銀杏酚C15∶1與鯡魚精DNA相互作用的光譜研究

楊小明,劉盼君,李月英,方洋洋,史亞祥

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;3.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;4.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院,江蘇鎮(zhèn)江 212003)

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銀杏酚C15∶1與鯡魚精DNA相互作用的光譜研究

楊小明,劉盼君,李月英,方洋洋,史亞祥

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;3.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;4.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院,江蘇鎮(zhèn)江 212003)

目的:研究銀杏酚C15∶1與DNA的相互作用情況。方法:吖啶橙(AO)為熒光探針,在293 K和310 K pH7.4的Tris-HCl緩沖液中,采用熒光光譜法、粘度法和熱溶解實(shí)驗(yàn)研究銀杏酚C15∶1和鯡魚精DNA的相互作用方式。結(jié)果:銀杏酚C15∶1與AO-DNA之間的猝滅方式為靜態(tài)猝滅,根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定作用力類型是以氫鍵作用為主,判斷銀杏酚C15∶1與AO-DNA之間的作用方式主要是嵌插作用。結(jié)論:粘度法及熱變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明銀杏酚C15∶1與AO-DNA之間的主要作用方式是嵌插模式。

銀杏酚C15∶1,鯡魚精DNA,熒光光譜法

DNA是重要的生物大分子,是體內(nèi)抗腫瘤藥物作用的主要靶點(diǎn)。小分子藥物可以通過改變DNA的結(jié)構(gòu)從而影響其復(fù)制、合成等性質(zhì),達(dá)到抗腫瘤的目的。因此研究小分子藥物與DNA的相互作用可為抗腫瘤藥物的初步篩選提供有用信息,并有助于從分子水平上了解抗腫瘤藥物的作用機(jī)制[1]。

銀杏酚屬于烷基酚類化合物,主要存在于銀杏(Ginkgo biloba L.)的葉、果和外種皮中[2]。在體內(nèi)、體外均顯示出良好的抗腫瘤活性[3-4],可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而起到抗腫瘤效果[5]。銀杏酚C15∶1作為銀杏酚同系物中含量最大的一個(gè)單體,對人肝癌細(xì)胞有較好的抑制效果[5],因此被選為研究銀杏酚與DNA相互作用的模型。目前,國內(nèi)外對于銀杏中烷基酚類化合物的研究仍主要集中于銀杏酸,對銀杏酚涉及較少,已有的銀杏酚與蛋白質(zhì)相互作用的研究報(bào)道也是本課題組的前期工作[6],尚未見有關(guān)銀杏酚與DNA作用的研究。由于DNA的天然熒光很弱,因此必須借助熒光探針來研究其與藥物小分子的相互作用。吖啶橙即為一種靈敏度很好的DNA探針[7]。本實(shí)驗(yàn)以吖啶橙為熒光探針,應(yīng)用熒光光譜法以及粘度實(shí)驗(yàn)和熔解實(shí)驗(yàn)分析研究在pH7.4的Tris-HCl緩沖介質(zhì)中銀杏酚C15∶1與DNA的相互作用,并對其作用機(jī)理進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏酚C15∶1(Ginkgol)HPLC純度>98%,實(shí)驗(yàn)室自制;鯡魚精DNA(fsDNA)、吖啶橙(AO)購自Sigma-Aldrich公司;實(shí)驗(yàn)用水 哇哈哈純凈水;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì) 美國瓦里安公司;烏氏粘度計(jì) 上海申誼玻璃制品有限公司;SYP-II B玻璃恒溫水浴槽 上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司;pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 分別配制濃度為1.5×10-4mol/L的銀杏酚C15∶1甲醇溶液,2.45×10-4mol/L的AO溶液,2.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L pH7.4的Tris-HCl緩沖液。

fsDNA溶液的配制:稱取一定量fsDNA,用二次蒸餾水溶解并用容量瓶定容至100 mL。取該溶液3 mL,測其波長在260 nm處的紫外吸光度,通過ε260=6600/mol·cm計(jì)算出DNA儲備液的濃度為0.91×10-4mol/L。同時(shí)根據(jù)A260/A280>1.8,表明DNA中基本不含蛋白質(zhì),符合測定要求。fsDNA儲備液在4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 AO與DNA的結(jié)合 在pH7.4的Tris-HCl緩沖液中,分別測定DNA、AO及AO與DNA混合物的熒光光譜。激發(fā)波長為495 nm,發(fā)射光譜的掃描范圍為500～650 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫皆為5 nm。

通過熒光法測定AO與DNA溶液的最佳比值。實(shí)驗(yàn)中保持溶液中AO的濃度為2.45×10-6mol/L,改變DNA的濃度,測定溶液在527 nm出的熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長為495 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫皆為5 nm。

1.2.3 熒光淬滅實(shí)驗(yàn) 采用熒光淬滅法研究銀杏酚C15∶1與DNA結(jié)合性質(zhì)。取8只5 mL的容量瓶,分別加入370 μL DNA溶液、50 μL AO溶液和1.0 mL Tris-HCl緩沖液,搖勻,然后依次加入0、20、40、60、80、100、120、140 μL的銀杏酚C15∶1溶液,定容后室溫放置4 h。移取混合液于1 cm石英比色皿,放入自帶恒溫裝置的熒光分光光度計(jì)中恒溫10 min,分別在293 K及310 K下記錄其熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長為495 nm,發(fā)射光譜的掃描范圍為500～650 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫皆為5 nm)。同時(shí)在相同條件下記錄AO溶液、DNA溶液的熒光發(fā)射光譜。

1.2.4 離子強(qiáng)度實(shí)驗(yàn) 取8只5 mL的容量瓶,分別加入370 μL DNA溶液、50 μL AO溶液、90 μL銀杏酚C15∶1溶液和1 mL Tris-HCl緩沖液搖勻,再分別加入一定量的NaCl溶液使其濃度依次為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mol/L(NaCl溶液濃度參見文獻(xiàn)[8]),定容。測定在NaCl加入前和加入后的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長為495 nm,發(fā)射波長527 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫皆為5 nm),以F/F0為縱坐標(biāo),NaCl濃度為橫坐標(biāo)作圖,得到不同離子強(qiáng)度對Ginkgol-DNA-AO熒光強(qiáng)度的影響。

1.2.5 粘度的測定 將粘度計(jì)垂直插入298 K的恒溫玻璃水浴槽中,加入一定量的Tris-HCl緩沖液于粘度計(jì)中并恒溫15 min,用秒表測溶液在粘度計(jì)玻璃球中流經(jīng)的時(shí)間,重復(fù)測定5次,誤差不超過±0.2 s。隨后加入一定量的AO和DNA溶液按同樣的方法測定。再逐漸加入不同濃度的Ginkgol測溶液流經(jīng)時(shí)間。通過樣品在粘度計(jì)玻璃球中流經(jīng)的時(shí)間計(jì)算平均相對粘度,平均相對粘度用(η/η0)1/3表示,η0和η分別表示沒有銀杏酚存在和有銀杏酚存在下的AO-DNA的粘度,而η的值根據(jù)公式η=(t-t0)/t0計(jì)算[9]。

1.2.6 熔解實(shí)驗(yàn) 取2支10 mL的比色管,分別加入900 μL DNA,100 μL AO,2 mL Tris-HCl緩沖液,銀杏酚C15∶1溶液分別加入0 μL,140 μL并定容至10 mL。放置于水浴中加熱,升溫范圍為298～370 K,298～343 K范圍內(nèi)每隔5 K測定體系的熒光強(qiáng)度,343～370 K范圍內(nèi)每隔3 K測定體系的熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 AO與DNA的結(jié)合性質(zhì)

為研究AO與DNA的結(jié)合,分別掃描了AO、DNA和AO-DNA的熒光發(fā)射光譜,結(jié)果見圖1。從圖1可以看到,DNA溶液熒光發(fā)射光譜的熒光強(qiáng)度很弱,而AO在濃度為2.45×10-6mol/L時(shí)的熒光強(qiáng)度也很弱,但是當(dāng)DNA與AO混合后,AO-DNA體系的熒光強(qiáng)度就大大增強(qiáng)。這是因?yàn)锳O是一種具有平面結(jié)構(gòu)的芳香類發(fā)色團(tuán),其平面芳環(huán)能夠嵌入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對中,使其熒光大大增強(qiáng)[10]。

圖1 (a)DNA,(b)AO,(c)AO-DNA體系的熒光發(fā)射光譜Fig.1 The fluorescence emission spectra of(a)DNA,(b)AO,(c)AO-DNA注:c(DNA)=1.0×10-5 mol/L,c(AO)=2.45×10-6 mol/L。

從圖1可以看出,AO-DNA體系在527 nm處有一很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。固定AO濃度為2.45×10-6mol/L,測定AO-DNA體系在527 nm處的熒光強(qiáng)度隨DNA濃度的變化,結(jié)果見圖2。由圖2可見,當(dāng)DNA濃度低于1.0×10-5mol/L時(shí),AO-DNA體系的熒光強(qiáng)度隨著DNA濃度的增加明顯上升,在0～7.28 mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系;而DNA濃度高于1.0×10-5mol/L,AO-DNA體系的熒光強(qiáng)度隨濃度增加的幅度明顯減少。因此,選取DNA的濃度為6.73×10-6mol/L。

圖2 AO溶液熒光強(qiáng)度隨DNA溶液濃度的變化Fig.2 Variations in fluorescence intensity of AO with increasing the concentration of DNA 注:c(AO)=2.45×10-6 mol/L。

2.2 熒光猝滅研究

通過熒光猝滅的方法來研究小分子與AO-DNA配合物的成鍵作用。本實(shí)驗(yàn)中,在AO-DNA體系中加入不同濃度銀杏酚C15∶1后,體系的熒光強(qiáng)度被顯著猝滅,但熒光光譜并沒有發(fā)生紅移和藍(lán)移,結(jié)果見圖3。從圖3可以看出,AO-DNA系統(tǒng)在527 nm處有一很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,且熒光強(qiáng)度隨著銀杏酚C15∶1濃度的增加而逐漸減小。若銀杏酚C15∶1與DNA的結(jié)合是嵌入式結(jié)合,那么銀杏酚C15∶1將會與AO競爭結(jié)合嵌入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對中,從而使AO與DNA的相互作用的程度減小,隨著銀杏酚C15∶1濃度的逐漸增加,AO逐漸從DNA中游離出來,使熒光強(qiáng)度逐漸降低[11]。

圖3 不同濃度銀杏酚C15∶1存在下AO-DNA的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of AO-DNA in the presence of Ginkgol at different concentrations 注:pH7.4,T=293 K;c(AO)=2.45×10-6 mol/L,c(DNA)=6.73×10-6 mol/L,c(Ginkgol C15∶1)=(1)0、(2)0.6、(3)1.2、(4)1.8、(5)2.4、(6)3.0、(7)3.6×10-6 mol/L。

2.3 熒光猝滅類型

一般來說,熒光猝滅方式分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅與熒光團(tuán)、猝滅劑形成的基態(tài)復(fù)合物有關(guān),溫度升高會導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)減小[12]。而動態(tài)猝滅則是在激發(fā)態(tài)壽命期間熒光團(tuán)和猝滅劑發(fā)生碰撞,溫度升高則導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)增大[13]。為了進(jìn)一步研究體系的猝滅機(jī)制,可以用Stern-Volmer方程計(jì)算猝滅數(shù)據(jù)來判斷熒光猝滅的類型[14]:

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

式(1)

其中F0和F分別表示AO-DNA體系在藥物不存在和存在時(shí)的熒光強(qiáng)度;Kq、Ksv分別為雙分子的猝滅速率常數(shù)和動態(tài)猝滅常數(shù),τ0為不存在猝滅劑的情況下生物分子的平均熒光壽命(τ0=10-8s),[Q]為猝滅劑的濃度。以F0/F為Y軸,[Q]為X軸作圖。圖4是表示在293 K及310 K這兩個(gè)溫度下銀杏酚C15∶1對AO-DNA熒光猝滅的Stern-Volmer圖,從圖4中可以看出兩條曲線呈良好的線性關(guān)系,說明銀杏酚C15∶1對AO-DNA的猝滅是單一的猝滅類型。曲線的斜率即為Ksv,同時(shí)根據(jù)Ksv=Kqτ0求出Kq,結(jié)果列于表1中。從表1中可以看出,Ksv隨著溫度的升高而降低,說明銀杏酚對AO-DNA的猝滅是靜態(tài)猝滅。另外,Kq的值比生物分子的最大擴(kuò)散速率常數(shù)(2.0×1010L/mol·s)還大,這也說明銀杏酚對AO-DNA的猝滅并非動態(tài)猝滅而是靜態(tài)猝滅。

圖4 不同溫度下銀杏酚C15∶1對AO-DNA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線圖Fig.4 Stern-Volmer plots for the fluorescence quenching of AO-DNA by Ginkgol at different temperatures

T(K)KSV(×105L/mol)Kq(×1013L/mols)R22931 5441 5440 98213101 3221 3220 9768

2.4 結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)函數(shù)的計(jì)算

對于靜態(tài)猝滅,結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目可以用下面的方程來計(jì)算[15]:

log[(F0-F)/F]=logKa+nlog[Q]

式(2)

在這個(gè)方程中,Ka和n分別表示結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目,以log[(F0-F)/F]對log[Q]作雙對數(shù)曲線圖,如圖5。Ka和n的值分別通過截距和斜率得到,數(shù)據(jù)列于表2中。

表2 不同溫度下銀杏酚C15∶1與AO-DNA相互作用結(jié)合常數(shù),結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及熱力學(xué)參數(shù)

圖5 不同溫度下log[(F0-F)/F]對log[Q]的曲線圖Fig.5 Plots of log[(F0-F)/F]vs log[Q]at different temperatures

熱力學(xué)函數(shù)的研究對判斷Ginkgol與鯡魚精DNA的結(jié)合模式具有重要的作用。小分子與生物分子的結(jié)合力類型主要受四種作用力的驅(qū)使:氫鍵作用力,疏水作用力,范德華力以及靜電作用力,這四種作用力都可以通過計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)來判斷。當(dāng)溫度的變化不是很大時(shí),焓變ΔH可以看成是一個(gè)常數(shù)。焓變ΔH和熵變ΔS可以通過范特霍夫方程來計(jì)算:

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

式(3)

ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS

式(4)

Ka為結(jié)合常數(shù),R為氣態(tài)常數(shù),T為實(shí)驗(yàn)溫度,ΔG、ΔH和ΔS分別代表吉布斯自由能變,焓變和熵變。相應(yīng)的結(jié)果列于表2中。表2中的ΔG為負(fù)值,表明該反應(yīng)自發(fā)的。ΔH和ΔS皆小于0,表明氫鍵作用力在反應(yīng)過程中起主要作用。而氫鍵作用是判斷藥物與DNA發(fā)生嵌插作用的顯著特征[16],由此可以判斷,銀杏酚C15∶1很可能嵌入到了DNA的堿基對中。

2.5 粘度的測定

粘度的測定對DNA長度的變化非常敏感,它是判定藥物小分子和DNA之間結(jié)合模式的最關(guān)鍵有效的測試[17]。當(dāng)小分子與DNA以典型的嵌入式結(jié)合時(shí),要求DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的相鄰堿基對之間的距離增大以容納足夠的配體,從而導(dǎo)致DNA雙鏈的延長,粘度因此有所增大[18];當(dāng)小分子與DNA以溝槽或靜電作用結(jié)合時(shí),對DNA的粘度幾乎沒有什么變化[17,19];而一種部分的,非經(jīng)典的嵌入式結(jié)合則會使DNA得雙螺旋結(jié)構(gòu)彎曲從而導(dǎo)致DNA粘度的減小[20-21]。圖6是表示在不同濃度銀杏酚C15∶1溶液的存在下DNA相對粘度的變化。在圖6中,保持DNA和AO的濃度不變,不斷增加銀杏酚的濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著銀杏酚濃度的不斷增加,DNA的粘度逐漸增大,由此可以說明銀杏酚C15∶1與鯡魚精DNA的結(jié)合存在著嵌插作用。

圖6 298 K時(shí)不同濃度的銀杏酚C15∶1對DNA相對粘度的影響Fig.6 Effect of increasing concentrations of Ginkgol on the relative viscosity of DNA at 298 K

2.6 離子強(qiáng)度的影響

離子強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)也是辨別小分子與DNA結(jié)合模式的一種有效的方法。小分子與DNA結(jié)合的三種模式中,溝槽作用和嵌插作用都與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的溝槽有關(guān),只有靜電作用發(fā)生在溝槽之外[22]。DNA中的磷酸骨架帶有負(fù)電荷,NaCl溶液中的Na+會與其產(chǎn)生一種靜電作用力,從而使得DNA的雙鏈更加緊密[23]。當(dāng)小分子與DNA以溝槽方式結(jié)合時(shí),小分子結(jié)合到DNA雙螺旋的溝槽中,使其更容易暴露在溶劑環(huán)境中[24]。而若是小分子與DNA發(fā)生嵌插作用,插入到DNA上下堿基對的小分子受離子強(qiáng)度的影響較小,對周圍的環(huán)境變化不如溝區(qū)結(jié)合敏感。本實(shí)驗(yàn)研究了不同NaCl濃度下,銀杏酚C15∶1對AO-DNA體系熒光強(qiáng)度的變化趨勢,如圖7所示,隨著NaCl濃度的不斷增加,體系的熒光強(qiáng)度并沒有明顯的變化趨勢,因此可以判定,銀杏酚C15∶1與DNA的結(jié)合屬于嵌入式作用。

圖7 離子強(qiáng)度對Ginkgol-AO-DNA熒光光譜的影響Fig.7 Effects of ionic concentration on fluorescence spectra of Ginkgol-AO-DNA注:c(AO)=2.45×10-6 mol/L,c(DNA)=6.73×10-6 mol/L,c(Ginkgol)=1.8×10-6 mol/L。

2.7 DNA熱變性實(shí)驗(yàn)

DNA熱變性溫度的測定也能幫助判斷小分子與DNA的結(jié)合模式。一般說來,小分子若與DNA發(fā)生嵌入作用,則會使DNA的變性溫度升高,而非嵌入作用并不會使DNA的變性溫度明顯升高[25]。本實(shí)驗(yàn)分別測定了AO-DNA體系以及加入銀杏酚C15∶1之后體系從25～97 ℃的熒光強(qiáng)度的變化,并以F25 ℃/F為縱軸,溫度為橫軸作熱變性曲線(如圖8所示),曲線躍遷的中點(diǎn)所處的溫度就是變性溫度。DNA的變性溫度大約為70 ℃[25-26],從圖8得AO-DNA的變性溫度為78 ℃,當(dāng)加入銀杏酚C15∶1之后則降為75 ℃,這可能是因?yàn)殂y杏酚的結(jié)合使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)受到了一定程度的破壞,使得AO與DNA的穩(wěn)定性降低,因此熱變性溫度有所降低。而變性溫度變化較小,也說明嵌插作用性質(zhì)沒有變,即銀杏酚C15∶1與DNA的結(jié)合強(qiáng)度比AO弱。

圖8 AO-DNA在有無Ginkgol存在下的熔解曲線Fig.8 Melting curves of AO-DNA in the absence and presence of Ginkgol注:c(AO)=2.45×10-6 mol/L,c(DNA)=8.19×10-6 mol/L,c(Ginkgol)=2.1×10-6 mol/L。

3 結(jié)論

以吖啶橙(AO)為熒光探針運(yùn)用熒光光譜法研究了銀杏酚C15∶1與DNA的相互作用。結(jié)果表明銀杏酚C15∶1對AO-DNA的猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅,兩者之間的主要作用力為氫鍵作用力。而粘度實(shí)驗(yàn)、離子強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)和熔解實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)銀杏酚C15∶1與DNA的結(jié)合模式是嵌入式結(jié)合,銀杏酚C15∶1嵌入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對中。為銀杏酚的藥用機(jī)理提供一定的理論參考和臨床應(yīng)用依據(jù)。

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Spectroscopic studies on the binding of Ginkgol C15∶1 and Herring Sperm DNA

YANG Xiao-ming1,LIU Pan-jun1,LI Yue-ying2,FANG Yang-yang3,SHI Ya-xiang4

(1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.School of Medicine,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;3.School of Chemistry and Chemical Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;4.Traditional Chinese Hospital,Zhenjiang 212003,China)

Objective:To study the interaction between Ginkgol C15∶1 and Herring Sperm DNA. Methods:The interaction between Ginkgol C15∶1 and Herring Sperm DNA was investigated by fluorescence spectroscopy,viscosity measurements and thermal dissolution assay in the Tris-HCl buffer(pH7.4)at 293 K and 310 K,Acridine Orange(AO)as the fluorescent probe. Results:The fluorescence quenching of Ginkgol C15∶1 by AO-DNA was a static quenching procedure. The main binding force was hydrogen bond force on the basis of thermodynamic parameters,which indicated the interaction between Ginkgol C15∶1 and AO-DNA was intercalation. Conclusions:The results of viscosity measurements and the thermal denaturation experiments further demonstrated that intercalative binding was the main mode between Ginkgol C15∶1 and AO-DNA.

Ginkgol C15∶1;Herring Sperm DNA;fluorescence spectrum

2016-04-14

楊小明(1963-)，女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物提取及活性研究，E-mail：XM_Yang1963@126.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372404)；鎮(zhèn)江市社會發(fā)展基金資助項(xiàng)目(SH2015072)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000