兒童肺炎支原體感染及耐藥檢測與分析*

劉調俠 張曉瓚 李延琴

(銅川市婦幼保健院 1.兒科；2.檢驗科， 陜西 銅川 727007)

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·論著·

兒童肺炎支原體感染及耐藥檢測與分析*

劉調俠1張曉瓚2李延琴1

(銅川市婦幼保健院 1.兒科；2.檢驗科， 陜西 銅川 727007)

目的 分析肺炎患兒中肺炎支原體(MP)的感染及耐藥情況，并探討其臨床特點及基因分型特征，為臨床合理選擇抗生素提供理論依據(jù)。方法 收集2015年1月至2015年12月銅川市婦幼保健院兒科以發(fā)熱、咳嗽等呼吸道癥狀首診確定MP感染的住院患兒120例。通過肺炎支原體抗體檢測、體外培養(yǎng)及核酸檢測了解肺炎支原體感染狀況，測定多種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC值),分離出耐藥菌株。根據(jù)藥敏試驗鑒定結果分為耐藥組(n=98)和非耐藥組(n=22)，比較耐藥組與非耐藥組患兒臨床特征；將耐藥組98例患兒依據(jù)初選抗生素種類分為初選阿奇霉素或紅霉素組(n=78)和初選頭孢或青霉素類(n=20)，比較兩組患兒的臨床特點。將耐藥菌株的23SrRNA基因序列與標準珠相比對，研究耐藥菌株的23SrRNA基因突變位點。結果 120例經(jīng)臨床診斷為MP肺炎的患兒中，98例體外藥敏試驗結果提示為耐藥支原體肺炎，對大環(huán)內酯類藥物高度耐藥。耐藥組發(fā)熱時間、住院時間及給予大環(huán)內酯類藥物(阿奇霉素)后發(fā)熱時間均較非耐藥組長(P<0.05)，兩組間年齡、呼吸道癥狀時間、白細胞計數(shù)(WBC)、中性粒細胞比例、C反應蛋白(CRP)、血沉(ESR)、影像所見好轉時間、大環(huán)內酯類抗生素(ML)總療程比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。耐藥組與非耐藥組之間預后比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中非耐藥組痊愈患兒比例高于耐藥組。98例耐藥支原體肺炎中初選頭孢或青霉素類抗生素組20例，治療中更改為大環(huán)內酯類抗生素的平均時間為病程第(5.2±1.8)天。初選不同治療藥物兩組在呼吸道癥狀持續(xù)時間、使用大環(huán)內酯類抗生素后發(fā)熱時間、白細胞計數(shù)等指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肺炎支原體核糖體23S rRNA全序列分析：其中約90%耐藥MP株發(fā)生了2063位A→G(A2063G)的突變，少數(shù)MP耐藥株發(fā)生了 A2064G(約5%)、A2063C、C2617G/A 的突變。結論 銅川地區(qū)2015年支原體肺炎患兒對大環(huán)內酯類抗生素耐藥現(xiàn)象嚴重，其耐藥機制主要與2063位A→G(A2063G)的點突變有關。非耐藥組患兒預后好于耐藥組。MP快速鑒定培養(yǎng)與直接藥敏試驗方法標本獲取容易，檢測技術操作簡單，檢測結果可為臨床診療提供科學依據(jù)。

肺炎支原體； 感染； 兒童； 耐藥機制

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)是患兒急性上、下呼吸道感染的常見病原體之一。研究表明，肺炎支原體肺炎具有年齡分布特征和季節(jié)性，不同國家和地區(qū)的發(fā)病率差別較大。兒童MP感染主要以大環(huán)內酯類藥物治療為主；近年來關于MP耐藥現(xiàn)象的報道較多[1]。本研究通過對銅川地區(qū)住院肺炎患兒肺炎支原體感染及耐藥檢測與分析，以期對臨床MP肺炎的診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2015年1月至2015年12月以發(fā)熱、咳嗽等呼吸道癥狀首診確定MP感染的住院患兒120例，其中男性患兒64例(53.33%)，女性患兒56例(46.67%)。MP肺炎診斷標準依據(jù)《諸福棠實用兒科學》第7版診斷標準，有發(fā)熱、持續(xù)劇烈咳嗽、肺部啰音等呼吸道癥狀及體征，伴胸部影像學單側或雙側異常改變，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺炎支原體抗原陽性，青霉素或頭孢類抗生素治療無效，病程初期未發(fā)現(xiàn)其他病原感染的證據(jù)。排除標準：①體液和細胞免疫異常。②正在接受免疫抑制劑治療。③既往患支氣管哮喘、反復呼吸道感染、先天性或繼發(fā)性免疫抑制或缺陷、腎臟或肝臟疾病、心血管疾病及結締組織疾病等，既往1個月內接受住院治療。④既往有重癥肺炎病史仍未痊愈。⑤病歷資料不完整。納入本研究的病例均已獲患兒家屬知情同意。依據(jù)是否耐藥分為耐藥組(n=98)和非耐藥組(n=22)；依據(jù)98例耐藥支原體肺炎按初選抗生素種類分為初選阿奇霉素或紅霉素組(n=78)及初選頭孢或青霉素類抗生素組(n=20)。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑 TGL-16G型臺式高速離心機、Bio-rad公司Opticon 2 PCR擴增儀、GeneAmp PCR System9600、HB-100型電熱恒溫水槽、ELX-800酶標儀、Milli-Q純水系統(tǒng)、DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、PCR擴增試劑、MP-IgM檢測試劑盒、DNA提取試劑盒、MP快速液體培養(yǎng)基、MP標準株MP-129。

1.2.2 標本采集 所有患兒在入院后24 h內完成標本的采集,抽取外周血2 ml用于ELISA法檢MP-IgM抗體，用無菌生理鹽水浸濕的無菌咽拭子適度用力刮拭患兒咽后壁,標記后行MP培養(yǎng)和MP-PCR檢測。

1.2.3 檢測方法 ①酶聯(lián)免疫吸附法試驗(ELISA)檢測MP-IgM抗體:按照深圳博卡生物有限公司提供的試劑盒說明書進行操作及結果的判定。②MP快速液體培養(yǎng)法：液體培養(yǎng)基在使用前置于4 ℃保存,用時移至室溫待培養(yǎng)基融化后使用。應注意MP對熱和干燥敏感,取材后應立即接種,若置于轉運培養(yǎng)基中,4 ℃能保存72 h。 所有患兒采取標本前用溫水漱口,然后用無菌生理鹽水浸濕的咽拭子在患兒口腔咽后壁捻轉數(shù)次,60 min內送至實驗室,小心取出棉拭子,置于含培養(yǎng)基的小瓶中,攬動棉拭子數(shù)次,再把棉拭子對著瓶壁,盡量擠壓出其中液體,取出棉拭子棄至醫(yī)療垃圾桶中。蓋上瓶塞,置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h即可觀察結果，待培養(yǎng)基顏色由紅轉黃且無明顯沉淀物時，判斷為肺炎支原體培養(yǎng)陽性。利用九種抗生素的高低濃度在體外對微生物生長的抑制作用,對微生物作耐藥性進行分析,采用珠海市銀科醫(yī)學工程股份有限公司生產(chǎn)的MP 培養(yǎng)藥敏試劑盒，嚴格按說明書進行操作。③肺炎支原體PCR檢測：向咽拭子中加入4倍體積的生理鹽水，用1 ml移液器反復吹打后置4 ℃冰箱。用移液器混勻后吸取1～1.5 ml離心管中。12 000 rpm離心5 min后棄上清；在沉淀中加入50 μL的DNA提取液充分混均。100 ℃恒溫處理10 min;12 000 rpm離心5min后保存于-20 ℃冰箱中備用。2×緩沖液10.0 μL，10.0 μmol/L 的引物 P3 1.0 μL，10.0 μmol/L 引物 P4 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。反應條件及循環(huán)：93 ℃變性2 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；75 ℃延伸5 min。熒光測定PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒回收，采用T Easy載體連接體系克隆，4 ℃連接過夜。轉化感受態(tài)細胞，藍白斑篩選。采用Blast功能進行序列分析，挑選測序結果一致的克隆提取質粒備用。巢式PCR：2×緩沖液10.0 μL，40×Assay Mix(含P3，P4，T3和T4各0.5 μL)，DNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，總體積20.0 μL。反應條件及循環(huán)：95 ℃ 1 min，92 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。收集擴增前，擴增時，擴增后熒光信號，采用SDS 軟件獲得標準曲線。④肺炎支原體核糖體23s全序列分析：利用外引物MN23SDVF、MN23SDVR和巢式引物MN23SF1812、MN23SR2152進行擴增,PCR產(chǎn)物采用雙向測序。測得序列與NCBI已登錄的MP標準珠MP129 23SrRNA基因相比對。產(chǎn)物由華大基因科技有限公司進行測序。采用DNAstar軟件與肺炎支原體M129(GenBank Accession No．X68422)進行序列比對分析。

1.3 觀察指標

1.3.1 記錄患兒的一般臨床資料 性別、年齡、住院天數(shù)、發(fā)熱時間、呼吸道癥狀持續(xù)時間、初起選擇抗生素的種類、病程中更換為大環(huán)內酯類抗生素的時間，使用大環(huán)內酯類抗生素后發(fā)熱時間、大環(huán)內酯類抗生素的使用時間等。

1.3.2 記錄相關輔助檢查結果 白細胞總數(shù)、中性粒細胞比例、C反應蛋白、血沉、肺炎支原體抗體結果、咽拭子肺炎支原體PCR結果、肺炎支原體培養(yǎng)結果及MIC值等，胸部影像學表現(xiàn)及影像學指標好轉時間。

1.3.3 療效判斷 療效分痊愈，顯效，進步，無效4級。痊愈:初始治療2周內體溫、呼吸道癥狀及體征正常,實驗室檢查血象、CRP均恢復正常;顯效:體溫呈下降趨勢,但呼吸道癥狀、體征，實驗室檢查均未完全恢復正常;進步:體溫不退,但呼吸道癥狀、體征、實驗室檢查中至少有一項改善;無效:體溫不降,呼吸道癥狀體征、實驗室檢查無改善,或一度改善又惡化。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料采用2檢驗，計量資料用t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 120例經(jīng)臨床診斷為MP肺炎的患兒中，血清MP-IgM抗體檢測均為陽性。113例咽拭子肺炎支原體PCR檢測陽性；其余7例PCR檢測陰性，PCR檢測陰性者咽分泌物支原體培養(yǎng)陽性。咽分泌物支原體培養(yǎng)陽性者為101例。98例體外藥敏試驗結果提示為耐藥支原體肺炎，對大環(huán)內酯類藥物高度耐藥。體外藥敏實驗結果見表1。

表1 120例MP肺炎患兒感染樣本的藥敏試驗結果(MIC值，mg/L)

2.2 MP肺炎耐藥組與非耐藥組臨床特點比較 兩組患兒的臨床表現(xiàn)及檢驗結果顯示，耐藥組發(fā)熱時間、住院時間及給予大環(huán)內酯類藥物(阿奇霉素)后發(fā)熱時間均較非耐藥組長(P<0.05)；兩組間年齡、呼吸道癥狀時間、白細胞計數(shù)(WBC)、中性粒細胞比例、C反應蛋白(CRP)、血沉(ESR)、影像所見好轉時間、大環(huán)內酯類抗生素(ML)總療程比較均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 初選阿奇霉素或紅霉素組和初選頭孢或青霉素類抗生素組臨床特點比較 初選頭孢或青霉素類抗生素組20例，治療中更改為大環(huán)內酯類抗生素藥物的平均時間為病程第(5.2±1.8) d。兩組比較后發(fā)現(xiàn)在呼吸道癥狀持續(xù)時間、使用大環(huán)內酯類抗生素后發(fā)熱時間、白細胞計數(shù)等指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

Table 2 Clinical features of resistant group and non-resistant group

臨床指標 耐藥組(n=98)非耐藥組(n=22)P年齡(歲)8±37±40.518發(fā)熱時間(d)11±48±50.007呼吸道癥狀時間(d)18±516±40.085WBC(×109/L)7±48±40.176中性粒細胞比例0.68±0.740.61±0.830.457CRP(mg/L)11.01±18.2313.0±20.610.972ESR(mm/h)25±1322±140.682胸部影像所見好轉時間(d)14±313±50.661住院時間(d)12±38±40.001ML總療程10±39±50.438用ML后發(fā)熱時間(d)8±36±40.042

2.4 耐藥組與非耐藥組患兒預后比較 耐藥組與非耐藥組之間預后的比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中非耐藥組痊愈患兒比例高于耐藥組(P<0.05)，見表4。

Table 3 Clinical characteristics of children with different antibiotics resistance of mycoplasma pneumonia primaries

臨床指標初選抗生素為阿奇霉素或紅霉素(n=78)初選抗生素為青霉素類或頭孢類(n=20)P年齡(歲)8±28±50.237發(fā)熱時間(d)10±611±60.681呼吸道癥狀時間(d)19±517±40.046WBC(×109/L)6±411±60.000中性粒細胞比例0.65±0.750.71±0.810.262CRP(mg/L)10.98±16.2311.51±20.610.074ESR(mm/h)26±1323±140.922胸部影像所見好轉時間(d)14±314±40.939住院時間(d)13±311±40.159ML總療程10±310±50.249用ML后發(fā)熱時間(d)9±35±40.009

表4 耐藥組與非耐藥組患兒預后比較

Table 4 prognosis of resistance group and non-resistant group

預后耐藥組(n=98)非耐藥組(n=22)P痊愈30(30.61)14(63.64)①0.027顯效39(39.79)6(27.28)進步20(20.41)1(4.54)無效9(9.19)1(4.54)

注：與耐藥組比較，P<0.05

2.5 肺炎支原體核糖體23S rRNA全序列分析 約90%耐藥MP株發(fā)生了2063位A→G(A2063G)的突變，少數(shù)MP耐藥株發(fā)生了 A2064G(約5%)、A2063C、C2617G/A 的突變，而且A2063G/C和 A2064G 的突變能引起 MP 對紅霉素產(chǎn)生高水平耐藥，并對其他大環(huán)內酯類發(fā)生交叉耐藥。

3 討論

肺炎支原體(MP)是介于細菌與病毒之間,無細胞壁的一類原核細胞型生物，其已成為兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見病原體之一。因為缺乏細胞壁結構,對β-內酞胺類、糖肽類和磺胺類等抗生素固有耐藥[2]。既往認為肺炎支原體對大環(huán)內酯類藥物敏感性高，無耐藥性產(chǎn)生。2000年Okazaki等[3]首次在兒童患者體內分離到對大環(huán)內酯類抗生素耐藥的MP。隨后國內外相繼報道了在臨床標本中尤其兒童患者中分離得到對大環(huán)內酯類抗生素耐藥的MP[4-7]。德國報道MP的耐藥率為3%[8]；我國北京地區(qū)報道兒童MP的耐藥率>80%[9]。本研究中支原體肺炎患兒耐藥率為81.67%(98/120),可見本地區(qū)支原體耐藥現(xiàn)象亦十分嚴重。

引起微生物對大環(huán)內酯類抗生素耐藥的主要機制是:①靶位改變: 基因突變或甲基化。②主動外排。③藥物滅活。基因點突變導致的靶點改變是肺炎支原體對大環(huán)內酯類耐藥的最重要原因。23S rRNA 結構域V區(qū)和II區(qū)與抗生素直接結合的堿基點突變可導致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥[10-15]。既往文獻報道的基因突變集中在23SrRNA V區(qū)2063或2064位點基因顛換或轉換,主要表現(xiàn)為A2063G、A2063C和A2064G發(fā)生點突變,以A2063G最為常見[16-18]。本研究中約90%耐藥MP株發(fā)生了2063位A→G(A2063G)的突變，少數(shù)MP耐藥株發(fā)生了 A2064G(約5%)、A2063C、C2617G/A 的突變，而且A2063G/C和 A2064G 的突變能引起 MP 對紅霉素產(chǎn)生高水平耐藥，并對其他大環(huán)內酯類發(fā)生交叉耐藥?？梢姾颂求w23S rRNA A2063G核苷酸點突變仍是引起肺炎支原體對紅霉素耐藥的主要機制。

本研究顯示耐藥組發(fā)熱時間和給予大環(huán)內酯類藥物(阿奇霉素)后發(fā)熱時間均較非耐藥組長，提示耐藥組患兒病情相對更嚴重，發(fā)熱時間更長。兩組間年齡、呼吸道癥狀時間、白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例、C反應蛋白、血沉、影像所見好轉時間、大環(huán)內酯類藥物總療程等方面比較并無差異。耐藥組住院時間明顯延長，考慮與耐藥組患者病程中發(fā)熱時間及使用大環(huán)內酯類藥物后發(fā)熱時間均較非耐藥組患兒延長有關。

在病程初期，在白細胞計數(shù)較正常升高的病例治療上，醫(yī)生往往更易選擇頭孢或青霉素類抗生素，因此大環(huán)內酯類藥物的初始給藥時間較晚。初選頭孢及青霉素類藥物組，比初選大環(huán)內酯類抗生素的患兒用大環(huán)內酯類藥物后發(fā)熱時間較短，差異有統(tǒng)計學意義，提示初選頭孢及青霉素類藥物對耐藥支原體肺炎患兒的發(fā)熱程度影響并不明顯。病程初期使用非有效抗生素(頭孢或青霉素類)者住院時間無明顯延長，提示其對治療效果的影響不明顯。本研究提示非耐藥組患兒預后好于耐藥組，而耐藥組治療無效病例高于耐藥組，但并無統(tǒng)計學意義，此部分病例為重癥耐藥支原體肺炎，其研究還有待于進一步完善。目前支原體肺炎耐藥率較高，對于是否可繼續(xù)使用大環(huán)內酯類抗生素治療仍有爭議[19]。目前國內外治療選擇仍以阿奇霉素和紅霉素為主，必要時予腎上腺皮質激素等免疫治療。

在耐藥支原體感染十分嚴重的現(xiàn)狀下，支原體肺炎治療過程中應盡早使用不同的診斷方法，及時判斷病情程度，以減輕患兒組織器官的損害，縮短病程，盡量避免肺內外并發(fā)癥的發(fā)生[20]。MP快速鑒定培養(yǎng)與直接藥敏試驗方法標本獲取容易，檢測技術操作簡單，檢測結果可為臨床診療提供科學依據(jù)。針對耐藥支原體感染的病原學和發(fā)病機制以及有效的治療仍有待于進一步研究。

4 結論

銅川地區(qū)2015年支原體肺炎患兒對大環(huán)內酯類抗生素耐藥現(xiàn)象嚴重，其耐藥機制主要與2063位A→G(A2063G)的點突變有關。非耐藥組患兒預后好于耐藥組。MP快速鑒定培養(yǎng)與直接藥敏試驗方法標本獲取容易，檢測技術操作簡單，檢測結果可為臨床診療提供科學依據(jù)，應在臨床推廣應用。

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(收稿： 2016-05-16； 修回： 2016-08-08； 編輯： 張文秀)

The infection of mycoplasma pneumoniae, detection and analysis of drug resistance in children

LIU Diaoxia1, ZHANG Xiaozan2, LI Yanqin1

(1.DepartmentofPediatrics,TongchuanMaternalandChildHealthCareCenter,Tongchuan727007,Shanxi,China;2.ClinicalLaboratory,TongchuanMaternalandChildHealthCareCenter,Tongchuan727007,Shanxi,China)

Objective To analyze the infection and drug resistance of mycoplasma pneumoniae in children, explore its clinical characteristics and genotyping feature, and provide a theoretical basis for the selection of antibiotic. Methods 120 children of mycoplasma pneumoniae pneumonia were enrolled. The infection of mycoplasma pneumoniae was explored by detection of mycoplasma pneumoniae antibody and nucleic acid. The MIC value of multiple antimicrobial drugs was tested. The drug-resistant strains was isolated. The children were divided into drug resistance group and non- drug resistance group by drug-resistant results. The clinical features drug resistance group and non- drug resistance group were compared. The gene sequence of 23SrRNA of drug-resistant strains and non- drug resistance group were detected.Results 98 cases were drug-resistant pneumonia according to susceptibility test results in vitro, which were highly resistant to macrolides .The time of fever and hospitalization in drug resistance group were longer than that of non-drug resistance group (P<0.05). The age, duration of symptoms of respiratory tract, white blood cell count (WBC), neutrophil percentage, C-reactive protein (CRP), erythrocyte sedimentation rate (ESR), the image seen better times, period of treatment with macrolides (ML) showed no statistical significance between the two groups. The prognosis was statistically significant (P<0.05) between drug resistance group and non-drug resistance group. The proportion of healed cases in non-drug resistance group was higher than that of the drug resistance group. The time of change the treatment with macrolide antibiotics was (5.2±1.8) d. The duration of respiratory symptoms, time of fever, white blood cell counts and other indicators were statistically significant in groups of different treatment. There were 90% of mutations occurred A2063G in drug-resistant strains and 5% occurred A2064G, A2063C and C2617G/A.Conclusion MP is widely prevalent in children and its resistance to MLs is serious in the region of Tongchuan of the year of 2015. Its principal mechanism of resistance were 2063 A→G (A2063G) of point mutations. Non-drug resistance group of children has a better prognosis than drug resistance groups. Rapid culture identification of MP and drug susceptibility testing meet clinical requires of easy collection and simple handling and provide scientific rationals for clinical diagnosis and treatment.

Mycoplasma pneumoniae； Infection； Children； Mechanism of drug resistance

陜西省科技攻關課題(CX14A016)

R 735+.2；R 725.6

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.031