高溫脅迫對(duì)野扇花植株生長(zhǎng)及葉中生理生化指標(biāo)和極性代謝產(chǎn)物的影響

張俊波，李志怡，孫 清，杜紅梅

(1.上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院，上海 200240；2.上海市閔行區(qū)三農(nóng)綜合服務(wù)中心，上海 201109)

野扇花(SarcococcaruscifoliaStapf)，又名清香桂，為常綠灌木，具有較強(qiáng)的耐寒性[1-2]和耐陰性[3-4]，可在長(zhǎng)江中下游地區(qū)露地越冬[2]。該種是城市園林綠化的理想植物，常作為地被和綠籬等[2]。

長(zhǎng)時(shí)間高溫不利于植物生長(zhǎng)，致使植物生理生化代謝水平失衡[4]。植物體受到脅迫后，膜脂過氧化程度加劇，丙二醛(MDA)含量和電解質(zhì)外滲率增大，膜蛋白損傷加劇[4]。高溫條件下，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)會(huì)發(fā)生響應(yīng)，以清除體內(nèi)的活性氧，保護(hù)膜系統(tǒng)[5]；高溫還可影響植物代謝產(chǎn)物的積累[6]。

作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)夏季高溫可引起野扇花葉片枯黃、脫落(未發(fā)表)，不利于其推廣應(yīng)用。為此，本研究對(duì)模擬高溫(日溫35 ℃、夜溫30 ℃)脅迫下野扇花植株生長(zhǎng)及葉中生理生化指標(biāo)的變化進(jìn)行了分析，并對(duì)野扇花葉片極性代謝產(chǎn)物的積累狀況進(jìn)行了比較，以期明確野扇花的耐熱性，為野扇花在長(zhǎng)江中下游地區(qū)的栽培應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為上海迪士尼度假區(qū)的2年生野扇花盆栽苗，株高50～55 cm，盆栽基質(zhì)為園土和河沙的混合基質(zhì)(體積比2∶1)。于2019年3月移至溫室進(jìn)行過渡培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度18 ℃～30 ℃，空氣相對(duì)濕度60%～80%，自然光照；每周澆1次水。

1.2 方法

1.2.1 處理方法 過渡培養(yǎng)30 d后，選擇株高和葉片狀態(tài)相近，且無(wú)機(jī)械損傷和病蟲害的植株，置于培養(yǎng)箱內(nèi)適應(yīng)培養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。高溫處理組日溫35 ℃、夜溫30 ℃，對(duì)照組日溫25 ℃、夜溫20 ℃。每盆1株，每組6盆，每盆視為1個(gè)重復(fù)。其余培養(yǎng)條件為空氣相對(duì)濕度75%～85%，光合有效輻射315 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間14 h·d-1；每2 d澆1次水。實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組植株生長(zhǎng)變化；在處理0、8、16、24和32 d分別采集植株的葉片，待測(cè)。

1.2.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定 采用二甲基亞砜法[7]測(cè)定葉中葉綠素和類胡蘿卜素的含量。參照Da Costa等[8]的方法，使用FE30電導(dǎo)率儀(美國(guó)Mettler-Toledo公司)測(cè)定葉的電解質(zhì)外滲率。參照Z(yǔ)hang等[9]的方法，測(cè)定葉中MDA含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定4次。

1.2.3 極性代謝產(chǎn)物提取及含量分析 葉片總代謝物提取參照Du等[10]的方法并稍作修改；參照Qiu[11]的方法，以2 mg·mL-1核糖醇為內(nèi)標(biāo)，使用7890A-5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)進(jìn)行分析；采用NIST 2011譜庫(kù)分析總離子流色譜圖，根據(jù)化合物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積計(jì)算極性代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

使用EXCEL 2019和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用one-way ANOVA法進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。應(yīng)用SIMCA 14.1軟件對(duì)極性代謝產(chǎn)物進(jìn)行主成分分析；采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對(duì)極性代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選，選出變量投影重要性值(VIP)大于1且在處理組和對(duì)照組間差異顯著的極性代謝產(chǎn)物。

2 結(jié)果和分析

2.1 高溫脅迫對(duì)野扇花植株生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間(32 d)高溫(日溫35 ℃、夜溫30 ℃)脅迫后，野扇花大部分葉片明顯干枯、變黃，甚至萎蔫、脫落；而對(duì)照組(日溫25 ℃、夜溫20 ℃)植物生長(zhǎng)良好，新葉繼續(xù)萌發(fā)。

2.2 高溫脅迫對(duì)野扇花葉中生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 對(duì)葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響 高溫(日溫35 ℃、夜溫30 ℃)脅迫下野扇花葉中葉綠素和類胡蘿卜素含量的變化見表1。結(jié)果顯示：在高溫處理8、24和32 d，處理組葉中葉綠素含量顯著(P<0.05)低于對(duì)照組(日溫25 ℃、夜溫20 ℃)，分別為對(duì)照組的96.24%、81.38%和66.49%；在處理24和32 d，高溫處理組葉中類胡蘿卜素含量也顯著低于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的90.48%和68.18%。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，高溫處理組葉中葉綠素和類胡蘿卜含量總體上逐漸下降，且在部分處理時(shí)間差異顯著；而對(duì)照組葉中葉綠素和類胡蘿卜素含量變化均不明顯。

表1 高溫脅迫下野扇花葉中葉綠素和類胡蘿卜素含量的變化

2.2.2 對(duì)丙二醛(MDA)含量和電解質(zhì)外滲率的影響 高溫脅迫下野扇花葉中MDA含量和電解質(zhì)外滲率的變化見表2。結(jié)果顯示：在處理16、24和32 d，高溫處理組葉中MDA含量顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.15、1.15和1.28倍；在處理8、16和24 d，高溫處理組葉的電解質(zhì)外滲率顯著低于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的88.53%、86.88%和90.94%，但在處理32 d卻顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.64倍。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，高溫處理組葉中MDA含量逐漸升高，電解質(zhì)外滲率則表現(xiàn)為在處理8 d低于處理0 d，之后逐漸升高，并在處理32 d顯著升高；而對(duì)照組葉中MDA含量和電解質(zhì)外滲率變化均不明顯。

表2 高溫脅迫下野扇花葉中丙二醛(MDA)含量和電解質(zhì)外滲率的變化

2.2.3 對(duì)抗氧化酶活性的影響 高溫脅迫下野扇花葉中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的變化見表3。結(jié)果顯示：在處理24和32 d，高溫處理組葉中SOD活性顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的3.01和5.07倍；在處理16、24和32 d，高溫處理組葉中POD活性顯著低于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的92.25%、65.80%和86.18%；在處理8、16、24和32 d，高溫處理組葉中APX活性顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.21、2.63、2.27和2.61倍。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，高溫處理組葉中SOD活性總體呈不斷升高的趨勢(shì)；POD活性呈先下降后升高的趨勢(shì)，在處理24 d時(shí)達(dá)到最低值；APX活性呈先升高后降低并趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，在處理16 d時(shí)達(dá)到最高值。然而，對(duì)照組葉中SOD、POD和APX活性則隨處理時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化。

表3 高溫脅迫下野扇花葉中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的變化

2.3 高溫脅迫對(duì)野扇花葉中極性代謝產(chǎn)物的影響

為了明確短時(shí)間(8 d)和長(zhǎng)時(shí)間(32 d)高溫(日溫35 ℃、夜溫30 ℃)脅迫對(duì)野扇花葉中極性代謝產(chǎn)物的影響，采用GC-MS技術(shù)對(duì)短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫下野扇花葉中的極性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，共分離鑒定出80種極性代謝產(chǎn)物，包括13種有機(jī)酸類成分、15種氨基酸類成分、42種糖和糖醇類成分、6種胺類成分以及4種其他成分。對(duì)這些成分進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：主成分1占比35.90%，能夠?qū)⒍虝r(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫下野扇花葉中的極性代謝產(chǎn)物完全分開。說明高溫脅迫可影響極性代謝產(chǎn)物的積累，且長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫對(duì)野扇花葉中極性代謝產(chǎn)物積累的影響更大。

：短時(shí)間對(duì)照(日溫25 ℃、夜溫20 ℃)處理Short time control(day temperature of 25 ℃ and night temperature of 20 ℃)treatment；：短時(shí)間高溫(日溫35 ℃、夜溫30 ℃)處理Short time high temperature(day temperature of 35 ℃ and night temperature of 30 ℃)treatment；：長(zhǎng)時(shí)間對(duì)照處理Long time control treatment；：長(zhǎng)時(shí)間高溫處理Long time high temperature treatment.相同顏色圓點(diǎn)代表同組的4個(gè)重復(fù)Dots of the same color represent four replicates of the same group.

依據(jù)變量投影重要性值大于1且在處理組和對(duì)照組間差異顯著(P<0.05)的標(biāo)準(zhǔn)，從80種極性代謝產(chǎn)物中選出22種差異極性代謝產(chǎn)物，包括4種有機(jī)酸類成分、7種氨基酸類成分、10種糖和糖醇類成分及1種不飽和脂肪酸類成分，詳見表4。

表4 基于PLS-DA法的高溫脅迫下野扇花葉中差異極性代謝產(chǎn)物相對(duì)含量的變化分析

結(jié)果顯示：有機(jī)酸類成分中，高溫處理組葉中莽草酸和4-羥基丁酸相對(duì)含量在處理8 d顯著低于對(duì)照組(日溫25 ℃、夜溫20 ℃)，琥珀酸、蘋果酸和4-羥基丁酸相對(duì)含量在處理32 d也顯著低于對(duì)照組。說明野扇花葉中莽草酸和4-羥基丁酸的積累在短時(shí)間高溫脅迫下明顯減少，琥珀酸、蘋果酸和4-羥基丁酸的積累在長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫下也明顯減少。

氨基酸類成分中，高溫處理組葉中脯氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸相對(duì)含量在處理8 d顯著低于對(duì)照組，絲氨酸相對(duì)含量在處理32 d也顯著低于對(duì)照組，而亮氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、色氨酸和天冬氨酸相對(duì)含量在處理32 d卻顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的4.40、1.86、1.91、1.40和1.31倍。說明野扇花葉中脯氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸的積累在短時(shí)間高溫脅迫下明顯減少，絲氨酸的積累在長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫下也明顯減少，而γ-氨基丁酸、脯氨酸、色氨酸和天冬氨酸的積累在長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫下卻明顯增加。

糖和糖醇類成分中，高溫處理組葉中肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脫氧戊糖醇和甘露糖相對(duì)含量在處理8 d顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的20.37、2.85、1.52和2.78倍，而甘露醇、阿洛糖、阿拉伯呋喃糖和赤蘚糖相對(duì)含量在處理8 d卻顯著低于對(duì)照組；該組葉中赤蘚糖相對(duì)含量在處理32 d顯著低于對(duì)照組，而肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脫氧戊糖醇、甘露糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖和阿洛糖相對(duì)含量在處理32 d卻顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的34.30、21.42、10.71、4.98、3.16、2.21、1.79和1.67倍。說明野扇花葉中甘露醇、阿洛糖、阿拉伯呋喃糖和赤蘚糖的積累在短時(shí)間高溫脅迫下明顯減少，赤蘚糖的積累在長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫下也明顯減少，而肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脫氧戊糖醇和甘露糖的積累在短時(shí)間高溫脅迫下卻明顯增加，肌醇半乳糖苷、肌醇、1-脫氧戊糖醇、甘露糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖和阿洛糖的積累在長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫下也明顯增加。

不飽和脂肪酸類成分僅有α-亞麻酸1種，高溫處理組葉中α-亞麻酸相對(duì)含量在處理8 d顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的3.10倍，而在處理32 d與對(duì)照組無(wú)顯著差異。說明野扇花葉中α-亞麻酸的積累在短時(shí)間高溫脅迫下明顯增加。

3 討論和結(jié)論

葉綠素和類胡蘿卜素與植物的光合作用息息相關(guān)。本研究中，高溫(日溫35 ℃、夜溫30 ℃)脅迫處理8、16、24和32 d，野扇花葉中葉綠素含量均低于對(duì)照組(日溫25 ℃、夜溫20 ℃)，且在部分處理時(shí)間顯著低于對(duì)照組，這可能與葉綠素合成受阻[12]和(或)降解加速[13]有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步深入研究。類胡蘿卜素在植物體內(nèi)參與清除活性氧過程，并且，可保護(hù)葉綠素免受光氧化[14]。隨著高溫脅迫持續(xù)，野扇花葉中類胡蘿卜素含量總體上逐漸下降，且在處理24和32 d顯著(P<0.05)低于對(duì)照組，這可能與野扇花在受到高溫脅迫后體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧有關(guān)。

植物在受到高溫脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，生成丙二醛(MDA)等產(chǎn)物，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而影響植物體正常的生理活動(dòng)[4]。隨著高溫脅迫持續(xù)，野扇花葉中MDA含量不斷升高且總體上顯著高于對(duì)照組，在處理32 d達(dá)到對(duì)照組的1.28倍；而在處理32 d，處理組葉的電解質(zhì)外滲率顯著高于對(duì)照組，表明高溫脅迫32 d，野扇花葉細(xì)胞的細(xì)胞液外滲嚴(yán)重，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。

糖在植物生長(zhǎng)和脅迫適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，可直接參與其他化合物合成和能量產(chǎn)生，還能夠參與膜穩(wěn)定、基因表達(dá)調(diào)節(jié)和糖敏感信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控[10]。高溫脅迫下，植物體內(nèi)參與植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成和代謝調(diào)控的糖類化合物(如蔗糖、葡萄糖和果糖等)含量會(huì)發(fā)生改變[10]。高溫脅迫32 d，野扇花葉中甘露糖和甘露醇的相對(duì)含量較對(duì)照組顯著升高，可能與體內(nèi)的L-半乳糖途徑中維生素C的合成相關(guān)，維生素C可作為非酶抗氧化劑參與植物生理發(fā)育調(diào)控[16-17]。高溫脅迫32 d，野扇花葉中APX活性較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，證明甘露糖含量升高還可能與AsA合成有關(guān)。肌醇為環(huán)狀糖醇，既是一種滲透調(diào)節(jié)劑，也是多種代謝途徑(如應(yīng)激反應(yīng)等)的二級(jí)信使[18]；肌醇半乳糖苷是植物體內(nèi)重要可溶性糖棉子糖類寡糖(RFOs)的合成底物，而RFOs的相關(guān)代謝產(chǎn)物可能參與植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。相關(guān)研究表明：肌醇半乳糖合酶廣泛參與植物對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)[19]。高溫脅迫8和32 d，野扇花葉中肌醇半乳糖苷和肌醇的相對(duì)含量顯著升高，推測(cè)野扇花的磷酸肌醇代謝途徑受高溫脅迫影響顯著。

值得注意的是，高溫脅迫8 d，野扇花葉中α-亞麻酸相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組。已有研究表明：膜脂肪酸飽和程度與植物抗逆性有關(guān)，不飽和脂肪酸水平較高可能是植物適應(yīng)高溫脅迫的一種保護(hù)機(jī)制[20]；膜脂肪酸不飽和程度增加有利于穩(wěn)定植物體的光合能力，提高植物的耐熱性[21]。

總體來(lái)看，高溫脅迫下，野扇花大部分葉片干枯、變黃，甚至萎蔫、脫落；葉中葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸下降，MDA含量逐漸升高，電解質(zhì)外滲率僅在處理32 d顯著升高，SOD和APX活性增強(qiáng)，POD活性減弱。高溫脅迫下，野扇花葉中22種差異極性代謝產(chǎn)物較對(duì)照組發(fā)生顯著變化，并且，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，變化越大，據(jù)此認(rèn)為這些差異極性代謝產(chǎn)物可能在野扇花響應(yīng)和抵抗高溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用，影響野扇花抗高溫的能力。綜上所述，野扇花對(duì)高溫脅迫較為敏感，且長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫對(duì)野扇花葉中差異極性代謝產(chǎn)物積累的影響更大。然而，關(guān)于野扇花葉中差異極性代謝產(chǎn)物在植株響應(yīng)高溫脅迫中的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。