H2松弛素對慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用

李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

(麗水市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 麗水 321400)

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H2松弛素對慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用

李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

(麗水市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 麗水 321400)

目的 探討H2松弛素對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用。方法 觀察正常對照組、COPD模型組及松弛素治療組大鼠肺組織的病理變化，比較各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度，檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 表達水平及MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值。結(jié)果 與正常對照組大鼠相比，COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚，且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達水平均高于正常對照組(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與正常對照組相比，呈現(xiàn)明顯升高趨勢(P<0.05)；而對比COPD模型組大鼠，松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。結(jié)論 松弛素能抑制大鼠肺組織結(jié)構(gòu)病理變化，抑制COPD氣道平滑肌的增殖。

松弛素；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的致病因素很多，其發(fā)病機制尚不明確〔1〕。國外研究〔2〕證實，當(dāng)小鼠缺乏H2松弛素時，會表現(xiàn)出肺部變性，質(zhì)量增加，生成大量膠原及纖維，肺泡產(chǎn)生病理改變，出現(xiàn)充血，可伴有水腫，同時支氣管上皮細胞出現(xiàn)增厚等病理變化，出現(xiàn)類似衰老的表現(xiàn)，因此補充H2松弛素可使得上述病理變化出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，且發(fā)現(xiàn)這一病理變化過程極有可能通過影響了肺及平滑肌中基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-1、MMP-9及MMP組織抑制劑(TIMP)-1的表達而實現(xiàn)。本實驗采用脂多糖(LPS)滴注大鼠氣道，聯(lián)合被動吸煙法制備COPD的大鼠模型〔3〕，探討H2松弛素對COPD模型中大鼠的支氣管平滑肌增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立 選取鼠齡12 w、體質(zhì)量(200±20)g的 Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組、COPD模型組和松弛素治療組。COPD模型組和松弛素治療組分別于造模的第1以及第15天，向大鼠的氣道內(nèi)滴注一定量的LPS，濃度為200 μg/200 μl，正常對照組不作任何處理。造模第2天將COPD模型組和松弛素治療組大鼠放入有機玻璃熏箱內(nèi)，每次吸煙10支，大約2 h，每天吸煙2次(上、下午各一次)，每周吸煙6 d，共吸煙20 w。松弛素治療組在造模開始第30天開始每天皮下注射松弛素(0.25 mg·kg-1·d-1)15 d，正常對照組采用生理鹽水注射15 d。檢測模型制定成功的標準：隨機選取COPD造模組大鼠，切取肺組織做病理分析，觀察其肺部組織是否出現(xiàn)類似COPD的病理變化。大鼠肺部的外周氣道、主支氣管及細支氣管以及血管壁均出現(xiàn)炎細胞浸潤，氣道損傷；鏡下可見黏液腺肥大增生，杯狀細胞增多；平滑肌以及肺小動脈平滑肌均出現(xiàn)增生，膠原沉積進而出現(xiàn)氣道腔縮小狹窄，導(dǎo)致氣道出現(xiàn)阻塞；出現(xiàn)細支氣管呼吸相擴張、受損，肺泡因壓力導(dǎo)致增大，形成不規(guī)則的肺大泡。

1.2 收集標本 采用濃度(50 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后斷頭處死，取材部位為：心、右下肺葉，所有組織儲存于液氮罐中。向左側(cè)主支氣管注入4%多聚甲醛，致使大鼠出現(xiàn)輕度肺膨脹，按照0.5 cm厚度切取左側(cè)中下肺葉，浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h，采用石蠟垂直包埋，垂直于支氣管及細支氣管橫斷面、矢狀位切片。HE染色行病理學(xué)觀察。同時測量各組大鼠支氣管壁及平滑肌的厚度。

1.3 檢測大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達 采用免疫組織化學(xué)過氧化物酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)測定。鏡下結(jié)果采用圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計，隨機挑選鏡下6個畫面，當(dāng)細胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕褐色顆粒則計為陽性表達，采用平均吸光度值測定表達強度，吸光度值越高提示所測指標含量越高。試劑盒采用美國Zymed公司SP試劑盒。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺-支氣管的病理學(xué)變化 正常對照組大鼠鏡下可見肺結(jié)構(gòu)大體正常，肺小葉結(jié)構(gòu)組織無明顯異常，支氣管未見明顯異常；COPD模型組大鼠細支氣管纖毛部分出現(xiàn)滑落，粘連，倒伏，黏液腺較正常大鼠增大，杯狀細胞及嗜酸性細胞浸潤增多，管壁明顯增厚，管腔狹窄，伴有大量中性粒細胞、漿細胞及淋巴細胞的浸潤，上皮細胞膨脹出現(xiàn)變形、細胞壞死傾向，肺泡間隔較正常肺泡變薄、部分出現(xiàn)斷裂，肺泡腔增大，甚至出現(xiàn)融合，松弛素治療組大鼠肺部組織也出現(xiàn)上述病理變化，但程度較COPD模型組大鼠病理改變減輕。

2.2 各組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度比較 與正常對照組大鼠相比，COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚，且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達水平 COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1三者的表達水平均高于正常對照組(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與正常對照組相比，呈現(xiàn)明顯升高趨勢(P<0.05)；而對比COPD模型組大鼠，松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺支氣管壁及平滑肌厚度、肺組織MMP-1、MMP-9、TIMP-1 表達水平比較±s,n=10)

與正常對照組比較：1)P<0.05；與COPD模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

MMPs是一組降解肺組織細胞外基質(zhì)的最主要的酶系，可降解肺泡壁中全部細胞外基質(zhì)成分，激活其他不同類型的MMPs等作用。TIMPs為一種內(nèi)源性抑制劑，可抑制MMPs的活化〔6〕。TIMPs可由上皮細胞、內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生，是MMPs的內(nèi)源性抑制劑，具備生長因子樣作用，可促使成纖維細胞增生，使細胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解。TIMPs與MMPs兩者以共價鍵形式形成復(fù)合體，進而阻止MMPs與相應(yīng)底物結(jié)合，而TIMPs與MMPs這種結(jié)合具有不可逆性〔7〕。MMPs/TIMPs的比例改變是導(dǎo)致COPD氣道重塑的主要機制之一，而當(dāng)COPD發(fā)生時，肺組織結(jié)構(gòu)改變，如支氣管壁增厚，平滑肌增厚，從而導(dǎo)致功能下降，氣道發(fā)生不可逆改變，通氣功能下降，病理發(fā)現(xiàn)，支氣管壁以及平滑肌中出現(xiàn)大量炎癥細胞，嗜酸性粒細胞浸潤，原有結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，膠原沉積，纖維化改變等，以上均是導(dǎo)致支氣管功能下降的主要因素。

Comer等〔8〕研究顯示，在對比健康者和肺氣腫患者肺泡巨噬細胞中mRNA水平和蛋白酶的活性后發(fā)現(xiàn)，吸煙者肺部間質(zhì)中膠原酶和巨噬細胞的明膠酶B表達增多，肺氣腫患者肺泡巨噬細胞的活性顯著增高。Segura-Valdez等〔7〕發(fā)現(xiàn)在肺氣腫患者肺組織中MMP-1高表達，MMP-9的表達在吸煙相關(guān)的肺氣腫中也呈現(xiàn)明顯增高，Raulo等〔9〕發(fā)現(xiàn)COPD表現(xiàn)的馬的支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的表達水平明顯高于健康馬，且與炎癥細胞呈正相關(guān)。TIMP-1廣泛存在于人體組織及血液中，具有較高的結(jié)合力，可與所有的MMPs家族成員形成復(fù)合物，從而抑制MMP-9的活性，進而導(dǎo)致蛋白水解酶活性喪失。TIMP-1的表達是否異常關(guān)系到肺部組織結(jié)構(gòu)重塑〔10〕，研究發(fā)現(xiàn)TIMPs還具促細胞因子樣作用，促進細胞外基質(zhì)沉積并抑制降解，其過程與氣道修復(fù)、重塑相近。松弛素屬于胰島素類生長激素家族的蛋白激素，其結(jié)構(gòu)和胰島素相似，分子大小約6 kD，含有A和B兩個肽鏈，由二硫鍵連接組成〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，松弛素與其受體結(jié)合時，可致使其受體發(fā)生構(gòu)象的改變，導(dǎo)致松弛素受體被激活，此激活途徑，進一步引起受體內(nèi)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)激活〔5〕。目前發(fā)現(xiàn)的松弛素基因，分別為H1、H2和H3，而H2主要存在于其組織及血液循環(huán)系統(tǒng)中。當(dāng)松弛素與其受體結(jié)合時，血管內(nèi)皮MMPs的活性可相應(yīng)增強。

本研究提示COPD模型復(fù)制成功，大鼠出現(xiàn)肺部組織結(jié)構(gòu)破壞，支氣管壁及平滑肌厚度顯著增加，且修復(fù)重構(gòu)也同時進行，此結(jié)果與目前研究認為MMPs和TIMPs的動態(tài)平衡與氣道及肺組織破壞與修復(fù)同時存在相一致的理論〔11〕。而MMPs和TIMPs表達是否平衡是導(dǎo)致大鼠肺部各組織結(jié)構(gòu)正常與否及維持細胞外基質(zhì)正常的基礎(chǔ)條件之一，兩者失衡會出現(xiàn)病理變化。MMPs/TIMPs比值增加提示組織破壞加劇，下降則提示組織纖維化氣道重塑。

國外研究〔12〕證實松弛素缺失的小鼠會出現(xiàn)與衰老相關(guān)的膠原含量增加、肺組織質(zhì)量增加、肺泡充血和細支氣管壁增厚，平滑肌增厚功能下降，而通過H2松弛素的治療可以使過多的膠原沉積得到逆轉(zhuǎn)。本實驗提示H2松弛素可能是通過抑制COPD氣道平滑肌的增殖，延緩COPD的進展，進而起到一定程度的治療作用。

1 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版) 〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志，2013；36(4)：255-64.

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6 趙 華，趙 瑾，許西琳.COPD大鼠模型氣道MMP-9和TIMP-1表達的研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2010；12(10)：2244-6.

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〔2015-07-19修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢園)

李 露(1987-)，女，住院醫(yī)師，主要從事肺部感染、肺癌研究。

R56

A

1005-9202(2016)21-5251-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.016