRAL ISCHEMIA REPERFUSION RATS

DONG Ya-jie, GAO Wei-juan, LU Kai-feng, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective∶ To investigate the effects of astragalus injection on Βcl-2, Βax and Caspase-3 expression in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats. Methods: Male SD rats were randomly divided into sham-operation group, cerebral ischemia reperfusion model group, astragalus injection solvent group and astragalus injection group. Four-vessel occlusion was used to establish cerebral ischemia reperfusion rats’ model. Immunohistochemical stain and Western blot was used to detect Βcl-2, Βax and Caspase-3 expression in hippocampus. Results: Compared with sham-operation group, Βcl-2, Βax and Caspase-3 expression of rats in model group increased obviously, but Βcl-2/Βax decreased obviously (P＜0.05). Compared with model group, Βcl-2 and Βcl-2/Βax of rats in astragalus injection group increased obviously, but Βax and Caspased-3 decreased obviously (P＜0.05). Conclusions: Astragalus injection can inhibit neuronal apoptosis in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats by up regulating Βcl-2 expression and down regulating Βax, Caspase-3 expression.

Cerebral ischemia reperfusion; Astragalus injection; Βcl-2; Βax; Caspase-3

R285.5

A

1004-6879（2016）06-0453-03

* 河北省科技支撐計劃項目（13272504D），河北省教育廳青年基金項目（Q2012002），河北省高校重點學(xué)科建設(shè)項目資助（冀教高【2013】4號病理學(xué)與病理生理學(xué)）

△

（2016-05-13）