欖綠粗葉木粗多糖提取工藝及對(duì)H22肝癌細(xì)胞毒性影響

梁青龍，郭婷婷，溫?fù)P敏

泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建泉州 362011

欖綠粗葉木粗多糖提取工藝及對(duì)H22肝癌細(xì)胞毒性影響

梁青龍，郭婷婷，溫?fù)P敏

泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建泉州 362011

目的 研究欖綠粗葉木多糖提取工藝優(yōu)化及對(duì)H22肝癌細(xì)胞增殖抑制效果。方法 2016年2—5月從福建寧化泥坑村采集欖綠粗葉木粗，在單因素分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化欖綠粗葉木粗多糖提取工藝。并采用MTT法測(cè)定欖綠粗葉木粗多糖對(duì)H22肝癌細(xì)胞增殖抑制效果。 結(jié)果 影響欖綠粗葉木粗多糖提取的首要因素是固液比，其次是水浴時(shí)間和溫度。粗多糖最佳提取條件為：溫度70℃、時(shí)間12 h、固液比為1∶15 (A2B2C3)。粗多糖對(duì)H22肝癌細(xì)胞具有一定增殖抑制活性，抑制效果隨粗多糖濃度增大而增加。 結(jié)論 水提醇沉淀法欖綠粗葉木多糖提取有效方法，欖綠粗葉木多糖具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。

粗多糖；提取工藝；正交試驗(yàn)；肝癌

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

欖綠粗葉木由福建寧化泥坑村采擷，經(jīng)過泉州林業(yè)局林彥云先生鑒定；氯仿、無水乙醇、硫酸和正丁醇等蒽酮和葡萄糖，肝癌細(xì)胞株、胎牛血清、培養(yǎng)基、MTT試劑盒等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對(duì)粗多糖提取率的影響 將欖綠粗葉木根用刀切成長約2～3 cm，寬約0.5～1 cm小塊。稱取50 g，放入1 000 mL三角瓶，再加入固液比(g/mL)為1∶10去離子水。分別放到40、50、60、70、80℃的水浴鍋中水浴8 h后，用定性濾紙對(duì)上清液進(jìn)行過濾，濾液再用Sevag法除去蛋白后，用終濃度為80%乙醇溶解，4℃過夜沉淀。冷凍干燥得到粗多糖粉末，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.2.2 固液比對(duì)粗多糖提取率的影響 稱取欖綠粗葉木根50 g，分別加入固液比(g/mL)為1:4、1:8、1:12、1: 16、1:20去離子水。于50℃水浴鍋中水浴8 h，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。粗多糖提取同1.2.1。

1.2.3 時(shí)間對(duì)粗多糖提取率的影響 稱取欖綠粗葉木根50 g，分別加入固液比(g/mL)為1:12去離子水。于50℃水浴鍋中水浴3、6、12、24、36 h，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。粗多糖提取同1.2.1。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化粗多糖提取工藝 采用L9(34)正交進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3.5 粗多糖測(cè)定 粗多糖含量的測(cè)定應(yīng)用蒽酮比色法[5]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.5934x+0.4321，R2=0.9997。粗多糖提取率(%)=（粗多糖質(zhì)量/根質(zhì)量）×100%。

1.3.6 欖綠粗葉木粗多糖對(duì)H22肝癌細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) H22肝癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分裝于96孔板，每孔100 μL調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約為6 000個(gè)細(xì)胞每孔。每孔分別加入終濃度為0（空白對(duì)照組）、0.5，1.0、2.0、4.0 mg/mL的粗多糖。于5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)24、48、72 h后，采用MTT法分別測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)粗多糖提取率的影響

隨著溫度增加，欖綠粗葉木粗多糖提取率增大（見圖1）。當(dāng)溫度達(dá)到60℃以上時(shí)，粗多糖提取率趨于穩(wěn)定。與溫度為30℃比較，在60、70、80℃條件下粗多糖提取率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而60、70、80℃條件下，各組粗多糖提取率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明60、70、80℃條件下，粗多糖提取率較高且比較穩(wěn)定。

圖1 溫度對(duì)粗多糖提取率的影響

2.2 固液比對(duì)粗多糖提取率的影響

固液比小于1:12 mg/mL時(shí)，隨水量增加，粗多糖提取率迅速增大。而當(dāng)固液比達(dá)到1∶12 mg/mL時(shí)，固液比繼續(xù)增加欖綠粗葉木粗多糖的提取率無顯著增加（圖2）?？紤]到水量大，后續(xù)蒸發(fā)時(shí)間過長，耗時(shí)費(fèi)力，且可能破壞粗多糖，所以選擇固液比1:12 mg/mL比較合適。

圖2 固液比對(duì)粗多糖提取率的影響

2.3 時(shí)間對(duì)粗多糖提取率的影響

水浴時(shí)間＞24 h時(shí)，欖綠粗葉木粗多糖提取率隨時(shí)間增加而增大，水浴時(shí)間24 h時(shí)提取率最大（圖3）。與水浴時(shí)間24 h比較，水浴3 h和6 h實(shí)驗(yàn)組粗多糖提取率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而水浴12 h和36 h實(shí)驗(yàn)組粗多糖提取率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯示繼續(xù)延長處理時(shí)間對(duì)粗多糖提取率無顯著影響。

圖3 時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化粗多糖提取工藝

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以粗多糖提取率為指標(biāo)，采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)欖綠粗葉木粗多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。直觀分析顯示影響粗多糖提取的主次順序依次為：固液比、水浴時(shí)間和水浴溫度(C＞B＞A)。方差分析(表2)顯示，固液比對(duì)欖綠粗葉木粗多糖提取率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而溫度和時(shí)間對(duì)欖綠粗葉木粗多糖提取率差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.15＜P＜0.01)。綜合考慮欖綠粗葉木粗多糖提取最佳工藝是溫度70℃、時(shí)間12 h、固液比為1∶15(A2B2C3)。見表3。

表3 粗多糖提取的正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.5 粗多糖對(duì)肝癌細(xì)胞毒性作用

欖綠粗葉木粗多糖對(duì)H22肝癌細(xì)增殖抑制作用見圖4，培養(yǎng)24 h后，不同粗多糖濃度對(duì)H22肝癌細(xì)抑制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)48 h和96 h，腫瘤細(xì)胞的生長抑制率顯著增加，且隨粗多糖濃度增大而增加。

圖4 多糖對(duì)H22肝癌增殖抑制率的影響

3 討論

分離及純化是研究多糖功能及性質(zhì)的前提，水提醇沉淀法是粗多糖提取最原始且應(yīng)用最廣泛的方法。其原理是利用粗多糖不溶于有機(jī)溶劑，在粗多糖提取水溶液中加入高濃度乙醇等使粗多糖沉淀析出，從而達(dá)到初步分離的目的[6]。該方法具有簡單、經(jīng)濟(jì)、條件溫和不會(huì)破壞粗多糖等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多糖提取。張國華等[7]以多糖提取率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)研

究冬蟲夏草多糖的提取工藝。結(jié)果顯示加水量10：1，時(shí)間0.5 h，提取3次時(shí)提取率最高。乙醇濃度67%時(shí)多糖沉淀效果最佳。提示影響粗多糖提取的主要因素包括提取時(shí)間、溫度、固液比及pH值等，通過優(yōu)化提取工藝提高粗多糖提取率是的主要手段之一。羅忠圣等[8]研究水提醇沉淀對(duì)中藥復(fù)方二巖虎果湯的提取工藝，顯示最佳提取條件為10倍量水，提取1次，1 h/次，表明該方法穩(wěn)定可行,且不影響藥效。該研究通過對(duì)欖綠粗葉木粗多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可較大程度提高粗粗多糖提取率。其中正交試驗(yàn)最佳提取率（A2B3C3）粗多糖提取率達(dá)1.77%，比最低提取率（A1B1C1）粗多糖提取率達(dá)1.15%提高了53.91%。

腫瘤已成為導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，隨著癌癥診斷和治療技術(shù)的改善和癌癥患者成活率不斷提高[9]。并由于現(xiàn)代人們不良生活習(xí)慣，環(huán)境污染因素影響以及人口增長及老齡化等原因，全球癌癥幸存者的數(shù)量越來越多[10]。在腫瘤的治療和預(yù)防中，藥物占有不可替代的地位。天然抗腫瘤活性成分也是合成化學(xué)類抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物。天然藥物一直是人類獲得藥物的主要途徑，時(shí)至今日天然藥物仍是活性成分或先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要途徑[11]。植物多糖可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫活性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化與等發(fā)揮抗腫瘤作用。從香菇分離的多糖已應(yīng)用到抗腫瘤的臨床治療，香菇多糖能極顯著增高NK細(xì)胞活性，提高血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的含量，并通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而達(dá)到良好抗腫瘤效果[12]。朱坤杰等[13]從庫拉索蘆薈多糖和木立蘆薈中提取多糖，顯示不同劑量的庫拉索蘆薈多糖和木立蘆薈多糖均具有一定腫瘤抑制活性，其中高劑量組抑制率達(dá)45.45%和46.89%。另外，還能恢復(fù)荷瘤機(jī)體免疫功能紊亂，特別是增加脾臟的免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，肖佩玉等[14]研究表明枸杞多糖也改善荷瘤小鼠免疫活性而抑制小鼠H22肝癌細(xì)胞生長。給藥10 d后可見腫瘤減小，AFP、CEA、TNF-α含量降低，而NK細(xì)胞活性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明，欖綠粗葉木提取物具有抗氧化、抗菌、抑制食管癌細(xì)胞等活性。顯示欖綠粗葉木多糖對(duì)H22肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)體外抑制活性，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，不同濃度粗多糖對(duì)H22肝癌細(xì)胞增殖均具有一定抑制作用，且抑制率隨粗多糖濃度增加而增大。

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Extraction of Crude Polysaccharides from L.lancilimbus and Inhibition of Hepatoma Cell Lines H22 in Vitro

LIANG Qing-long，GUO Ting-ting，WEN Yang-min
Department of Basic Medical Sciences,Quanzhou Medical College,Quanzhou,Fujian Province，362011 Chinia

Objective Extraction technology and inhibition of Hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude polysaccharides from L.lancilimbus were researched.Methods L.lancilimbus were collected from Nikeng village,Ninghua country,Fujian provience from February to May in 2016.Orthogonal experiment was applied to obtain the optimum extraction condition on the base of single factor experiment.the inhibitions of hepatoma cell Lines H22 in Vitro of crude polysaccharides were measured by MTT assay.Results The main factor affecting extracting rate of polysaccharides was solid-liquid ratio,followed by treated time and temperature.The optimum extraction conditions to obtain the highest polysaccharides were 70℃,12 h and solid-liquid ratio of 1∶15.polysaccharides from L.lancilimbus could inhibit cell proliferation of hepatoma cell Lines H22 in Vitro,and the inhibition rate increased with the polysaccharides concentration.Conclusion Water extracting-ethanol precipitation method were applicable for extraction crude polysaccharides from L.lancilimbus,and the polysaccharides can inhibit cell proliferation of gastric cancer cell in Vitro.

Crude Polysaccharides;Extraction technology;Orthogonal test;Hepatoma

R284.2

A

2096-1782（2016）11－0114-04

泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012Z76)。

梁青龍（1958.11-），男，福建泉州人，本科，副教授，研究方向：生理學(xué)。

2016-08-15）

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.11.114

植物多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化等多種生物活性，且兼有較小毒副作用和體內(nèi)無殘留等優(yōu)點(diǎn)[1]。植物多糖的開發(fā)與利用已越來越受關(guān)注。欖綠粗葉木(Lasianthus lancilimbus,Merr.)屬于茜草科（Rubia cordifolia L.）、粗葉木屬（Lasianthus Jack,nom.cons.）的一個(gè)變種[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)實(shí)踐表明粗葉木屬植物具有治療筋骨疼痛，活血止痛等作用，民間還將其用于治

濕熱黃疸等[3]。應(yīng)用現(xiàn)代分離純化技術(shù)，已從粗葉木屬中的長尾粗葉木[4]等中獲得多種具有確定生理活性的單體物質(zhì)，而有關(guān)欖綠粗葉木藥理開發(fā)研究較少。該文于2016年2—5月對(duì)欖綠粗葉木粗多糖提取工藝優(yōu)化及對(duì)H22肝癌細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)行研究，為欖綠粗葉木植物的醫(yī)藥價(jià)值研究提供基礎(chǔ)。