脂肪源性干細(xì)胞對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的影響*

付秀美，王榮良，楊海艷，楊振江，付文亮（.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德　067000；.承德市婦幼保健院；.承德市中醫(yī)院）

脂肪源性干細(xì)胞對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的影響*

付秀美1，王榮良2，楊海艷3，楊振江1，付文亮1
（1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德067000；2.承德市婦幼保健院；3.承德市中醫(yī)院）

目的:探討脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法：將第4代ADSCs移植入脫細(xì)胞神經(jīng)移植物（ANA）中，構(gòu)建組織工程神經(jīng)。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、培養(yǎng)基組和實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)基組和實(shí)驗(yàn)組均建立坐骨神經(jīng)損傷模型，然后用相應(yīng)的組織工程神經(jīng)橋接損傷神經(jīng)的斷端。術(shù)后6W和12W采用神經(jīng)電生理記錄儀檢測(cè)各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅。結(jié)果：術(shù)后6W、12W，實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅明顯高于培養(yǎng)基組（P＜0.05），但低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；并且，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12W時(shí)的神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅明顯高于術(shù)后6W（P＜0.05）。結(jié)論：ADSCs可增加坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅，促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)。

脂肪源性干細(xì)胞；大鼠；坐骨神經(jīng)；神經(jīng)傳導(dǎo)速度；波幅

目前，周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率呈逐年增高的趨勢(shì)，自體神經(jīng)移植仍是臨床上修復(fù)神經(jīng)缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在供體選擇受限、供區(qū)失神經(jīng)支配及痛性神經(jīng)瘤等并發(fā)癥[1]。組織工程學(xué)的發(fā)展為治療周圍神經(jīng)缺損提供了新策略。脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是從成體脂肪組織中分離的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有來(lái)源廣泛、取材方便、干細(xì)胞含量高、體外可迅速擴(kuò)增的特點(diǎn)[2]。本課題組前期制備了脫細(xì)胞神經(jīng)移植物（acellular nerve allografts，ANA），且證明ANA可作為神經(jīng)移植中的橋接支架[3]。本研究以ADSCs為種子細(xì)胞、ANA為支架構(gòu)建組織工程神經(jīng)，橋接損傷的坐骨神經(jīng)，通過(guò)檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅的變化，探討ADSCs對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料I型膠原酶、0.25%胰酶-EDTA（Invitrogen），DMEM/F12培養(yǎng)基（Genview），胎牛血清（BI），脫氧膽酸鈉、Triton X-100（Sigma）。雄性Wistar大鼠（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，合格證號(hào)：SYXK Liao 2013-0001），體質(zhì)量200-250g。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組取18只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、培養(yǎng)基組（ANA內(nèi)單純注射培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（ANA內(nèi)注射ADSCs懸液）（每組6只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只）。培養(yǎng)基組和實(shí)驗(yàn)組均建立坐骨神經(jīng)損傷模型，后用相應(yīng)的組織工程神經(jīng)橋接于損傷神經(jīng)的兩斷端。

1.3制備ANA另取9只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，長(zhǎng)約15mm；坐骨神經(jīng)蒸餾水浸浴12h；4.0%T riton X-100消化12h；蒸餾水漂洗3h；3%脫氧膽酸鈉搖床振蕩12h（100次/min）；蒸餾水漂洗后置于含有抗生素的PBS中備用。

1.4ADSCs的分離、培養(yǎng)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量80-100g。無(wú)菌條件下切取附睪旁脂肪組織、剪碎；0.1% I型膠原酶37℃消化45-60min；過(guò)濾后加入等量含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1200rpm離心15min；重新懸浮細(xì)胞、過(guò)濾、離心，再次重懸細(xì)胞；最后用含有FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%C O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2d后第一次換液，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2-3d換液一次。待貼壁細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)，消化后按1：2傳代培養(yǎng)。

1.5檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅術(shù)后6W和12W采用神經(jīng)電生理記錄儀檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅。刺激強(qiáng)度為1-20mA、時(shí)間為0.1-0.2ms、頻率為lHz。記錄方法：大鼠麻醉，切斷梨狀肌，充分暴露坐骨神經(jīng)近端，向下至腓總神經(jīng)入肌點(diǎn)處。將鉤形銀針電極分別置于橋接支架的近端和遠(yuǎn)端，近端刺激，遠(yuǎn)端記錄，應(yīng)用精度0.2mm的游標(biāo)卡尺測(cè)量?jī)呻姌O間的距離，測(cè)定神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅。

2　結(jié)果

2.1ADSCs的分離培養(yǎng)原代ADSCs接種4-6h開(kāi)始貼壁，24h后大多數(shù)細(xì)胞均已貼壁生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞為短梭形、多邊形（附圖A）。1W后，鏡下可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)且細(xì)胞排列有一定方向性，呈簇狀或漩渦狀（附圖B）。

附圖　ADSCs 的原代培養(yǎng)

2.2坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅術(shù)后6W，實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅明顯高于培養(yǎng)基組（P＜0.05），但明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01）。術(shù)后12W的變化趨勢(shì)同術(shù)后6W；且實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12W時(shí)的神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅明顯高于術(shù)后6W（P＜0.05）。見(jiàn)附表：

附表　各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅（，n=3）

附表　各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅（，n=3）

與實(shí)驗(yàn)組比較：aP＜0.01，bP＜0.05；與本組6W比較：cP＜0.05

對(duì)照組　神經(jīng)傳導(dǎo)速度　波幅6W　12W　6W　12W正常對(duì)照組　10.00±0.00a　10.00±0.00a　9.48±0.54a　9.51±0.52a培養(yǎng)基組　2.95±0.66b　3.15±0.83b　2.07±0.57b　2.17±0.48b實(shí)驗(yàn)組　4.04±0.74　4.66±0.93c　3.16±0.36　3.63±0.59c

3　討論

周圍神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)一直是臨床外科的難題，較小的神經(jīng)缺損可作端-端縫合，較大的缺損則需用移植物代替橋接。但后者存在很多弊端，如需進(jìn)行多次手術(shù)、供體部位失神經(jīng)支配及神經(jīng)瘤形成等[4]。目前，神經(jīng)組織工程學(xué)發(fā)展為治療周圍神經(jīng)損傷提供了新的方法。理想的移植細(xì)胞應(yīng)該具有取材容易、體外擴(kuò)增迅速以及低免疫源性并能成功與宿主融合。ADSCs來(lái)源于成體脂肪組織，具有取材方便、損傷小、干細(xì)胞獲得量大、適合自體移植且易于被患者接受等特點(diǎn)[5]。因此，ADSCs在細(xì)胞移植和組織工程等領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)越性。本研究中的ADSCs取自于大鼠附睪旁脂肪組織，該部位ADSCs的生長(zhǎng)速度較大鼠頸后、腹股溝、背部、大網(wǎng)膜及腎周等部位快，同時(shí)由于表面覆有包膜，污染幾率小，純度較高，是獲取ADSCs的較好部位[6]。

神經(jīng)的生物電傳導(dǎo)是周圍神經(jīng)的基本功能。周圍神經(jīng)離斷后導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能喪失，神經(jīng)再生后傳導(dǎo)功能逐步恢復(fù)。有研究提示，神經(jīng)傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅的增加可反應(yīng)再生神經(jīng)纖維數(shù)目的增多，因此神經(jīng)傳導(dǎo)功能可作為判斷神經(jīng)損傷和再生的一項(xiàng)可靠指標(biāo)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與培養(yǎng)基組比較，實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯增加、動(dòng)作電位波幅明顯增大，說(shuō)明加用ADSCs的實(shí)驗(yàn)組大鼠坐骨神經(jīng)再生情況明顯優(yōu)于培養(yǎng)基組。并且，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后12W神經(jīng)電生理參數(shù)的改善效果明顯優(yōu)于術(shù)后6W，提示隨時(shí)間的延長(zhǎng)效果明顯增強(qiáng)。但關(guān)于實(shí)驗(yàn)組ADSCs促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的作用機(jī)制，是否來(lái)源于移植細(xì)胞所分泌的相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有待進(jìn)一步的研究。

[1]Βoecker AH, van Neerven SG, Scheffel J, et al. Pre-differentiation of mesenchymal stromal cells in combination with a microstructured nerve guide supports peripheral nerve regeneration in the rat sciatic nerve model[J]. Eur J Neurosci, 2016, 43(3)∶ 404-416.

[2]Fu X, Tong Z, Li Q, et al. Induction of adipose-derived stem cells into Schwann-like cells and observation of Schwann-like cell proliferation[J]. Mol Med Rep, 2016, 14(2)∶1187-1193.

[3]佟曉杰，張彩順，曹德壽，等.脫細(xì)胞異體神經(jīng)移植物橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損促進(jìn)神經(jīng)-肌接頭結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[J].解剖學(xué)報(bào)，2005，36（1）：1-5.

[4]Liu G, Cheng Y, Guo S, et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair[J].Int J Mol Med, 2011,28 (4)∶565-572.

[5]Βoeloni JN, Ocarino NM, Serakides R. Comparative study of osteogenic differentiation potential of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and adipose tissue of osteoporotic female rats[J]. Connect Tissue Res, 2014, 55(2)∶ 103-114.

[6]Razavi S, Mardani M, Kazemi M, et al. Effect of leukemia inhibitory factor on the myelinogenic ability of Schwann-like cells induced from human adipose-derived stem cells[J]. Cell Mol Neurobiol, 2013, 33(2)∶ 283-289.

[7]Mekaj AY, Morina AA, Manxhuka-Kerliu S, et al. Electrophysiological and functional evaluation of peroneal nerve regeneration in rabbit following topical hyaluronic acid or tacrolimus application after nerve repair[J]. Niger Postgrad Med J, 2015, 22(3)∶ 179-184.

EFFECTS OF ADIPOSE DERIVED STEM CELLS ON FUNCTIONAL RECOVERY OF SCIATIC NERVEIN RATS

FU Xiu-mei, WANG Rong-liang, YANG Hai-yan, et al
(Department of Human Anatomy, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of adipose derived stem cells (ADSCs) on functional recovery of sciatic nerve in rats. Methods: The 4thgeneration ADSCs were transplanted into the acellular nerve allograft (ANA) to construct the tissue engineering nerves. The rats were randomly divided into normal control group, culture medium group and experimental group. The rats in culture medium group and experimental group were established sciatic nerve injury model, then corresponding tissue engineering nerves were used to bridge the injuried sciatic nerves. 6 and 12 weeks after operation, the sciatic nerve conduction velocity and amplitude were detected by nerve electrophysiology recorder. Results: The sciatic nerve conduction velocity and amplitude of rats in experimental group 6 weeks and 12 weeks after operation were obviously higher than culture medium group (P＜0.05), but obviously lower than normal control group (P＜0.01); Moreover, the sciatic nerve conduction velocity and amplitude of rats in experimental group 12 weeks after operation were obviously higher than that of rats 6 weeks after operation (P＜0.05). Conclusion: ADSCs can increase the sciatic nerve conduction velocity and amplitude, so they could promote recovery of sciatic nerve function.

Adipose derived stem cells (ADSCs); Rat; Sciatic nerve; Nerve conduction velocity; Amplitude

R322.85

A

1004-6879（2016）06-0451-03

*河北省教育廳基金項(xiàng)目（QN2014138），河北省重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項(xiàng)目資助

（2016-03-31）