藍(lán)光照射人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度促進(jìn)凋亡的機(jī)制

朱紅娜　喬瑛　蘇安樂　張婷　柏凌　梁厚成

1.西安市第一醫(yī)院眼科,陜西西安710002；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科,陜西西安710004

藍(lán)光照射人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度促進(jìn)凋亡的機(jī)制

朱紅娜1喬瑛1蘇安樂1張婷1柏凌2梁厚成1

1.西安市第一醫(yī)院眼科,陜西西安710002；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科,陜西西安710004

目的觀察藍(lán)光對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡的影響并探討其可能機(jī)制。方法細(xì)胞株分為藍(lán)光照射組和對照組。藍(lán)光照射組,利用35 W白色冷光燈加用藍(lán)色濾光片建立藍(lán)光損傷體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞模型,藍(lán)光控制波長范圍470～520 nm,光照強(qiáng)度在2000 lx左右,光照時(shí)間24～96 h,實(shí)驗(yàn)過程中保證光照在細(xì)胞培養(yǎng)孵箱內(nèi)密進(jìn)行。對照組為常規(guī)避光孵箱培養(yǎng)細(xì)胞,除無光線照射外,各培養(yǎng)條件相同。利用流式細(xì)胞儀檢測RPE細(xì)胞的凋亡變化,利用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。結(jié)果與對照組比較,藍(lán)光照射組的RPE細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05)；照射組的RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加（P＜0.05)；通過特異性抑制L型電壓依賴性鈣離子通道功能降低RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,在一定程度上降低了藍(lán)光引起的RPE細(xì)胞凋亡。結(jié)論藍(lán)光可以通過增加RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度促進(jìn)RPE細(xì)胞的凋亡,L型電壓依賴性鈣離子通道有望成為治療年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病的新靶點(diǎn)。

藍(lán)光;人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞;凋亡;細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

年齡相關(guān)性黃斑變性的病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全闡明且療效欠佳,是引起中老年人發(fā)生視力缺損甚至致盲的主要疾病之一[1-2]。因此,研究年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病機(jī)制有重要意義。年齡相關(guān)性黃斑變性與視網(wǎng)膜光損傷有相似的病理過程,視網(wǎng)膜光損傷是研究年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病的良好模型[3]。已有研究證實(shí),光損傷過程中,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的凋亡增加,且損傷程度和光暴露的劑量成正比,但其具體機(jī)制還未闡明[4-5]。近年來大量文獻(xiàn)報(bào)道,作為重要的第二信使,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度對參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、礦化、自噬和凋亡等過程,而鈣離子通過L型電壓依賴性鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞是鈣離子進(jìn)入RPE細(xì)胞的主要方式[6-7]。本研究通過藍(lán)光照射體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,檢測其凋亡水平的變化及細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平,以探究光暴露對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡的影響和可能的機(jī)制,旨在為年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株（ARPE-19細(xì)胞株)購自美國模式菌種收集中心（ATCC)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶和雙抗等細(xì)胞培養(yǎng)試劑（美國hyclone公司)；胎牛血清（中國四季青公司)；流式細(xì)胞儀（美國B&D公司)；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5)；熒光標(biāo)記鈣離子探針Fluo-3AM（中國碧云天公司)；L型鈣離子通道阻斷劑nifedipine（以色列Alomone Lab公司)；Annexin-V/PI凋亡試劑盒（美國Roche公司)；其他耗材及試劑均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)細(xì)胞,所用試劑如上所述,取5～10代ARPE-19細(xì)胞株用于實(shí)驗(yàn)。參照蔡善君等[5]建模方法,去上述5～10代的ARPE-19細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行藍(lán)光照射。光照條件為35 W白色冷光燈加用藍(lán)色濾光片,控制波長范圍470～520 nm,光照強(qiáng)度在2000 lx左右,光照時(shí)間從24～96 h。

1.2.2人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡檢測將分組處理過的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗3遍,胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,再用預(yù)冷的PBS清洗2遍；隨后利用Binding Buffer緩沖液制備1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液；在上述細(xì)胞懸液中加入5 μg Annexin V試劑,吹打均勻后,室溫反應(yīng)10 min；加入5 μL Annexin V-FITC和/或PI,輕輕混勻,室溫避光放置15 min[8-9]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.2.3鈣離子成像檢測RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度利用Fluo-3AM對RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度進(jìn)行檢測。將處理后培養(yǎng)在6孔板中的細(xì)胞取出后,配制細(xì)胞沖洗液進(jìn)行細(xì)胞洗滌,常規(guī)孵箱中孵育35 min。隨后用細(xì)胞沖洗液洗滌2次,再次孵箱孵育10 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)射波長為525 nm,激發(fā)波長為488 nm。在隨即視野中選取50個(gè)細(xì)胞掃描其Ca2+的熒光強(qiáng)度并用FV10-ASW1.7 Viewer軟件進(jìn)行分析[10]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度將培養(yǎng)的RPE細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化并制備成單細(xì)胞懸液,Fluo-3AM對RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子標(biāo)記方法同上,最后制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,上流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)條件同上。利用BD公司的BD FACSDiva和BECKMAN公司EXPO32軟件對測得的熒光強(qiáng)度及細(xì)胞的陽性率進(jìn)行分析[7]。每組檢測的細(xì)胞量在10000個(gè)以上,實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.2.5nifedipine孵育RPE細(xì)胞利用二甲基亞砜將購得的L型鈣離子通道阻斷劑nifedipine粉末配成10 mmol/L的濃縮溶劑,在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)再利用正常細(xì)胞培養(yǎng)基將此濃縮液稀釋為工作濃度10 μmol/L。藍(lán)光照射組細(xì)胞保證在藍(lán)光照射下在培養(yǎng)孵箱內(nèi)培養(yǎng)；藍(lán)光照射+nifedipine組為藍(lán)光照射的同時(shí)利用上述配制的工作液培養(yǎng)細(xì)胞；對照組為常規(guī)避光孵箱培養(yǎng)細(xì)胞,除無光線照射外,各培養(yǎng)條件同藍(lán)光照射組。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

圖1　流式細(xì)胞儀檢測藍(lán)光照射對RPE細(xì)胞凋亡的影響

2.1藍(lán)光照射促進(jìn)RPE細(xì)胞凋亡

研究組先利用Annexin V/PI凋亡試劑盒將細(xì)胞進(jìn)行染色處理,隨后利用流式細(xì)胞儀檢測藍(lán)光照射后RPE細(xì)胞的凋亡變化,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,藍(lán)光照射后RPE細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.05)。見圖1。

2.2藍(lán)光照射增加RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

為了驗(yàn)證藍(lán)光照射后RPE細(xì)胞凋亡和RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的關(guān)系,采用Fluo-3AM標(biāo)記RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子,在共聚焦顯微鏡下檢測藍(lán)光照射對RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響。與對照組比較,藍(lán)光照射組熒光強(qiáng)度增高。定量比較結(jié)果表明,藍(lán)光照射后RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是對照組RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的2.5倍（P＜0.05)（圖2a)。流式細(xì)胞儀來檢測藍(lán)光對RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響,結(jié)果表明:與對照組比較,藍(lán)光照射組熒光強(qiáng)度增高（P＜0.05)（圖2b)。

2.3nifedipine可以減少藍(lán)光照射引起的RPE細(xì)胞凋亡

在藍(lán)光照射時(shí)在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L的nifedipine,在處理后利用流式細(xì)胞儀檢測各組RPE細(xì)胞凋亡情況。與對照組比較,藍(lán)光照射組RPE細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.05)；與藍(lán)光照射組比較,藍(lán)光照射+nifedipine組RPE細(xì)胞凋亡減少（P＜0.05),但與對照組比較,其凋亡增加（P＜0.05)。見圖3。

圖2　藍(lán)光照射對RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

圖3　藍(lán)光條件下檢測降低RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度對RPE細(xì)胞凋亡的影響

3　討論

年齡相關(guān)性黃斑變性是引起中老年人發(fā)生視力缺損的主要疾病之一,該病的發(fā)生發(fā)展與長期累積的光暴露損傷相關(guān)[11]。人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有視色素轉(zhuǎn)運(yùn),轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)成分和清除自由基等功能,RPE細(xì)胞功能的正常對維持視網(wǎng)膜的功能和結(jié)構(gòu)有重要意義[4,12]。已有研究證實(shí),光損傷過程中,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的有不同程度的損傷,蔡莉等[4]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光對RPE細(xì)胞的損傷呈光照強(qiáng)度及光照時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)觀察到藍(lán)光照射后RPE的凋亡明顯增加,這與之前研究相符。

近年來大量文獻(xiàn)報(bào)道,作為重要的第二信使,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度對參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、礦化、自噬和凋亡等過程。細(xì)胞內(nèi)正常濃度的鈣離子對于細(xì)胞各項(xiàng)活動(dòng)的維持至關(guān)重要。在高糖、缺氧和某些藥物等刺激因素存在時(shí),細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加,引起鈣超載,從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[13-16]。在本實(shí)驗(yàn)中,本研究組經(jīng)過鈣離子敏感的熒光染料Fluo-3AM的預(yù)染,經(jīng)過激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀的檢測發(fā)現(xiàn),藍(lán)光照射后,RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度明顯增加,且在藍(lán)光照射的整個(gè)過程和檢測過程中,RPE細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度持續(xù)保持高水平。細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子的來源有兩個(gè),細(xì)胞外鈣離子通過離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞內(nèi)的鈣庫釋放,但內(nèi)鈣的釋放主要是以脈沖的形式,短時(shí)間內(nèi)使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生大幅度的增加[17-18]；而細(xì)胞外的鈣離子主要是通過細(xì)胞表面的L型電壓依賴型鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞[19-21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證藍(lán)光照射引起RPE細(xì)胞凋亡增加和RPE細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度高水平的關(guān)系,研究組在藍(lán)光照射的同時(shí)加用特異性L型電壓依賴型鈣離子通道阻滯劑nifedipine,發(fā)現(xiàn)雖然沒有恢復(fù)正常對照水平,但藍(lán)光照射引起RPE細(xì)胞凋亡減少。這說明阻斷RPE細(xì)胞上L型電壓依賴型鈣離子通道,降低其細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,能夠減少藍(lán)光對RPE細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用,發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

盡管如此,本研究也存在一些不足之處:實(shí)驗(yàn)只是離體驗(yàn)證了藍(lán)光對RPE細(xì)胞凋亡的影響及初步探討了可能的機(jī)制,并未在動(dòng)物模型中驗(yàn)證結(jié)論,在接下來的實(shí)驗(yàn)中,研究組將致力于克服在體觀察RPE細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等技術(shù)難題,在動(dòng)物模型中驗(yàn)證本研究的結(jié)論；藍(lán)光照射引起RPE細(xì)胞凋亡增加的其他原因和光暴露對RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高的原因仍有待進(jìn)一步研究與探索。

綜上所述,藍(lán)光可以通過增加RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度促進(jìn)RPE細(xì)胞的凋亡,本實(shí)驗(yàn)從光化學(xué)損傷促進(jìn)RPE細(xì)胞凋亡的角度,探討了光暴露對RPE細(xì)胞凋亡的影響,一定程度上對治療藍(lán)光損害視網(wǎng)膜眼病提供了指導(dǎo)意義。

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Blue light promotes apoptosis of human retinal pigment epithelial cells by up-regulation of intracellular calcium concentration

ZHU Hongna1QIAO Ying1SU Anle1ZHANG Ting1BO Ling2LIANG Houcheng1
1.Department of Ophthalmology,Xi'an First Hospital,Shaanxi Province,Xi'an710002,China;2.Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province,Xi'an710004,China

Objective To investigate the influence and mechanism of blue light on the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells.Methods Cells were divided into blue light group and control group.35 W white light lamp with blue filter was used to establish damaged RPE cell model in vitro,blue ray wave length ranged 470-520 nm,and the light intensity was about 2000 lx,light exposure time was set to 24-96 h,in the experimental process,the light was carried out in the cell culture incubation box.The control group cells were cultured in the conventional light avoidance incubator,and the culture conditions were as the same as the blue light group except without light.After exposure to blue light,the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells was tested by flow cytometry.And then the intracellular calcium concentration of human retinal pigment epithelial cells was measured by flow cytometry and laser scanning confocal microscope.Results Compared with control group,the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells increased in blue light group(P＜0.05),and the intracellular calcium concentration of human retinal pigment epithelial cells increased(P＜0.05).The intracellular calcium concentration of human RPE cells decreased by specific inhibition of L-type voltage-dependent calcium channel,RPE cell apoptosis caused by blue light decreased.Conclusion Blue light promotes apoptosis of human retinal pigment epithelial cells by the up-regulation of intracellular calcium concentration. [Key words]Blue light;Human retinal pigment epithelial cells;Apoptosis;Intracellular calcium concentration

R774.1

A

1673-7210(2016)06(b)-0004-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30901644)。

信息]朱紅娜（1983.10-),碩士；研究方向:眼底病學(xué)。

梁厚成（1963.1-),博士,主任醫(yī)師；研究方向:眼底病學(xué)。

（2016-03-16本文編輯:蘇暢)