響應(yīng)面法優(yōu)化章魚內(nèi)臟酸性蛋白酶提取條件

黃惠莉, 張秀娟, 張育榮, 張鷺鷹, 王開明

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021;2. 華僑大學(xué) 環(huán)境與資源技術(shù)研究所， 福建 廈門 361021；3. 廈門東海洋水產(chǎn)品進出口有限公司, 福建 廈門 361012)

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響應(yīng)面法優(yōu)化章魚內(nèi)臟酸性蛋白酶提取條件

黃惠莉1,2, 張秀娟1, 張育榮3, 張鷺鷹3, 王開明3

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021;2. 華僑大學(xué) 環(huán)境與資源技術(shù)研究所， 福建 廈門 361021；3. 廈門東海洋水產(chǎn)品進出口有限公司, 福建 廈門 361012)

首先，以章魚內(nèi)臟為原料，通過單因素實驗，分析pH值、溫度、料液比、抽提時間對提取粗酶液中酸性蛋白酶活性的影響.然后，通過響應(yīng)面法優(yōu)化，得到多項式擬合回歸方程，并對酶活的預(yù)測值和實測值進行驗證.最后，測定粗酶液中蛋白酶的種類和活性.結(jié)果表明：酸性蛋白酶的最優(yōu)抽提條件為pH值5.0、溫度30 ℃、時間2.5 h、料液比1∶5，由此得到的粗酶液酶活為917.2 nkat·g-1，對應(yīng)比活為28.5 nkat·mg-1；響應(yīng)面回歸方程計算的預(yù)測值與實際值位于誤差范圍內(nèi)，說明該方程具有預(yù)測作用；粗酶液中，蛋白酶大部分為酸性蛋白酶，占總蛋白酶76.0%.

章魚內(nèi)臟； 響應(yīng)面優(yōu)化； 酸性蛋白酶; 酶活； 比活

章魚(Octopusvulgaris)屬于軟體動物門、頭足綱、八腕目、蛸科、蛸屬，俗稱“八爪魚”，大部分為淺海性種類，也有少數(shù)深海性種類[1].在食品加工中，占章魚總質(zhì)量50%的內(nèi)臟表皮眼窩等部位被丟棄，既浪費又污染環(huán)境.近年來，對水產(chǎn)下腳料的再利用主要集中在酶解制備氨基酸及多肽[2-3]、膜法提取章魚胺等非蛋白質(zhì)含氮類化合物[4]、酶制劑提取[5-6]等方面.在制備酶制劑方面，已成功從南極磷蝦中提取胰蛋白酶[7]、大鯢胃中提取胃蛋白酶[8]、淡水魚內(nèi)臟中提取復(fù)合酶[9].在酶的提取方面，水、稀酸、稀鹽、稀堿、有機溶劑均可作為抽提液.考慮到酸性蛋白酶的溶解性和pH值的穩(wěn)定性，本文以章魚內(nèi)臟為原料，采用緩沖液進行抽提，以酸性蛋白酶活高低為指標(biāo)，結(jié)合響應(yīng)面法[10]，研究從章魚內(nèi)臟中提取酸性蛋白酶的適宜條件，以獲取更多的酸性蛋白酶.

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

章魚內(nèi)臟由廈門東海洋水產(chǎn)品進出口有限公司提供.由前期實驗測定可知，章魚盲腸無酸性蛋白酶活性.原料預(yù)處理方法：將章魚內(nèi)臟摘除盲腸后，打碎勻漿，于-20 ℃保存?zhèn)溆?

實驗試劑：牛血清蛋白(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；干酪素(上海三浦化工有限公司)；檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉(廣東省西隴化工股份有限公司)；福林試劑(北京索萊寶科技有限公司).

儀器：ME204型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TGL-20M型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；VIS-7220型可見光分光光度計(北京瑞科分析儀器公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；SXT-02型索氏提取器(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)；pH 700型臺式pH計(美國優(yōu)特公司)；HJ-4A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠).

1.2 實驗方法

1.2.1 章魚內(nèi)臟組分測定 章魚內(nèi)臟基本成分(水分、灰分、蛋白質(zhì)和脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù))的測定分別參照文獻[11-14].

1.2.2 粗酶液制備 稱取章魚內(nèi)臟勻漿與檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液按照一定的比例混合，適宜溫度下抽提一定時間.于10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下，離心10 min，得到的上清液即為粗酶液.取上清液進行酸性蛋白酶的酶活測定，蛋白酶活性測定采用分光光度法[15].

1.2.3 單因素實驗 分別測定不同緩沖液pH值、溫度、料液比和抽提時間對粗酶液中酸性蛋白酶抽

提效果的影響.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取酶活為響應(yīng)值(Y)，緩沖液pH值、溫度(θ)、抽提時間(t)、料液比為自變量，進行Box-Behnken響應(yīng)面實驗[16].其實驗水平編碼值，如表1所示.表1中：+1，0，-1分別代表四因素的高、中、低水平.

1.2.5 粗酶液中蛋白酶種類及活性分析 為了驗證粗酶液中酸性蛋白酶的含量，分別測定粗酶液中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活和比活.其中，酸性蛋白酶酶活測定采用pH值為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液體系；中性蛋白酶酶活測定采用pH值為7.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液體系；堿性蛋白酶酶活測定采用pH值為10.0的碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液體系.

2 結(jié)果與分析

2.1 章魚內(nèi)臟基本成分

對章魚內(nèi)臟組分進行分析，測得各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如下：水分為75.8%，灰分為2.6%，蛋白質(zhì)為16.0%，脂肪為2.6%，其他為3.0%.由此可知，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅次于水分,說明章魚內(nèi)臟可作為提取蛋白酶等含氮類物質(zhì)的原料.

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 pH值對粗酶液酶活影響 pH值是酶促反應(yīng)的重要決定因素，酸性蛋白酶的最適pH值為2～6左右.在4 ℃，料液比為1∶5條件下,將一定量的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入章魚勻漿中，抽提4 h.控制pH值為2.2～7.0，測定40 ℃時，粗酶液的酸性蛋白酶酶活(z)，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：當(dāng)pH值為2.2～5.0時，粗酶液中酸性蛋白酶活逐漸升高，這是因為隨著pH值的升高，酸性蛋白酶溶解度增大；當(dāng)pH值為5.0～7.0時，酶活有所降低，這是由于pH值繼續(xù)增大至中性，使酸性蛋白酶的溶解度降低，酶活損失較大.因此，選擇浸提粗酶液的最佳pH值為5.0.

圖1 pH對粗酶液酸性蛋白酶酶活的影響 圖2 溫度對粗酶液酶活的影響Fig.1 Effect of pH on activity of acid Fig.2 Effect of temperature on activity of protease in crude enzyme solution acid protease in crude enzyme solution

2.2.2 溫度對粗酶液酶活影響 在pH值為5.0、料液比為1∶5、抽提時間為4 h的條件下，研究溫度(θ)對粗酶液中酸性蛋白酶酶活(z)的影響，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知：當(dāng)溫度為4～30 ℃時，酶活變化不大；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，酶活急劇下降，這是因為高溫導(dǎo)致部分酶變性失活.由于低溫條件較難操控，且需額外消耗能源，因此，選取最佳溫度條件為30 ℃.

2.2.3 料液比對粗酶液酶活影響 在30 ℃，pH值為5.0，抽提時間為4 h的條件下，研究不同料液比對粗酶液酶活的影響，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知：隨著緩沖液比例的增加，粗酶液酶活逐漸升高，當(dāng)料液比為1∶5時，酸性蛋白酶活性達到最大；而后繼續(xù)增加緩沖液用量，酶活波動不大.這主要是因為相同質(zhì)量的內(nèi)臟中，酸性蛋白酶的含量是一定的，緩沖液越多，提取就越充分.然而，過多的緩沖液會增加后續(xù)濃縮過程的工作量.因此，選取最佳的料液比為1∶5.

2.2.4 抽提時間對粗酶液酶活影響 在30 ℃,pH值5.0,料液比為1∶5的條件下，研究不同抽提時間(t)對粗酶液酶活的影響，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知：隨著抽提時間的增加，內(nèi)臟勻漿與緩沖液接觸越充分，酸性蛋白酶酶活越高；當(dāng)抽提時間為2.5 h時，酶活達到最高點，而后短時間內(nèi)保持穩(wěn)定；繼續(xù)增加抽提時間至4 h以上，酶活稍有下降，這是由于此時的粗酶液為液態(tài)，長時間放置會使酶活有少量的損失.因此，選取最佳提取時間為2.5 h.

圖3 料液比對粗酶液酶活的影響 圖4 時間對粗酶液酶活的影響 Fig.3 Effect of liquid ratio on activity of Fig.4 Effect of time on activity of acid acid protease in crude enzyme solution protease in crude enzyme solution

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計29組實驗，經(jīng)過實測后得到的結(jié)果，如表2所示.表2中：θ為溫度；t為抽提時間；z為粗酶液中酸性蛋白酶的酶活.

對表2的數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，經(jīng)優(yōu)化后得到以酶活(Y)為因變量，以pH值(A)、溫度(B)、時間(C)、料液比(D)為自變量的回歸方程,即

(1)

對響應(yīng)面回歸方程(1)進行系數(shù)顯著性檢驗和方差分析，結(jié)果如表3,4所示.由表3可知:模型大于F值的概率P<0.000 1，表明模型具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，可信度較高；模型失擬項無統(tǒng)計學(xué)意義，表明若用此模型進行結(jié)果預(yù)測，出現(xiàn)失誤的概率不大；AB，BD，CD，A2，B2，D2的P值均小于0.05，表明其對粗酶液酶活的影響有統(tǒng)計學(xué)意義.根據(jù)模型線性數(shù)值的大小，可以得出影響粗酶液酶活的因素大小依次為pH值>抽提時間>溫度>料液比.

表2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

表3 響應(yīng)回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

表4 響應(yīng)面回歸方程的方差分析

由表4可知：模型相關(guān)系數(shù)為0.913 2，說明該模型能夠解釋91.32%的總變異；模型確定系數(shù)越大，表示模型預(yù)測值與實際值之間的擬合越好，該模型的確定系數(shù)為0.826 3(大于0.80)，表明模型是顯著的；R2預(yù)測為0.529 9，表明模型是顯著的;變異系數(shù)越小，表示模型精度和可靠性越高，該模型變異系數(shù)為5.88%，說明模型是高度可靠的.

為了更直觀地檢測模型并確定最優(yōu)點，兩兩因素之間互相作用的曲面圖，如圖5所示.

(a) 溫度與pH值 (b) 時間與pH值

(c) 料液比與pH值 (d) 時間與溫度

(e) 料液比與溫度 (f) 料液比與時間圖5 兩兩因素間的交互影響Fig.5 Interaction diagram between two factors

2.4 最優(yōu)方案預(yù)測與驗證

由響應(yīng)面結(jié)果可知，響應(yīng)值Y存在最大值.Y值越大，說明所取的對應(yīng)條件下，酸性蛋白酶酶活越高.響應(yīng)面的理論最優(yōu)方案如下：pH值為4.8，溫度為32.9 ℃，時間為2.8 h，料液比為1∶5.4.由此得到預(yù)測酸性蛋白酶酶活為915.2 nkat·g-1.為了驗證該模型的準(zhǔn)確性，調(diào)整優(yōu)化方案，取pH值5.0，溫度30 ℃，時間2.5 h，料液比1∶5為實驗條件，得到實測酸性蛋白酶酶活為917.2 nkat·g-1.預(yù)測值與實際值在誤差范圍內(nèi)，說明該響應(yīng)面回歸方程具有預(yù)測作用.

表5 粗酶液中蛋白酶種類分析

2.5 蛋白酶種類及活性的分析

采用優(yōu)化條件(pH值5.0，溫度30 ℃，抽提時間2.5 h，料液比1∶5)，對章魚內(nèi)臟勻漿進行提取，于10 000 r·min-1離心后得到粗酶液.對粗酶液進行酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活和比活測定，結(jié)果如表5所示.表5中：z為酶活;u為比活;η為比活百分比.由表5可知：酸性蛋白酶活性遠(yuǎn)高于中性及堿性蛋白酶活性，說明經(jīng)最優(yōu)方案提取的粗酶液中大部分是酸性蛋白酶，該方案適合酸性蛋白酶的提取.

3 結(jié)論

以章魚內(nèi)臟為原料，研究pH值、溫度、料液比、抽提時間等因素對提取酸性蛋白酶粗酶液酶活的影響.通過響應(yīng)面法優(yōu)化抽提條件，并經(jīng)冷凍干燥得到酸性蛋白酶粗品.通過上述研究確定了各關(guān)鍵提取參數(shù)，為純化獲得章魚源性純品酸性蛋白酶提供了重要技術(shù)參數(shù)和應(yīng)用參考.

成芳等[8]在大鯢胃中提取得到胃蛋白酶粗液的比活為17.2 nkat·mg-1；仇磊等[17]在扁玉螺食道腺內(nèi)提取得到蛋白酶粗液的比活為24.3 nkat·mg-1；王琨[7]從南極磷蝦體內(nèi)提取得到蛋白酶粗液的比活為0.7 nkat·mg-1.而文中提取的酸性酶酶活為917.2 nkat·g-1，對應(yīng)比活為28.5 nkat·mg-1，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取得到的酸性蛋白酶含量較高.

對粗酶液中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶活性進行分析，結(jié)果可知：酸性蛋白酶活性>中性蛋白酶活性>堿性蛋白酶活性.說明粗酶液中，酸性蛋白酶的含量遠(yuǎn)高于其他種類蛋白酶含量.

文中提取的酸性蛋白酶為復(fù)合酶，需經(jīng)鹽析、層析等操作后，才能對該復(fù)合酶的種類、相對分子質(zhì)量等有進一步了解，從而純化得到純品酸性蛋白酶.

[1] 房元勇.房元勇章魚增殖礁的試驗研究[D].青島：中國海洋大學(xué),2009:1-3.

[2] 于梅，寧杰，樸美子.章魚下腳料酶解工藝優(yōu)化的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2011(6):52-54.

[3] 董寰，廖雪燕，董梅，等.正交試驗設(shè)計提取章魚下腳料中?；撬醄J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010，4(21):166-167.

[4] 張育榮，張鷺勇，張鷺軍，等.利用膜法提取天然章魚胺的工藝探討[J].中國科技信息,2012(8):103.

[5] KTARI N,BKHAIRIA I,JRIDI M,et al.Digestive acid protease from zebra blenny (Salariabasilisca): Characteristics and application in gelatin extraction[J].Food Research International,2014,57(1):218-224.

[6] TANJI M,YAKABE E,KAGEYAMA T,et al.Purification and characterization of pepsinogens from the gastric mucosa of African coelacanth,Latimeriachalumnae, and properties of the major pepsins[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology,2007,146(3):412-420.

[7] 王琨.南極磷蝦胰蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].大連：大連理工大學(xué),2013:12-13.

[8] 成芳，閆欣，李偉，等.大鯢胃蛋白酶分離純化及其性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技,2013，34(1):125-128.

[9] 吳莎.淡水魚內(nèi)臟制備復(fù)合酶的工藝研究[D].武漢：湖北工業(yè)大學(xué),2011:27-29.

[10] 姜太玲，吳紅洋，王微，等.響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶制備花椒籽蛋白抗菌肽的研究[J].食品工業(yè)科技,2014，35(20):226-231.

[11] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定： GB 50093-2010[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012：1-8.

[12] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定： GB 50094-2010[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012：9-12.

[13] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定： GB 50095-2010[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012：13-22.

[14] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定： GBT5009.6-2003[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003：1-8.

[15] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定分光光度法： GBT 28715-2012[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013：1-12.

[16] 肖懷秋，李玉珍，林親錄，等.BoX-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化冷榨花生粕酶解制備花生肽工藝[J].中國糧油學(xué)報,2014，29(10)：106-111.

[17] 仇磊.扁玉螺食道腺蛋白酶定位及提取純化、理化性質(zhì)的初步研究[D].青島：中國海洋大學(xué),2006:25-43.

(責(zé)任編輯： 黃曉楠 英文審校： 劉源崗)

Extraction Condition Optimization of Acid Protease From Octopus Viscera by Response Surface Method

HUANG Huili1,2, ZHANG Xiujuan1, ZHANG Yurong3,ZHANG Luying3, WANG Kaiming3

(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Institute for Environment and Resources Technology, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;3. Xiamen East Ocean Aquatic Products Import and Export Company Limited, Xiamen 361012, China)

To investigate the pH value, temperature, solid-liquid ratio, and extraction time on the acidic protease activity of the crude enzyme solution, the single factor experiment was carried out using octopus viscera as the raw material. The regression was obtained equation by response surface methodology, and the accuracy between predicted and actual values was verified. Finally, the kind and activity of three proteases in the crude enzyme solution were measured. The results showed that the optimum extraction conditions of acid proteases were: pH 5.0, temperature 30 ℃, time 2.5 h, and solid-liquid ratio of 1∶5. Under these conditions, the enzyme activity was 917.2 nkat·g-1, and the specific activity was 28.5 nkat·mg-1. The predicted value and actual value lay within the range of error, which indicated that the regression equation has a predictive role. In addition, most of the total protease, approximately 76.0%, was acidic protease in the crude enzyme solution.

octopus viscera； response surface optimization； acid protease; enzyme activity; specific activity

10.11830/ISSN.1000-5013.201606011

2015-11-20

黃惠莉(1962-)，女，教授，主要從事海洋水產(chǎn)資源開發(fā)利用的研究.E-mail:hlhuang@hqu.edu.cn.

福建省重點科研資助項目(2013N0022)

Q 55

A

1000-5013(2016)06-0714-06