丙泊酚誘導(dǎo)LPS刺激的樹突細(xì)胞向調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞分化的研究

王桂嶺 劉慶陽 徐凱智

河北省衡水市第四人民醫(yī)院麻醉科 河北衡水 053000；①北京煤炭總醫(yī)院； ②華北理工大學(xué)唐山工人醫(yī)院

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丙泊酚誘導(dǎo)LPS刺激的樹突細(xì)胞向調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞分化的研究

王桂嶺 劉慶陽①徐凱智②

河北省衡水市第四人民醫(yī)院麻醉科 河北衡水 053000；①北京煤炭總醫(yī)院；②華北理工大學(xué)唐山工人醫(yī)院

①目的 探討丙泊酚(Propofol)誘導(dǎo)脂多糖(LPS)刺激的樹突細(xì)胞(DC)向分泌白細(xì)胞介素(IL)-10的樹突細(xì)胞亞群-CD11clowCD45RBhighDC分化。②方法 采用磁珠分選技術(shù)獲得C57BL/6小鼠脾臟樹突細(xì)胞，將提取的DC分為6個組，分別加入同體積的生理鹽水(NS組)，LPS 1μg/mL(L組),LPS 1μg/mL+5μg/mL丙泊酚(P1組)、LPS 1μg/mL+10μg/mL丙泊酚(P2組)、LPS 1μg/mL +20μg/mL丙泊酚(P3組) 后進行培養(yǎng)24小時，分別用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞表面分子CD40、CD80、CD86、I-a/e的表達情況，采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中IL-10的含量。③結(jié)果 與NS組相比，L組DC表面分子CD40、CD80、CD86和I-a/e的表達均明顯增強(P<0.05)，同時IL-10的分泌升高；而與L組相比，較大劑量丙泊酚能顯著降低DC表面分子CD80、CD40和I-a/e的表達并增強CD86的表達及IL-10的分泌(P<0.05)，且一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。④結(jié)論 丙泊酚可能通過介導(dǎo)IL-10的分泌促進DC向CD11clowCD45RBhighDC方向分化從而抑制早期炎癥反應(yīng)。

丙泊酚 樹突細(xì)胞 調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞 免疫抑制

樹突細(xì)胞(Dendritic cell,DC)是一種骨髓來源的淋巴細(xì)胞亞群，是已知體內(nèi)功能最強、惟一能活化靜息T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，是啟動、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，是溝通固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要橋梁細(xì)胞[1,2]。目前有研究證明DC已成為免疫治療的靶點細(xì)胞[3]。調(diào)節(jié)性DC(CD11clowCD45RBhighDC)是DC功能的新代表，其與傳統(tǒng)DC的區(qū)別在于低表達CD11c和共刺激分子CD80、CD86和MHC-II類分子，高表達CD45RB，激活后分泌高水平的白細(xì)胞介素(IL)-10[4]，從而抑制過度炎癥反應(yīng)實現(xiàn)負(fù)向免疫調(diào)控，是一種新發(fā)現(xiàn)的具有負(fù)向免疫功能的不成熟樹突細(xì)胞亞群。膿毒癥(sepsis)是目前ICU病房及術(shù)后并發(fā)癥引起患者死亡的主要原因之一，有研究證實膿毒癥與免疫功能紊亂有關(guān)[5]。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌細(xì)胞外膜的重要組成成分，是引起全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systermic inflammatory response syndrome,SIRS)或者膿毒癥等疾病的主要啟動因子[6]。丙泊酚(2,6-二異丙基苯酚)是一種靜脈注射短效麻醉劑，在麻醉誘導(dǎo)、維持以及鎮(zhèn)靜方面廣泛應(yīng)用。近年來發(fā)現(xiàn)丙泊酚除了麻醉效應(yīng)之外還具有許多非麻醉作用[7]，其中包括免疫調(diào)節(jié)作用。但是其具體的免疫調(diào)節(jié)機制尚不清楚。本實驗體外用LPS刺激細(xì)胞模擬膿毒癥機體模型，通過對比觀察，擬從樹突細(xì)胞亞群分化角度探索丙泊酚的免疫調(diào)節(jié)作用，從而為臨床進一步應(yīng)用丙泊酚提供充分的理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膠原酶D購自于美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)液(包含羥乙基哌嗪乙磺酸，谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素)，磷酸鹽緩沖液(PBS)和滅活的胎牛血清均購自于中國北京索來寶生物科技有限公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自于挪威Axis-shield公司；Fc阻斷劑：純化Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγIII/II-R抗體)；生物素標(biāo)記的小鼠樹突狀細(xì)胞富集復(fù)合物(Bioinylated Mouse Dendritic Cell Enrichment Cocktail)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠CD80和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠MHC II購自于美國BD生物技術(shù)公司；DC陰選試劑盒購自美國BD公司；小鼠微磁珠購自于德國Miltenyi Biotec GmbH公司；脂多糖(LPS，1μg/mL)購自于美國Sigma公司；丙泊酚注射液(2,6-二異丙酚，200mg/支)購自于北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟單個核細(xì)胞的制備。細(xì)胞室外將小鼠斷頸處死后右側(cè)臥位固定，剪開腹部皮膚留取脾臟置于加有PBS的平皿中， PBS沖洗2次，去除脾臟表面被膜移至220目金屬濾網(wǎng)上，破碎脾臟并用無菌注射器活塞反復(fù)研磨，吸取細(xì)胞液注入離心管，1500r/min離心5分鐘，棄上清，加入適量無菌PBS制成1mL細(xì)胞懸液后，沿著管壁小心加入到含有2mL淋巴細(xì)胞分離液的上層，3000r/min離心15分鐘，去上清吸取中層液裝入另一潔凈離心管，加適量PBS沖洗后1500r/min離心5分鐘，棄上清，加1mL PBS重懸后計數(shù)使細(xì)胞濃度在10×106/mL～20×106/mL進行下游實驗。

1.2.2 磁珠分選獲得脾臟樹突細(xì)胞。將制備好的單個核細(xì)胞懸液，在每1×106個細(xì)胞中加入0.25μg的小鼠Fc阻滯劑純化抗小鼠CD16/CD32單克隆抗體，在冰上孵育15分鐘。添加生物素標(biāo)記的富集小鼠樹突狀細(xì)胞抗體混合物(Bioinylated Mouse Dendritic Cell Enrichment Cocktail)，按照每1×106個細(xì)胞中添加5μL的標(biāo)準(zhǔn)加入相應(yīng)體積，之后將試管放在冰上冰浴15分鐘。冰浴結(jié)束之后向細(xì)胞中加入至少10倍體積的1×BD IMagTM緩沖液，用吸管反復(fù)吹打混勻，對細(xì)胞進行洗滌以便去除過剩的生物素標(biāo)記抗體，之后在4℃、1000r/min離心7分鐘，棄去上清液。再次重懸細(xì)胞，顯微鏡下進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞濃度提高到20×106/mL～80×106/mL，按照每1×106個細(xì)胞添加5μL的標(biāo)準(zhǔn)加入相應(yīng)體積的磁珠，充分混勻之后冷藏30分鐘。把混合細(xì)胞轉(zhuǎn)移到12×75mm的磁珠分選專用圓底試管中，放到磁珠分選儀上(水平位置)，計時6～8分鐘。計時結(jié)束之后，用無菌吸管吸取上清液至新的無菌圓底分選試管中重復(fù)一次實驗，顯微鏡下采用細(xì)胞計數(shù)板進行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.3 IL-10水平的檢測。用含10%胎牛血清RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸DC，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。如果濃度低于1×106/mL，則將細(xì)胞懸液再次離心7分鐘，1500r/min 7分鐘，棄上清并再次重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終濃度達到預(yù)定濃度后接種于96孔板，分別加入等體積的生理鹽水，LPS 1μg/mL，LPS 1μg/mL+丙泊酚5、10、20μg/mL，每組設(shè)3復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱孵育24小時后收集上清液,采用ELISA法測定上清液中IL-10水平。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測DC表面標(biāo)記物表達。將孵育24小時的樹突細(xì)胞，連同孵育液一起加到潔凈離心管中，1500r/min離心5分鐘后棄上清，加入100μL PBS重懸離心后沉淀細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL。加入Fc阻斷劑1μL，4℃孵育15分鐘后分別加入5μL CD11c-APC、CD45RB-PE、CD40-FITC、CD80-FITC、CD86-FITC、I-a/e-FITC，避光孵育15分鐘后，用流式細(xì)胞儀檢測相關(guān)標(biāo)記物。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀對小鼠脾臟DC細(xì)胞亞群鑒定 分別用CD11c-APC和CD45RB-PE抗體對上述分選方法獲得的DC進行標(biāo)染后流式細(xì)胞儀分析鑒定，結(jié)果如下圖1、2所示，樹突狀細(xì)胞被分為CD11chighCD45RBlowDCs(R2)、CD11clowCD45RBlowDCs(R3)和CD11clowCD45RBhighDCs(R4)三群。本次實驗采用磁性分選方法獲得的DC通過流式細(xì)胞儀檢測純度大于85%。

圖1

圖2

圖1表示的是DC流式散點圖，其中縱坐標(biāo)SSC-H代表側(cè)向角，橫坐標(biāo)FSC-H代表前向角；圖2表示以CD11c與CD45RB抗體為標(biāo)志對DC標(biāo)染后進行分群定義的流式細(xì)胞圖。

2.2 IL-10分泌水平的改變 與NS組相比較，L組的IL-10水平明顯升高(P<0.05);與L組相比較，丙泊酚刺激24小時后， P1、P2、P3組IL-10水平均顯著高于L組(P<0.05)，且P3組>P2組>P1組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示IL-10的水平與丙泊酚的濃度呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(r=0.035,P<0.05),見表1。

表1 各組IL-10水平表達變化

2.3 各組DC表面分子及受體分子表達的比較 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與NS組相比較，L組的CD40、CD80、CD86、I-a/e分子的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而丙泊酚各組表面分子表達水平大多有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。與L組相比較，P1組CD40、CD80、CD86、I-a/e分子的表達水平差異不大，而P2、P3組CD40、CD80、CD86、I-a/e分子的表達水平較L組差異顯著，即較大劑量的丙泊酚能顯著上調(diào)DC表面分子CD86的表達(P<0.05)，同時大大減少表面分子CD40、CD80及受體分子I-a/e的表達(P<0.05)，見表2。

表2 各組DC表面蛋白分子表達變化(平均熒光強度，

2.4 各組CD11ChighCD45RBlowDC和CD11ClowCD45RBhighDC比例變化 根據(jù)流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示，與NS組比較，L組CD11chighCD45RBlowDC比例明顯升高(P<0.05),CD11clowCD45RBhighDC比例變化不明顯;而P1、P2和P3組的CD11clowCD45RBhighDC比例明顯升高(P<0.05)。與L組相比較， P2和P3組的CD11clowCD45RBhighDC比例明顯升高(P<0.05)，P3組CD11chighCD45RBlowDC比例明顯降低(P<0.05)。由此可見實驗劑量為20μg/mL的丙泊酚明顯降低了CD11chighCD45RBlowDC的比例(P<0.05),同時升高了CD11clowCD45RBhighDC的比例(P<0.05)，見表3。

表3 各組中CD11chighCD45RBlowDC和CD11clowCD45RBhighDC比例變化

3 討論

丙泊酚除了具有鎮(zhèn)靜、催眠、麻醉作用外還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的特性[7]。膿毒癥通常伴有各臟器的嚴(yán)重?fù)p害，病死率較高，尤其是在危重癥患者中尤為嚴(yán)重。膿毒癥的病因有很多，例如嚴(yán)重的感染、創(chuàng)傷和重大的手術(shù)應(yīng)激等。膿毒癥早期通常表現(xiàn)為無法控制的過度炎癥反應(yīng)，對機體產(chǎn)生嚴(yán)重的損害[8]。DC作為專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞，可以將吞噬細(xì)胞捕獲的抗原呈遞給T細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)[9]，還能夠通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[10，11]。DC雖然是參與固有性免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，卻能夠通過傳遞抗原特異性信號啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)[12]。無論是在固有性免疫應(yīng)答還是適應(yīng)性免疫應(yīng)答中DC都發(fā)揮著不可替代的作用[13]，是二者之間的紐帶和橋梁。臨床研究發(fā)現(xiàn)死于膿毒癥的患者體內(nèi)DC的數(shù)量明顯低于非膿毒癥患者[14]。此外，膿毒癥患者外周血中DC表面分子如MHC II類分子表達下降，同時分泌的IL-12也相應(yīng)下降[15]。可見DC的數(shù)量和免疫功能與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有重要聯(lián)系。因此，明確丙泊酚對DC的影響對危重患者尤其是膿毒癥患者合理應(yīng)用丙泊酚具有重要的參照意義。

LSP是革蘭陰性菌的主要成分，是膿毒癥和感染性休克的主要原因,其作用跨度較寬，從促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生到引發(fā)機體急性損傷性反應(yīng)。本實驗體外用一定濃度的LPS刺激DC觀察其亞型比例及IL-10分泌量的變化，以探討丙泊酚能否通過提高調(diào)節(jié)性DC的比例從而抑制膿毒癥早期炎癥反應(yīng)。從誘導(dǎo)DC向調(diào)節(jié)性DC分化角度闡述丙泊酚發(fā)揮免疫抑制的可能機制，實驗結(jié)果顯示丙泊酚對DC的分化和免疫功能存在影響，表現(xiàn)為抗炎作用，可以輔助免疫負(fù)向調(diào)節(jié)劑作用于膿毒癥早期以對抗機體過度炎癥反應(yīng)：一方面通過下調(diào)細(xì)胞表面CD40、CD80和I-a/e分子的表達在一定程度刺激小鼠脾CD11clowCD45RBhighDC活化；另一方面增強DC分泌IL-10的能力。孔圓等[16]研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞活化既需要TCR識別DC表面的MHC-II分子提供第一信號，又需要T淋巴細(xì)胞的CD28與DC表面的相應(yīng)配基分子CD80、CD86相結(jié)合發(fā)出的第二信號。本實驗中可以得出丙泊酚能誘導(dǎo)DC細(xì)胞向CD11clowCD45RBhighDC方向轉(zhuǎn)化，低水平表達的CD80和MHC-II使細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)被中斷，T細(xì)胞不能充分被激活，從而誘導(dǎo)免疫抑制。但我們不能夠斷定丙泊酚的這種抗炎作用是否對機體有利，還需要添加體內(nèi)實驗進行深入探討其確切的作用機制。

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(2016-03-11 收稿)(張愛國 編輯)

The effect of propofol induced by LPS stimulation differentiation of dendritic cells to regulatory dendritic cells

WANGGuiling,LIUQingyang,XUKaizhi

(TangshanGongrenHospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To explore the possibility of propofol on promoting DC to CD11clowCD45RBhighDC subsets which produce IL-10.Methods Purification of splenic DCs cells in C57BL/6 mice were administrated by magnetic beads sorting.Then,these splenic DCs cells were divided into six groups:the NS group，LPS 1μg/mL(L group),LPS 1μg/mL+Propofol 5μg/mL (P1 group)、LPS 1μg/mL+Propofol 10μg/mL(P2 group)、LPS1μg/mL+Propofol 20μg/mL(P3 group).Cultured after 24 hours,flow cytometry was used to determine expressions of DC surface molecules including CD40,CD80,CD86,I-a/e in six groups.IL-10 levels in DC culture supernatants were determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA).Results Compared with the results of the NS group,the expression of CD40,CD80,CD86,I-a/e as well as IL-10 secretion level was increased in the L group.Compared with the results of the L group,propofol could markedly decrease the expression of CD80、CD40 and I-a/e while enhancing the expression of CD86 as well as IL-10 secretion level.Besides,the enhancement of IL-10 secretion level hinges upon the rise of propofol concentration.Conclusion Propofol can inhibit the early inflammatory response by promoting DC to CD11clowCD45RBhighDCs differentiation and adjusting the secretion of IL- 10.

Propofol.Dendritic cells.Regulatory dendritic cells.Immunity

國家自然科學(xué)基金面上項目(編號：81272140)。

王桂嶺(1987-)，女，碩士研究生，住院醫(yī)師。研究方向：膿毒癥免疫與器官保護 。

徐凱智。

R614.1 R392.5

A

2095-2694(2016)05-341-05