薄荷復(fù)方煎液對致齲菌生長代謝的體外研究

丘創(chuàng)華，李卓成△，孫 墅

(深圳市第二人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科 2.口腔科，廣東深圳 518000)

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·論 著·

薄荷復(fù)方煎液對致齲菌生長代謝的體外研究

丘創(chuàng)華1，李卓成1△，孫 墅2

(深圳市第二人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科 2.口腔科，廣東深圳 518000)

目的 研究薄荷復(fù)方煎液對致齲菌生長及產(chǎn)酸的影響，明確薄荷復(fù)方煎液的抗菌機(jī)制。方法 選擇變形鏈球菌、血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，用紙片擴(kuò)散法測定薄荷復(fù)方煎液對菌株的抑制作用，同時測量不同質(zhì)量濃度薄荷復(fù)方煎液對菌株產(chǎn)酸的影響。結(jié)果 薄荷復(fù)方煎液能有效抑制血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的生長，同時有效抑制各實(shí)驗(yàn)菌株的產(chǎn)酸能力，只是在藥物質(zhì)量濃度上有一定差異。結(jié)論 薄荷復(fù)方煎液對致齲菌的生長和酸代謝具有一定的抑制作用。

齲齒/微生物學(xué)； 培養(yǎng)基; 薄荷復(fù)方煎液； 產(chǎn)酸； 抑制

現(xiàn)代齲病學(xué)認(rèn)為，齲齒在本質(zhì)上是口腔菌群生態(tài)失衡性疾病?？咕幬锏氖褂?、免疫防齲和氟化物防齲等方法雖具有一定的防齲效果，但仍有諸多局限性。本研究選用一些具調(diào)理菌群生長和代謝作用的天然藥物包括薄荷、仙靈脾、露蜂房等中藥，研究其對致齲菌生長和產(chǎn)酸的影響，為今后篩選能有效調(diào)理口腔菌群生態(tài)平衡的藥物提供參考，從而可以制作出更加對癥的、精確的防治藥物。

1 材料與方法

1.1 配制薄荷復(fù)方煎液 組方：薄荷15 g，食鹽(炒，后下)10 g，川椒10 g，仙靈脾10 g，補(bǔ)骨脂15 g，細(xì)辛5 g，白芷10 g，石菖蒲10 g，蚤休20 g，露蜂房10 g。加水1 000 mL，文火煎3 h至約100 mL過濾、離心3次，制成原液。

1.2 選擇致病菌 購買美國變形鏈球菌ATCC25175、血鏈球菌ATCC10556、牙齦卟啉單胞菌ATCC33277各1支。

1.3 制備藥物紙片 選擇新華1號中性定性濾紙，用打孔器打成直徑6 mm圓片，將制作好的濾紙分裝到小西林瓶里，用牛皮紙封瓶口進(jìn)行高壓(121 ℃、15 min)烘干后分別加入薄荷復(fù)方煎液、0.05%氯己定溶液(陽性對照)和0.9%生理鹽水各1 mL，置于冰箱內(nèi)過飽和液體浸泡過夜，取出紙片再置于冷凍真空干燥機(jī)內(nèi)抽干，4 ℃密封保存。

1.4 紙片擴(kuò)散抑菌法 將變形鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌分別接種于腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基中，在80%氮?dú)?N2)、20%二氧化碳(CO2)、37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h，用BHI將菌懸液濃度調(diào)至1.0 McFarland(3×108CFU/mL)備用。將配制好的變形鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌100 μL分別滴入3個牛BHI固體培養(yǎng)基，用三角形波棒推勻后在瓊脂表面放置上述浸藥濾紙片，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。每平皿放置各紙片1片，每次4個平行平皿，80%N2、20%CO2、37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，用卡尺測量抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 薄荷復(fù)方煎液對口腔致齲細(xì)菌產(chǎn)酸水平的影響 將薄荷復(fù)方煎液按倍比稀釋法制成0.125、0.250、0.500、1.000 g/mL，消毒后備用。利用1 mol/L的NaOH將BHI液體培養(yǎng)基調(diào)定初始pH值為7.4。取消毒試管5支，每支試管中加入BHI液體培養(yǎng)基(pH 7.4)4 mL，3×108CFU/mL變形鏈球菌的菌懸液0.2 mL，在1～4號試管中分別加入0.125、0.250、0.500、1.000 g/mL薄荷復(fù)方煎液0.2 mL，5號試管中不加藥液作為對照組。同理測定薄荷復(fù)方煎液對血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)酸水平的影響。

2 結(jié) 果

2.1 薄荷復(fù)方煎液對3種致齲細(xì)菌的抑菌效果 薄荷復(fù)方煎液對血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌的抑菌圈直徑與0.05%氯己定組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對變形鏈球菌抑菌效果較差，與0.05%氯己定比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 薄荷復(fù)方煎液對3種致齲細(xì)菌的抑菌效果比較

*：P<0.05，與0.05%氯己定比較。

2.2 薄荷復(fù)方煎液對3種致齲細(xì)菌產(chǎn)酸的抑制作用 薄荷復(fù)方煎液不同質(zhì)量濃度對3種致齲細(xì)菌產(chǎn)酸具有不同程度的抑制作用。血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)酸隨薄荷復(fù)方煎液質(zhì)量濃度增加而減少，各質(zhì)量濃度組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.500、1.000g/mL薄荷復(fù)方煎液對變形鏈球菌產(chǎn)酸的抑制作用與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，0.125、0.250g/mL薄荷復(fù)方煎液對變形鏈球菌產(chǎn)酸的抑制作用與對照組比較并未發(fā)生明顯改變，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 薄荷復(fù)方煎液對3種致齲細(xì)菌產(chǎn)酸的抑制作用

*：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病，其中變形鏈球菌、粘性放線菌、乳桿菌、血鏈球菌是最主要的病原菌[1]。牙周病是一種常見的多發(fā)的感染性破壞性口腔疾病，是發(fā)生在牙齒支持組織的疾病包括牙周軟、硬組織炎性紊亂與破壞，牙周病證據(jù)最充分的致病菌是伴放線放線桿菌和牙齦卟啉單胞菌。因此本研究選擇變形鏈球菌、血鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌作為研究的細(xì)菌。

越來越多的研究表明，慢性牙周炎的危害已不僅局限于口腔，還與一些全身系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)。牙周感染導(dǎo)致的菌血癥和膿血癥促進(jìn)了全身免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，從而影響系統(tǒng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展。牙齦卟啉單胞菌還能通過降解低密度脂蛋白(LDL)中載脂蛋白(Apo)B-100，引起低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬增加，巨噬細(xì)胞吞噬大量膽固醇后轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，進(jìn)而引起血脂升高，表明牙周感染可導(dǎo)致血脂異常[2]。牙周病患者總膽固醇(TC)和LDL水平升高表明牙周病可能會增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。

牙周病是多細(xì)菌感染性疾病，單一抗生素抗菌譜無法針對全部牙周病的致病菌。因此在牙周病的治療中單純采用甲硝唑無法收到理想療效，阿莫西林、奧美拉唑與甲硝唑聯(lián)合使用可有效擴(kuò)大殺菌范圍，能有效治療敏感菌感染，取得較好的臨床效果[4-6]。但單純應(yīng)用抗生素對于反復(fù)發(fā)作者容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致菌株和菌群比例失調(diào)。中醫(yī)療法強(qiáng)調(diào)標(biāo)本兼治，可補(bǔ)充西醫(yī)治療注重局部清潔抗炎、根治效果不明顯的缺陷，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上結(jié)合中醫(yī)辨證治療，療效顯著優(yōu)于單用西藥治療[7]。天然藥物在齲病防治方面的研究備受關(guān)注，國外研究較多的天然防齲藥物有可可、茶多酚、蜂膠等，國內(nèi)研究較深入的有厚樸、五倍子、蜂房、茶多酚等。黃正蔚等[8]對兒茶、五倍子、蜂房等11種中藥粗提物的抗菌活性、對細(xì)菌代謝產(chǎn)酸和合成胞外多糖能力的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明五倍子、蜂房、三七能全面抑制口腔細(xì)菌代謝酸的產(chǎn)生，五倍子、蜂房、血藤、川芎、大黃、兒茶和三七均能顯著抑制變形鏈球菌胞外水不溶性多糖的生成。楊寧等[9]研究發(fā)現(xiàn)，中藥野黃芩苷具有拮抗脂多糖(LPS)抑制人牙周膜細(xì)胞增殖的作用。曹寅等[10]配制了中藥組方--降糖固齒湯，提取藥液，采用二倍稀釋法進(jìn)行抑制牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌生長實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中藥原液能抑制牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌增長。姜迎春等[11]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物對牙齦卟啉單胞菌具有抑菌作用。

薄荷復(fù)方煎液配方是本院中醫(yī)科專家通過多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得出的包括薄荷、川椒、細(xì)辛、補(bǔ)骨脂、仙靈脾、白芷、石菖蒲等10味中藥，不但有殺菌消炎作用，而且能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力提高牙齒抗病能力，成本很低廉，充分利用了我國博大精深的中醫(yī)理論和豐富的中藥資源防治齲病、牙周病。本研究結(jié)果表明，薄荷復(fù)方煎液對血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌有較好的抑菌作用，其抑菌效果等效于0.05%氯己定；薄荷復(fù)方煎液對變形鏈球菌亦有一定的抑菌作用。

致齲菌通過無氧酵解代謝碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸，在牙菌斑生物膜中使酸性代謝產(chǎn)物積聚，導(dǎo)致釉質(zhì)脫礦，齲損發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，薄荷復(fù)方煎液在各個質(zhì)量濃度梯度時對血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌的產(chǎn)酸均有顯著抑制作用，對變形鏈球菌的產(chǎn)酸抑制作用較弱，只有0.500、1.000g/mL薄荷復(fù)方煎液對變形鏈球菌的產(chǎn)酸具有顯著抑制作用。

本研究結(jié)果顯示，薄荷復(fù)方煎液對血鏈球菌、變形鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌均有明顯的抑制和殺滅作用，已達(dá)到滿意的預(yù)期效果。但具體藥物作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究，后續(xù)通過動物實(shí)驗(yàn)和毒理實(shí)驗(yàn)及臨床試用檢驗(yàn)效果，最終制作出特效的防治齲病、牙周病的漱口水和局部治療齲病、牙周病的藥物。

[1]孟煥新.牙周病學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：58.

[2]LeiL，LiH，YanF，etal.Hyperlipidemiaimpairedinnateimmuneresponsetoperiodontalpathogenporphyromonasgingivalis in apolipoprotein E knockout mice[J].PLoS One，2013，8(8)：e71849.

[3]Sandi RM，Pol KG，Basavaraj P，et al.Association of serum cholesterol，triglyceride，high and low density lipoprotein (HDL and LDL) levels in chronic periodontitis subjects with risk for cardiovascular disease(CVD)：A cross sectional study[J].J Clin Diagn Res，2014，8(1)：214-216.

[4]岑樂.奧美拉唑、阿莫西林合并甲硝唑治療牙周病的臨床分析[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11(21)：193-194.

[5]彭源.奧美拉唑、阿莫西林聯(lián)合甲硝唑治療牙周病的臨床療效觀察[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10(15)：517-518.

[6]胡建立，王寅麗.甲硝唑治療牙周病的臨床觀察[J].中國藥房，2014，25(16):1469-1470.

[7]劉麗華.中西醫(yī)結(jié)合治療牙周病的臨床療效[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2015，31(24)：80-81.

[8]黃正蔚，周學(xué)東，肖悅，等.11種天然藥物對乳酸桿菌生長與產(chǎn)酸影響的體外研究[J].上海口腔醫(yī)學(xué)，2005，14(1)：67-70.

[9]楊寧，張瑩，葛志華，等.野黃芩苷拮抗內(nèi)毒素抑制人牙周膜細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2010，20(1)：14-17.

[10]曹寅，張琪，徐燕，等.降糖固齒湯抑制牙周致病菌實(shí)驗(yàn)的研究[J].口腔醫(yī)學(xué)，2012，32(10)：622-624.

[11]姜迎春，李含薇，李詠梅，等.銀杏葉提取物對牙齦卟啉單胞菌的體外抑菌作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，40(5)：1018-1023.

Effect of Menthol compound decoction on the growth and metabolism of cariogenic bacteria in vitro*

QiuChuanghua1，LiZhuocheng1△，SunShu2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofDentisty，ShenzhenSecondPeople′sHospital，Shenzhen,Guangdong518000,China)

Objective To investigate the effect of menthol compound decoction on the growth and acid metabolism of cariogenic bacteria and to find out the anticariogenic mechanism of Menthol compound decoction.Methods Streptococcus mutans,Streptococcus sanguinis and Porphyromonas gingivalis were chosen as the experimental bacteria.Firstly，slip diffusion method was used to examine the inhibitory effect of menthol compound decoction on cariogenic bacteria.Secondly，observing the effect of menthol compound decoction of different concentration on acid metabolism.Results Menthol compound decoction could inhibit the growth of Streptococcus sanguinis and Porphyromonas gingivalis.And it also inhibited the acid production of cariogenic bacteria，but the concentration of menthol compound decoction were different.Conclusion Menthol compound decoction may have an inhibitory effect on the growth and acid metabolism of cariogenic bacteria.

dental caries/microbiology； culture media； menthol compound decoction; acid metabolism; inhibitory

深圳市科技創(chuàng)新委員會資助項(xiàng)目(JCYJ20130401114747777)。 作者簡介：丘創(chuàng)華，男，臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)碩士，主要從事臨床血液學(xué)的研究?！?/p>

E-mail：lizhuocheng@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.005

A

1673-4130(2016)02-0155-03

2015-09-02)