包蟲囊液對(duì)體外培養(yǎng)小鼠NK細(xì)胞影響的研究

印雙紅，陳小林，張俊波，吳向未，陳雪玲*

（ 1.銅仁學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832002；3.銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300 ）

【化學(xué)與生物科學(xué)】

包蟲囊液對(duì)體外培養(yǎng)小鼠NK細(xì)胞影響的研究

印雙紅1，陳小林2，張俊波3，吳向未2，陳雪玲2*

（ 1.銅仁學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.石河子大學(xué) 醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832002；3.銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300 ）

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞活性受體NKG2D的表達(dá)變化，乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)法（LDH）分析脾細(xì)胞的殺傷活性。通過細(xì)粒棘球蚴囊液對(duì)體外BABL/c小鼠NK細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果的分析討論，得到細(xì)粒棘球蚴囊液可降低NKG2D的表達(dá)水平，進(jìn)而使NK細(xì)胞殺傷活性降低，從而得到有利于包蟲免疫逃逸的結(jié)論。

囊液； 細(xì)粒棘球蚴； NK細(xì)胞

包蟲病（Hydatid disease）是棘球蚴寄生于中間宿主引起的一種人畜共患寄生蟲病[1]。在包蟲病的手術(shù)治療過程中，由于棘球蚴包囊意外破裂，部分原頭節(jié)進(jìn)入組織內(nèi)，發(fā)生再次感染，使包蟲病很難治愈[2]。包蟲之所以可在宿主體內(nèi)存活，依賴于對(duì)宿主的免疫逃避機(jī)制。NK細(xì)胞（Natural killer cell）是一類大顆粒淋巴細(xì)胞，存在于淋巴器官和外周組織中，具有多種重要作用，其中以防御感染和溶解破壞靶細(xì)胞為主要作用。NK細(xì)胞的殺傷作用與其表面受體相關(guān)，NKG2D是NK細(xì)胞重要的CL-SF激活性受體，與某些靶細(xì)胞識(shí)別相關(guān)[3]，對(duì)于NK細(xì)胞在包蟲免疫逃逸中的功能，有研究表明其NK細(xì)胞活性明顯下降，但目前相關(guān)研究較少[4]。本研究主要分析細(xì)粒棘球蚴囊液對(duì)體外小鼠NK細(xì)胞的影響。

1.材料和方法

1.1.材料

1.1.1.實(shí)驗(yàn)材料

6周～8周雌性BALB/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2.主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自HYCLIONE公司；流式抗體DX5-FITC和NKG2D-PE購自ebioscience公司；流式細(xì)胞儀購自BD公司；淋巴細(xì)胞分離液購自Solarbio公司；Yac-1細(xì)胞購自上海銳聰科技公司；酶標(biāo)儀購自BIO-RAD公司。

1.2.方法

1.2.1.細(xì)粒棘球蚴囊液的制備

從已感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊肝臟上抽取無感染、無膽瘺、無色透明的單囊型細(xì)粒棘球蚴囊液。4℃，300*g離心10min，無菌濾紙過濾，然后再用0.22μm濾器過濾，取出10mL分析囊液蛋白濃度，剩余的分裝于離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.小鼠脾臟細(xì)胞分離

以脫頸方式處死小鼠，無菌取出脾臟，放入含PBS的器皿中沖洗，研磨后用濾膜過濾，收集細(xì)胞懸

液，200*g離心5min后棄上清液；用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）將細(xì)胞稀釋成3.5×106/mL濃度的懸液。

以脫頸方式處死小鼠，放入75%乙醇內(nèi)3min，無菌取出脾臟，用5mL注射器在含有PBS的器皿中刮出脾細(xì)胞。用1mL注射器抽吸脾細(xì)胞，盡量分散脾細(xì)胞。向離心管加入3mL淋巴細(xì)胞分離液，再將1.5 mL細(xì)胞懸液緩慢加入（V脾細(xì)胞懸液:V分離液=1:2），2000rpm，20min離心。吸出中間的云絮層，用3 mL PBS，1000rpm，5min洗滌3次。用RPMI-1640培養(yǎng)基配成3×107個(gè)/mL。

1.2.3.不同濃度囊液對(duì)小鼠NK淋巴細(xì)胞的影響

（1）按每孔0.5mL將細(xì)胞懸液加入到48孔培養(yǎng)板，再加入囊液0.5mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL及空白對(duì)照PBS組共5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)；每孔由RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)至1.0mL，并加入ConA 10μg，37℃，5%C02培養(yǎng)72h后，300*g離心5min，PBS洗滌，然加入抗體孵育30min，分析NKG2D的表達(dá)。

（2）收集細(xì)胞用LDH酶法檢測(cè)NK細(xì)胞活性的變化。取淋巴細(xì)胞1×107個(gè)/mL和靶細(xì)胞Yac-1 cells 1×105個(gè)/mL各0.1mL（E：T＝100 :1）加入培養(yǎng)板中（設(shè)3復(fù)孔），同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔（0.1mL靶細(xì)胞+0.1mL 10%FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液）和最大釋放孔（0.1mL靶細(xì)胞+0.1mL1%NP40液），1000 r/min，離心2min。置37℃，5%CO2孵育2h。1000 r/min，離心5min。各孔吸取上清0.1mL加至新96孔板中，37℃放置10min。每孔再加入0.1mL LDH底物溶液，避光室溫放置10～15min。加入30μL1mol/L檸檬酸終止液終止反應(yīng)。酶聯(lián)檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)下讀取各孔A值。

根據(jù)下列公式獲得NK細(xì)胞活性：

1.2.4.數(shù)據(jù)分析

用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用x±s表示。兩組間比較采用兩樣本均數(shù)的t參數(shù)檢驗(yàn)，多組比較用方差分析。

圖1 不同濃度囊液對(duì)NKG2D表達(dá)的影響

2.結(jié)果與分析

2.1.囊液對(duì)小鼠NK細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)影響

分析不同濃度囊液對(duì)NK細(xì)胞表面受體NKG2D表達(dá)的影響（圖1），結(jié)果表明，囊液組中NKG2D的表達(dá)水平下降；伴隨囊液濃度的提高，NKG2D水平逐漸下降，在高濃度500μL組下降到最小值（4.3±0.5%），與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=3.89，p＜0.05）。FCM檢測(cè)不同濃度囊液組NKG2D的表達(dá)結(jié)果； 500μL組與對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。

2.2.不同濃度的囊液對(duì)NK細(xì)胞活性的影響

LDH酶法分析囊液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響（表1和圖2），結(jié)果表明，增加囊液濃度時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)Yac-1的免疫殺傷活性具有下降的趨勢(shì)；并在高濃度組達(dá)到最低值（8.3±1.0%），與對(duì)照組相比顯著差異（t=3.45，p＜0.05）。

表1 LDH酶法分析不同濃度囊液對(duì)NK細(xì)胞活性的影響

圖2 不同濃度囊液對(duì)NK細(xì)胞免疫殺傷性的影響

3.討論

細(xì)粒棘球蚴可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期生存，但其機(jī)制還不十分清楚，NK細(xì)胞未充分發(fā)揮天然免疫作用，應(yīng)是患該病的重要原因之一[5]。對(duì)于NK細(xì)胞的研究，目前主要關(guān)于泡球蚴患者的外周血中比例降低的研究。Nicod研究表明NK細(xì)胞活性顯著降低，且這與PBMC中NK細(xì)胞比例低有關(guān)。其他研究通過分析患者外周血也發(fā)現(xiàn)，泡球蚴患者的NK細(xì)胞比例與健康人相比降低[6]，并且還發(fā)現(xiàn)，維吾爾族和漢族包蟲病人的NK細(xì)胞比例均較健康人組水平顯著降低，表明包蟲感染后可能抑制了NK細(xì)胞的一些功能[7]。本研究表明，隨著囊液濃度的提高NK細(xì)胞活性下降，這與人感染泡球蚴后對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制結(jié)果相同[8]。

NKG2D是NK細(xì)胞表面的活性受體，主要分布于人NK細(xì)胞和T細(xì)胞。NKG2D可識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的配體分子，進(jìn)而活化免疫效應(yīng)細(xì)胞，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷功能[9]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞可識(shí)別靶細(xì)胞表面壓力誘導(dǎo)下所表達(dá)的配體而活化信號(hào)，這種活化可不受NK細(xì)胞抑制性信號(hào)的控制，并可克服抑制性受體的強(qiáng)勢(shì)信號(hào)。這種被稱為“壓力誘導(dǎo)”的識(shí)別模式使NK細(xì)胞可及時(shí)識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)[10,11]。NK細(xì)胞殺傷活性與NKG2D受體的表達(dá)呈正相關(guān)[12]。有研究報(bào)道，HIV病毒Nef蛋白可降低細(xì)胞表面NKG2DLs表達(dá)，而降低NKG2D受體介導(dǎo)的NK細(xì)胞的殺傷活性[13,14]。弓形體可提高NKG2D表達(dá)和NK細(xì)胞活性，導(dǎo)致懷孕女性或孕鼠妊娠異常。Nicod研究泡球蚴患者表明NK細(xì)胞活性顯著降低；此后，又發(fā)現(xiàn)泡球蚴也可通過TGF-β的持續(xù)表達(dá)而抑制NKG2D受體的表達(dá)，從而利于多房棘球絳蟲的感染。結(jié)果表明，隨著囊液濃度的提高和時(shí)間的延遲，NK細(xì)胞活性下降，這與人感染泡球蚴后對(duì)NK細(xì)胞活性的抑制使得棘球蚴逃避宿主的免疫應(yīng)答，而可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活。

4.結(jié)論

隨著細(xì)粒棘球蚴囊液濃度的提高，NKG2D的表達(dá)水平逐漸降低，因此，NK細(xì)胞活性受到抑制，使得棘球蚴逃避宿主的免疫應(yīng)答在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活，從而揭示棘球蚴的致病機(jī)制，為抗棘球蚴的藥物研制奠定基礎(chǔ)。

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The Pilot Study on the Influence of NK Cell From Mouse Spleen Cells Treated with Echinococcus Granulosus Fluid in Vitro

YIN Shuanghong1, CHEN Xiaolin2, ZHANG Junbo3, WU Xiangwei2, CHEN Xueling2
( 1. Big health Institute, Tongren University, Tongren, Guizhou 554300, China; 2. Department of Immunology of medical school, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000, China; 3. College of Agroforestry Engineering and Planning, Tongren University, Tongren, Guizhou 554300, China )

To observe the influence of NK cells which separated from mouse spleen cells treated with Echinococcus granulosus fluid in vitro. The spleen cells of BABL/C mouse were co-cultured with different concentration Hydatid fluid. The activity and expression of NKG2D were detected by FCM; and the killing activity of spleen cells were also detected by LDH assay. The result shows that with the increasing of the concentration of Hydatid fluid, the expression of NKG2D and NK cell activity were decreased. The expression of NKG2D was decreased, thus reducing the activity of NK cells, which may facilitate Echinococcus granulosus to evade the host's immune.

hydatid fluid, echinococcus granulosus, NK cell

R392

A

1673-9639 (2016) 04-0001-04

（責(zé)任編輯 吳思展）（責(zé)任校對(duì) 毛 志）

2016-03-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81360453）；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字[2015]7238號(hào)，黔科合LH字[2015]7236號(hào)）。

印雙紅（1986-），女，貴州銅仁人，碩士，研究方向：感染免疫。

陳雪玲（1972-），女，新疆塔城人，博士，教授、碩士生導(dǎo)師，研究方向：感染免疫。

*通訊作者：陳雪玲，E-mail：xuelingch@hotmail.com。