機(jī)械攪拌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的中試研究

許云華,朱春林,張 衡,孫汴京,自 強(qiáng),顧 焱,孫東平

(1.連云港師范高等專科學(xué)校 生命科學(xué)系,江蘇連云港 222006; 2.南京理工大學(xué)化學(xué)生物功能材料研究所,江蘇南京 210094)

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機(jī)械攪拌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的中試研究

許云華,朱春林,張 衡,孫汴京,自 強(qiáng),顧 焱,孫東平

(1.連云港師范高等專科學(xué)校 生命科學(xué)系,江蘇連云港 222006; 2.南京理工大學(xué)化學(xué)生物功能材料研究所,江蘇南京 210094)

細(xì)菌纖維素的中試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究是其工業(yè)化生產(chǎn)的必經(jīng)階段,有著極為重要的研究?jī)r(jià)值和意義。利用實(shí)驗(yàn)室20 L-50 L-100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌纖維素進(jìn)行了中試實(shí)驗(yàn),測(cè)定了葡糖桿菌在20 L種子罐中的生長(zhǎng)曲線,研究了不同培養(yǎng)級(jí)數(shù)的種子對(duì)100 L機(jī)械發(fā)酵罐的影響,采用轉(zhuǎn)速-溶氧(DO)聯(lián)動(dòng)控制法提高發(fā)酵中后期的溶氧水平和纖維素產(chǎn)量。結(jié)果表明,在種子生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期的中后期(30～48 h)移種較佳,使用三級(jí)種子移種比一級(jí)和二級(jí)種子移種的發(fā)酵周期分別短62 h和14 h,保持移種后發(fā)酵罐的菌體濃度在2.0×107CFU/mL以上對(duì)縮短發(fā)酵過程延滯期有利,轉(zhuǎn)速-DO聯(lián)動(dòng)控制可保證發(fā)酵中后期DO維持在30%左右,纖維素產(chǎn)量由2.2 g/L提高至2.8 g/L。細(xì)菌纖維素的中試實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)探索生產(chǎn)工藝、縮短發(fā)酵周期、降低生產(chǎn)成本、提高纖維素產(chǎn)量等方面有明顯改善,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)菌纖維素,中試研究,機(jī)械攪拌,發(fā)酵周期

同植物纖維素相比,細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose,BC)由于具有純度高[1]、親水性強(qiáng)[2]、超細(xì)[3]、力學(xué)強(qiáng)度大[4]、生物相容性好[5]等優(yōu)良特性,已應(yīng)用于食品[6-7]、造紙[8-9]、組織工程[10]、醫(yī)用敷料[11-12]等行業(yè)。然而,細(xì)菌纖維素的廣泛應(yīng)用受制于其生產(chǎn)規(guī)模較小和昂貴的成本[13-14]。目前,BC的生產(chǎn)主要有靜態(tài)淺盤培養(yǎng)和生物反應(yīng)器好氧深層發(fā)酵兩種方式。其中,靜態(tài)方式發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量較高,但存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、占地面積大、產(chǎn)品應(yīng)用范圍較小等缺點(diǎn)[13];動(dòng)態(tài)方式發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素因供氧充足利于菌體生長(zhǎng),發(fā)酵周期短,生產(chǎn)效率高,但產(chǎn)量較低[13]。因此,通過小試和中試實(shí)驗(yàn)研究解決制約動(dòng)態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸——產(chǎn)量較低的問題,已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外各研究學(xué)者、相關(guān)研究機(jī)構(gòu)以及企業(yè)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前,國(guó)內(nèi)有關(guān)細(xì)菌纖維素發(fā)酵方面的研究主要集中在菌種篩選與復(fù)壯[15-18]、廉價(jià)碳源和氮源的應(yīng)用[19-22]、培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件[23-25]、小型機(jī)械攪拌發(fā)酵罐和氣升式發(fā)酵罐[26-28]等方面,而對(duì)于100 L及以上發(fā)酵罐的系統(tǒng)性中試實(shí)驗(yàn)研究則少見報(bào)道。同氣升式發(fā)酵罐相比,機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐具有攪拌傳質(zhì)均勻、溶氧較高、流體性質(zhì)較好等優(yōu)點(diǎn),其缺點(diǎn)在于攪拌葉片的形式對(duì)DO和菌體的剪切力有較大影響,有報(bào)道[29-30]稱采用直葉攪拌葉片進(jìn)行發(fā)酵時(shí),高轉(zhuǎn)速和高剪切力的情況下菌體可能發(fā)生突變,變?yōu)椴划a(chǎn)纖維素的菌株。國(guó)內(nèi)洪楓研究組[31]于近年開展了剪切力對(duì)木葡糖醋桿菌產(chǎn)纖維素的影響,發(fā)現(xiàn)采用剪切力大的六葉平漿進(jìn)行發(fā)酵時(shí)產(chǎn)量低,而采用轉(zhuǎn)速低的框式漿進(jìn)行發(fā)酵時(shí)BC產(chǎn)量高。同時(shí)高剪切力對(duì)菌體形態(tài)、菌體濃度都有影響,使得延滯期變長(zhǎng)。針對(duì)DO、攪拌等對(duì)BC發(fā)酵的影響,國(guó)內(nèi)外的研究者做了不少工作和研究。

由于BC的中試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)工藝對(duì)其大試生產(chǎn)極其重要,在大試生產(chǎn)前必須進(jìn)行相關(guān)中試實(shí)驗(yàn)研究,才能確定其生產(chǎn)工藝,并降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量。因此,為順利實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn),開展細(xì)菌纖維素罐體深層動(dòng)態(tài)中試發(fā)酵研究具有極為重要的研究?jī)r(jià)值。本文采用實(shí)驗(yàn)室已有的20 L-50 L-100 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐系統(tǒng),對(duì)葡糖桿菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01)產(chǎn)纖維素進(jìn)行了種子菌體濃度、種子級(jí)數(shù)、轉(zhuǎn)速-溶氧聯(lián)動(dòng)控制等BC中試發(fā)酵工藝研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 由南京理工大學(xué)化學(xué)生物功能材料研究所篩選并經(jīng)16S rDNA基因測(cè)序鑒定為葡糖醋桿菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01),現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)北京),保藏編號(hào)為CGMCC 10961;斜面保藏培養(yǎng)基[32]葡萄糖20 g/L,硫酸鎂0.4 g/L,檸檬酸1.5 g/L,磷酸二氫鈉2.5 g/L,蛋白胨10 g/L,瓊脂18 g/L,酵母粉0.1 g/L,pH6.0;種子培養(yǎng)基[32]葡萄糖20 g/L,硫酸銨6 g/L,磷酸二氫鉀1 g/L,硫酸鎂0.4 g/L,蛋白胨3 g/L,酵母粉2.25 g/L,羧甲基纖維素鈉0.4 g/L,自然pH;發(fā)酵培養(yǎng)基[32]葡萄糖22 g/L,硫酸銨5 g/L,磷酸二氫鉀4 g/L,硫酸鎂0.7 g/L,乳酸鈣0.2 g/L,檸檬酸0.6 g/L,蛋白胨5 g/L,醋酸1.0 mL/L,酵母粉3.5 g/L,羧甲基纖維素鈉0.1 g/L,pH6.0。

FZ-D型20 L、100 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐和100 L氣升式發(fā)酵罐 江蘇豐澤生物工程設(shè)備有限公司;SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;QHZ-98A恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠;DHp-9272隔水式培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;XZ-21K離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;ME104E電子天平 梅特勒-托列多儀器有限公司;LWD300-38LT顯微鏡 上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司;CELL-VUCBC DRM-700細(xì)胞計(jì)數(shù)板 南京裕安儀器有限公司;Inpro3030 pH電極 METTLER TOLED0;Inpro6800溶氧電極 METTLER TOLED0;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華化器制造有限公司;PH5-3C pH計(jì) 雷磁儀電科學(xué)儀器廠;BCD-201KCK冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中試發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的基本工藝流程 本實(shí)驗(yàn)中,葡糖醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素的基本工藝流程如下[32]:

斜面菌種→一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)((30±1) ℃,160 r/min)→二級(jí)搖瓶種子擴(kuò)培→20 L種子罐(三級(jí))培養(yǎng)((30±1) ℃)→100 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)((30±1) ℃)→動(dòng)態(tài)細(xì)菌纖維素后處理→保存或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

上述發(fā)酵工藝流程中,可分別依據(jù)實(shí)驗(yàn)工藝選擇一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)種子進(jìn)行移種和后續(xù)動(dòng)態(tài)深層發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 20 L種子罐中種子擴(kuò)培與工藝實(shí)驗(yàn) 按種子培養(yǎng)基組成配制10 L種子液(先定容至8.5 L,實(shí)消時(shí)會(huì)產(chǎn)生約1.5 L的蒸汽冷凝水),調(diào)pH至6.0,按0.5‰的比例加消泡劑(江蘇賽歐),種子液加至20 L種子罐中進(jìn)行實(shí)消(121 ℃,20 min)。冷卻至30 ℃后,火焰保護(hù)下,以8%比例接種搖床中培養(yǎng)好的種子。培養(yǎng)過程中每隔6 h測(cè)定的參數(shù)主要有:還原糖濃度、pH、DO和木醋桿菌細(xì)胞濃度(菌體濃度)。

采用20 L機(jī)械攪拌種子罐在種子培養(yǎng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)主要有:液氣比為1∶0.25(通氣量為0.16 m3/h),轉(zhuǎn)速為300 r/min,培養(yǎng)溫度為30 ℃,罐壓為0.08 MPa。在此條件下,進(jìn)行了葡糖桿菌的種子培養(yǎng)。

分別采用20 L種子罐生長(zhǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期的前期(18 h)、中期(30 h)和后期(48 h)的種子,以10%比例接種至100 mL發(fā)酵液中(500 mL三角瓶)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。4天后,經(jīng)過過濾除菌、漂白漂洗等后處理工藝,于普通烘箱中80 ℃烘干12 h,測(cè)得搖瓶中細(xì)菌纖維素的干態(tài)產(chǎn)量。

1.2.3 一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子發(fā)酵與工藝實(shí)驗(yàn) 由于工業(yè)化大生產(chǎn)時(shí),采用的發(fā)酵罐容積一般在10～300噸左右,按照BC實(shí)驗(yàn)過程中的接種量和菌體濃度計(jì)算,需要的種子液量較大,一般都超過1噸。為保證BC發(fā)酵時(shí)移種的種子在發(fā)酵罐發(fā)酵BC過程中,有合適菌體濃度的種子和種子液量,應(yīng)制備二級(jí)或三級(jí)種子。二級(jí)或三級(jí)種子對(duì)機(jī)械攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵BC過程的影響將直接關(guān)系到大生產(chǎn)時(shí)的各項(xiàng)工藝、參數(shù)的確定和最終BC產(chǎn)量。因而,實(shí)驗(yàn)中研究了一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)種子對(duì)100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的發(fā)酵過程、發(fā)酵工藝、成本控制和BC產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)中使用的攪拌發(fā)酵罐的葉片形式為下層斜葉、上層直葉,在保證發(fā)酵過程中較高DO的同時(shí),減輕了剪切力對(duì)菌體的不利影響。

為模擬大試生產(chǎn)工藝,分別進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)種子發(fā)酵中試實(shí)驗(yàn)。一級(jí)種子發(fā)酵時(shí),直接以恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)好的搖瓶種子對(duì)100 L機(jī)械罐進(jìn)行接種,接種量為1%(700 mL種子/70 L發(fā)酵液);二級(jí)種子發(fā)酵時(shí),一級(jí)種子為恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的搖瓶種子,二級(jí)種子在20 L種子罐中培養(yǎng),接種比例分別為1%和8%;三級(jí)種子發(fā)酵時(shí),一級(jí)種子在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng),二級(jí)種子在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中擴(kuò)培,三級(jí)種子在20 L種子罐中培養(yǎng),接種比例分別為1%、8%和8%。

為保證各批次發(fā)酵罐發(fā)酵BC過程參數(shù)、工藝的一致性,設(shè)定了100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的發(fā)酵條件:轉(zhuǎn)速為200 r/min、培養(yǎng)溫度為30 ℃、罐壓為0.08 MPa、通氣量 2.3 m3/h。同時(shí),結(jié)合大生產(chǎn)時(shí)可能出現(xiàn)的低接種量的問題,對(duì)于待移種至發(fā)酵罐中的種子質(zhì)量進(jìn)行控制。主要工藝參數(shù)包括:一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)種子發(fā)酵的移種比例分別為1%、8%和8%,各級(jí)培養(yǎng)種子的周期分別為40、24、24 h左右。

100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的裝液量為70 L,pH、DO、溫度為在線監(jiān)測(cè)控制。其它主要測(cè)定的參數(shù)有:菌體濃度、還原糖、BC產(chǎn)量等。

1.2.4 100 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)BC的影響實(shí)驗(yàn) 在以100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)過程中,DO隨發(fā)酵時(shí)間、菌體濃度、纖維素產(chǎn)量的上升而下降。為了研究溶解氧相對(duì)含量對(duì)發(fā)酵各參數(shù)和BC產(chǎn)量的影響,進(jìn)行DO與轉(zhuǎn)速的聯(lián)動(dòng)中試實(shí)驗(yàn)。當(dāng)BC發(fā)酵過程中的DO低于30%時(shí),提高轉(zhuǎn)速以提高溶解氧相對(duì)含量,檢測(cè)各工藝參數(shù)和BC產(chǎn)量的變化情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)參數(shù)檢測(cè)方法

還原糖測(cè)定:采用工業(yè)測(cè)糖法進(jìn)行測(cè)定[32]。

pH、DO測(cè)定[32]:均采用在線實(shí)時(shí)檢測(cè),其中DO校準(zhǔn)時(shí),以大氣中含氧量標(biāo)定為100%,以實(shí)消過程中121 ℃、0.1 MPa條件下標(biāo)定為0。

菌體濃度測(cè)定[32]:采用進(jìn)口血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)前按需要將發(fā)酵液稀釋一定的倍數(shù)。

BC產(chǎn)率測(cè)定[32]:依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按8 h或6 h或一定的發(fā)酵周期進(jìn)行取樣,在發(fā)酵罐取樣口遵循無(wú)菌取樣操作每次取100 mL發(fā)酵液。過濾除去培養(yǎng)液,收集絮狀BC并分散在含3‰ NaOH和3‰ H2O2的水溶液中,于80 ℃水浴鍋中處理2～4 h。用自來(lái)水沖洗至中性后,將BC放置于80 ℃的普通干燥箱中干燥12 h,計(jì)算每升培養(yǎng)液中所含有的BC干重即為BC產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 20 L種子罐相關(guān)工藝、參數(shù)研究

為研究機(jī)械攪拌式種子罐在葡糖桿菌的培養(yǎng)過程各工藝參數(shù)的變化,詳細(xì)測(cè)定或監(jiān)測(cè)了種子培養(yǎng)過程中還原糖、pH、DO和葡糖桿菌細(xì)胞濃度(菌體濃度)的變化情況。如圖1中所示,可以發(fā)現(xiàn)在20 L種子罐的種子液培養(yǎng)過程中,前12 h中葡糖桿菌細(xì)胞濃度(菌體濃度)變化不大,大約在2×107CFU/mL左右,表現(xiàn)為典型的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的延滯期;在12～48 h期間,菌體濃度迅速增加到22×107CFU/mL,為葡糖桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在該階段中種子液的還原糖、pH和溶氧均大幅下降;48 h后菌數(shù)增加緩慢,過渡至葡糖桿菌細(xì)胞的平穩(wěn)生長(zhǎng)期。

圖1 20 L種子罐培養(yǎng)過程中菌體濃度等工藝參數(shù)的變化情況Fig.1 Process parameters curves such as cell concentration during the seed culture process in 20 L fermentor

為研究不同時(shí)期的菌體濃度對(duì)后續(xù)BC發(fā)酵的影響,依據(jù)1.2.2節(jié)中的實(shí)驗(yàn)方法,測(cè)定出在種子罐生長(zhǎng)的第18、30、48 h接種到搖瓶中于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的BC發(fā)酵產(chǎn)量分別為4.7、6.8、7.0 g/L。實(shí)驗(yàn)表明,在20 L種子罐中,實(shí)驗(yàn)室的葡糖桿菌于細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的中后期移種對(duì)后續(xù)動(dòng)態(tài)發(fā)酵BC的產(chǎn)量提高有利,較為合適,移種時(shí)的葡糖桿菌菌體濃度約為19×107CFU/mL。

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)葡糖桿菌種子質(zhì)量的好壞對(duì)BC發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期有著重要影響。選擇恰當(dāng)?shù)囊品N時(shí)機(jī)和種子菌體濃度對(duì)提高BC的發(fā)酵產(chǎn)量是很關(guān)鍵的。選擇種子生長(zhǎng)曲線中的對(duì)數(shù)期前期移種,則菌體濃度較低,發(fā)酵罐中延滯期太長(zhǎng);選擇種子生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期后期移種,菌體濃度雖高,但影響總發(fā)酵周期;因而,選擇種子生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期的中后期是比較合適的工藝,可同時(shí)保證較高的菌體濃度和較短的總發(fā)酵周期。

2.2 分級(jí)發(fā)酵對(duì)BC發(fā)酵中試工藝的影響

采用一級(jí)種子移種并在100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中(發(fā)酵液量為70 L)進(jìn)行BC的發(fā)酵中試實(shí)驗(yàn),發(fā)酵過程中的還原糖、pH、DO、菌體濃度和BC產(chǎn)量隨培養(yǎng)周期的變化如圖2所示。

從圖2中可以明顯發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵周期前24 h,還原糖、pH、DO菌體濃度和BC產(chǎn)量等均未發(fā)生明顯變化,表明以一級(jí)種子移種進(jìn)行100 L機(jī)械攪拌罐的動(dòng)態(tài)發(fā)酵時(shí)存在類似于種子罐種子生長(zhǎng)過程的延滯期。在發(fā)酵周期第24～48 h期間,還原糖、pH和DO均有小幅消耗或下降,菌體濃度和BC產(chǎn)量開始較明顯增加,但增長(zhǎng)的速率較小。在發(fā)酵周期第48～94 h期間,各參數(shù)均出現(xiàn)大幅變化。具體表現(xiàn)為:還原糖濃度由2.4 g/L大幅下降至1.3 g/L;pH先下降至5.0,在小幅反彈上升至5.2后繼續(xù)大幅降低;DO則迅速下降至20%左右,表明發(fā)酵罐中的葡糖桿菌細(xì)胞在大量消耗氧氣;而菌體濃度則明顯處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體濃度由1.0×107CFU/mL增加至8.8×107CFU/mL;在纖維素產(chǎn)量方面,則由0.2 g/L快速提高至1.8 g/L。在發(fā)酵周期94～120 h期間,pH繼續(xù)下降、還原糖和DO分別下降至1.0 g/L和17%后趨于穩(wěn)定,而菌體濃度和BC產(chǎn)量均小幅提高。在發(fā)酵罐發(fā)酵后期,以BC產(chǎn)量、還原糖、pH等工藝參數(shù)不再明顯變化時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)。本批次發(fā)酵終點(diǎn)在第120 h,最終BC產(chǎn)量為2.08 g/L。

圖2 以一級(jí)種子移種進(jìn)行BC的100 L機(jī)械攪拌罐動(dòng)態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Fig.2 BC fermentation experimental curves usinggrade one seed in 100 L stirred tank fermentation

以二級(jí)種子移種進(jìn)行的100 L機(jī)械攪拌罐的動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化情況見圖3所示。在BC動(dòng)態(tài)發(fā)酵周期前24 h中,各還原糖、菌體濃度等各工藝參數(shù)均無(wú)明顯降低或增加,表明葡糖桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)過程仍處于延滯期。而在24～60 h發(fā)酵周期中,還原糖、pH和DO迅速下降,菌體濃度和BC產(chǎn)量同步增加或提高,其中發(fā)酵第60 h時(shí)的菌體濃度達(dá)到10.5×107個(gè)mL,BC產(chǎn)量接近2.0 g/L。在BC動(dòng)態(tài)發(fā)酵周期的第60～72 h期間,菌體濃度、還原糖等工藝參數(shù)趨于穩(wěn)定,DO和pH小幅下降。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)還原糖為0.8 g/L,BC產(chǎn)量為2.18 g/L。同一級(jí)種子移種的100 L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相比,發(fā)酵周期由120 h大幅縮短至72 h,而BC產(chǎn)量還略有增加,降低了能耗等生產(chǎn)成本,提高了生產(chǎn)效率。

圖3 以二級(jí)種子移種進(jìn)行BC的100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐動(dòng)態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Fig.3 BC fermentation experimental curves using grade two seed in 100 L stirred tank fermentation

以培養(yǎng)好的三級(jí)種子進(jìn)行移種,在100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中進(jìn)行BC的動(dòng)態(tài)發(fā)酵,過程中的工藝參數(shù)變化見圖4。從圖4中可發(fā)現(xiàn)從三級(jí)種子液移種到100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐之后,發(fā)酵液的pH、DO、還原糖即迅速下降,而菌體濃度和BC產(chǎn)量則開始提高,未出現(xiàn)圖2和圖3中明顯存在的延滯期。分析其原因,發(fā)現(xiàn)待移種的三級(jí)種子菌體濃度較高,移種后發(fā)酵罐中的葡糖桿菌菌體濃度達(dá)到2.2×107CFU/mL,表明適當(dāng)提高移種種子液的菌體濃度對(duì)縮短后續(xù)發(fā)酵罐中的延滯期有明顯作用。發(fā)酵周期的前48 h,葡糖桿菌基本處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,發(fā)酵液中的菌體濃度最高達(dá)到13.8×107CFU/mL。而BC產(chǎn)量的提高基本與菌體濃度的提高同步進(jìn)行,與一級(jí)種子和二級(jí)種子發(fā)酵過程類似,表明葡糖桿菌細(xì)胞代謝分泌BC與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)性大,屬于生長(zhǎng)相關(guān)型。在發(fā)酵過程的48～58 h期間,還原糖、pH、菌體濃度等各參數(shù)變化趨于平緩。BC的終產(chǎn)量為2.21 g/L,比一級(jí)、二級(jí)種子發(fā)酵產(chǎn)量略高。但發(fā)酵罐的發(fā)酵周期僅為58 h,明顯少于一級(jí)發(fā)酵的120 h和二級(jí)發(fā)酵的72 h,在大生產(chǎn)中放大后將節(jié)省大量成本、產(chǎn)生明顯的經(jīng)濟(jì)效益。

圖4 以三級(jí)種子移種進(jìn)行BC的100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐動(dòng)態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Fig.4 BC fermentation experimental curves using grade three seed in 100 L stirred tank fermentation

表1 不同級(jí)數(shù)種子移種發(fā)酵中試實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)比較

通過采用不同級(jí)數(shù)的種子液進(jìn)行100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的中試實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的不同級(jí)數(shù)種子對(duì)發(fā)酵周期、前期細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期等工藝有明顯影響。表1列出了采用不同級(jí)數(shù)種子移種進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)的主要工藝參數(shù)的比較。在總發(fā)酵周期方面,采用一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)種子移種后發(fā)酵的總周期分別為160、138、146 h。結(jié)果表明采用二級(jí)和三級(jí)種子進(jìn)行BC的動(dòng)態(tài)發(fā)酵(100 L機(jī)械罐)總周期明顯短于采用一級(jí)種子進(jìn)行發(fā)酵,而采用三級(jí)種子進(jìn)行動(dòng)態(tài)發(fā)酵的總周期略長(zhǎng)于二級(jí)種子,但在100 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵的周期比二級(jí)種子短14 h。

不同種子級(jí)數(shù)發(fā)酵的本質(zhì)在于移種時(shí)種子菌體濃度和生長(zhǎng)狀態(tài)的不同,而大多數(shù)研究者對(duì)發(fā)酵罐的多級(jí)發(fā)酵與BC產(chǎn)量和相關(guān)工藝參數(shù)的關(guān)系沒有做系統(tǒng)性研究。本文研究認(rèn)為,應(yīng)當(dāng)依據(jù)生產(chǎn)時(shí)發(fā)酵罐的大小和制種條件、能力選擇合適的種子培養(yǎng)級(jí)數(shù)。關(guān)鍵在于保證移種時(shí)種子處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期、移種后發(fā)酵罐中的菌體濃度不低于2.0×107CFU/mL,以此確保發(fā)酵罐中菌體濃度的增長(zhǎng)和BC發(fā)酵可快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期。

2.3 溶解氧與轉(zhuǎn)速聯(lián)動(dòng)提高BC產(chǎn)量的中試研究

在前述BC的動(dòng)態(tài)發(fā)酵中試實(shí)驗(yàn)中,觀察到DO隨發(fā)酵周期的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì),主要是由于其中葡糖桿菌的大量增殖和發(fā)酵液粘度的增加導(dǎo)致的。在機(jī)械攪拌發(fā)酵時(shí),DO對(duì)BC發(fā)酵產(chǎn)量有重要影響。本實(shí)驗(yàn)中采用轉(zhuǎn)速-DO聯(lián)動(dòng)的方法,對(duì)100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐的DO進(jìn)行控制。當(dāng)DO低于30%時(shí),提高攪拌轉(zhuǎn)速,100 L機(jī)械罐發(fā)酵過程中測(cè)得的轉(zhuǎn)速對(duì)DO的影響曲線見圖5所示。從圖5中發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵周期的第40 h時(shí),DO下降至25%左右,提高攪拌轉(zhuǎn)速(從200 r/min提高至250 r/min)后,DO提高至53%。之后,DO仍快速下降,表明葡糖桿菌細(xì)胞在大量耗氧。在發(fā)酵周期第52 h和56 h時(shí)DO低于30%,分別提高攪拌轉(zhuǎn)速,DO值再次提高至30%以上。

圖5 100 L機(jī)械罐中轉(zhuǎn)速對(duì)溶解氧的影響Fig.5 Effect of rotating speed on dissolved oxygen in 100 L stirred tank fermentation

在上述轉(zhuǎn)速-DO聯(lián)動(dòng)控制條件下,100 L機(jī)械罐中BC發(fā)酵過程參數(shù)曲線見圖6。BC動(dòng)態(tài)發(fā)酵過程中還原糖和pH分別下降至0.6 g/L和4.05,菌體濃度則達(dá)到較高的20.2×107CFU/mL,BC終產(chǎn)量高達(dá)2.8 g/L。同未進(jìn)行轉(zhuǎn)速-DO聯(lián)動(dòng)控制的100 L機(jī)械罐BC發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相比,本批次實(shí)驗(yàn)中葡糖桿菌菌體濃度和BC終產(chǎn)量均得到大幅提高,結(jié)果表明轉(zhuǎn)速-DO聯(lián)動(dòng)控制對(duì)提高中試發(fā)酵中后期的DO、菌體濃度和BC產(chǎn)量是一種有效的方法。

圖6 溶解氧與轉(zhuǎn)速聯(lián)動(dòng)控制100 L機(jī)械罐BC發(fā)酵過程參數(shù)曲線變化Fig.6 BC fermentation process parameters curves with the control of dissolved oxygen and rotational speed in 100 L stirred tank

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,發(fā)酵過程中保持一定濃度的DO對(duì)BC機(jī)械攪拌罐動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量的提高有利。

3 結(jié)論

采用100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐研究了細(xì)菌纖維素的中試發(fā)酵工藝。結(jié)果表明當(dāng)移種前種子菌體濃度為19×107CFU/mL時(shí)適于100 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐BC的動(dòng)態(tài)發(fā)酵。采用三級(jí)種子進(jìn)行BC動(dòng)態(tài)發(fā)酵有利于縮短發(fā)酵罐的發(fā)酵周期,可分別比采用一級(jí)和二級(jí)種子進(jìn)行培養(yǎng)的動(dòng)態(tài)周期短62 h和14 h。轉(zhuǎn)速-DO聯(lián)動(dòng)控制,保持發(fā)酵過程中發(fā)酵液的DO在30%以上時(shí)可將BC中試發(fā)酵產(chǎn)率從2.2 g/L提高到2.8 g/L。本研究組進(jìn)行了BC的中試發(fā)酵,在種子菌體濃度、種子級(jí)數(shù)和轉(zhuǎn)速-DO聯(lián)動(dòng)方面開展了相關(guān)中試研究,取得了初步成果。下一步,還將繼續(xù)深入開展廉價(jià)碳源[33]、補(bǔ)料發(fā)酵、發(fā)酵中后期流體狀態(tài)、氣升式反應(yīng)器等方面的BC中試發(fā)酵研究,并對(duì)發(fā)酵罐中的菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和基質(zhì)消耗等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,建立木醋桿菌生長(zhǎng)代謝趨勢(shì)的動(dòng)力學(xué)模型[34-35],以深入探討木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素機(jī)理及發(fā)酵罐中發(fā)酵條件的優(yōu)化。

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Mechanical stirring fermentation pilot study of bacterial cellulose

XU Yun-hua1,ZHU Chun-lin2,ZHANG Heng2,SUN Bian-jing2,ZI Qiang2,GU Yan2,SUN Dong-ping2,*

(1. Department of Life Sciences,Lianyungang Normal College,Lianyungang 222006,China;2. Chemicobiology and Functional Materials Institute of Nanjing University of Science and Technology,Nanjing 210094,China)

The pilot fermentation experiment of bacterial cellulose(BC)is a necessary stage for its industrial production. It has a very important value and significance. The pilot fermentation experiment were systematically researched using 20 L-50 L-100 L laboratory stirred tank fermentation system. The growth curve ofKomagataeibacternataicolaseeds at 20 L fermentor were determined. The effects of different seed culture series on 100 L mechanical fermentation tank were studied. To improve the level of dissolved oxygen,stirring speed-dissolved oxygen(DO)linkage control method were used during fermentation and cellulose production. The results showed that suitable inoculation period was in the middle and late stage of logarithmic phase(30～48 h). The fermentation period using grade three seed was 62 h and 14 h shorter than grade one and two,respectively. To shorten the fermentation process delay time,the bacteria concentration in the fermentation tank was more than 2.0×107CFU/mL after inoculation with bacteria. Stirring speed-DO linkage control could ensure DO maintained at around 30% and increased BC yield to 2.8 g/L. This research is beneficial with shortening the fermentation cycle,reducing the production cost,improving the yield of cellulose,and laying foundations for the industrial production. The pilot experiment study results of BC have a significant improvement in the production process.

Bacterial cellulose;pilot study;mechanical agitation;fermentation period

2016-03-30

許云華(1968-)，女，碩士，副教授，研究方向：微生物學(xué)、生理學(xué)，E-mail：xyh6322@126.com。

*通訊作者: 孫東平(1970-)，男，博士，教授，研究方向：生物功能材料、微生物工程等，E-mail：dongpingsun@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21206076)；江蘇省高等職業(yè)院校國(guó)內(nèi)高級(jí)訪問學(xué)者計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015FX032)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目資助(16KJB180034)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000