枸櫞酸預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠室性心律失常及心肌Capase-3表達(dá)的影響

李艷芳 費(fèi)麗萍 牛青英 韓澤紅

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，山西 長(zhǎng)治 046011)

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枸櫞酸預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠室性心律失常及心肌Capase-3表達(dá)的影響

李艷芳 費(fèi)麗萍 牛青英 韓澤紅1

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，山西 長(zhǎng)治 046011)

目的 探討枸櫞酸預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注(I/R)大鼠室性心律失常的影響及相關(guān)作用機(jī)制。方法 選擇雄性SD大鼠350～400 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、枸櫞酸組(0.05 mol/L)，每組10只，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法建立在體大鼠I/R模型，缺血30 min，再灌注120 min，記錄心電圖，檢測(cè)預(yù)處理前后血清鈣離子濃度變化，TTC染色法測(cè)定梗死面積，活性分光光度法測(cè)定心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平，PCR測(cè)定心肌鈣調(diào)蛋白(CAM)表達(dá)水平。結(jié)果 模型組室性心律失常次數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，枸櫞酸組低于模型組、高于假手術(shù)組(P<0.05)；枸櫞酸處理后血清鈣離子濃度顯著低于處理前(P<0.05)，有一定時(shí)間規(guī)律；枸櫞酸組梗死面積顯著低于模型組(P<0.05)，Caspase-3蛋白、CAM表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 枸櫞酸對(duì)I/R大鼠心肌保護(hù)作用與降低血清鈣離子濃度，下調(diào)Caspase-3蛋白、CAM表達(dá)水平，降低心肌細(xì)胞凋亡，減輕室性心律失常有關(guān)。

枸櫞酸；室性心律失常；Capase-3

心肌缺血再灌注(I/R)可加重缺血導(dǎo)致的心功能障礙與心肌細(xì)胞損傷，闡明其作用機(jī)制對(duì)于預(yù)防心肌I/R損傷有重要作用〔1〕。細(xì)胞內(nèi)鈣超載在心肌I/R損傷中具有主導(dǎo)作用〔2〕，細(xì)胞內(nèi)Ca2+失衡導(dǎo)致Ca2+分隔與Ca2+內(nèi)流失調(diào)，引發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，心肌缺血缺氧時(shí)線粒體產(chǎn)生ATP減少，鈣泵功能受限制，Na+/Ca2+交換蛋白為非ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+水平增加及酸中毒，心肌再灌注時(shí)pH與ATP恢復(fù)，細(xì)胞內(nèi)外pH梯度差激活Na+/H+與Na+/Ca2+交換，胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，在心肌動(dòng)作電位后短暫除極，引發(fā)室性心律失常〔3〕。枸櫞酸多作為血液抗凝劑，可與Ca2+形成絡(luò)合物枸櫞酸鈣，降低血中Ca2+，抑制凝血過程。本研究觀察枸櫞酸預(yù)處理對(duì)I/R大鼠室性心律失常、血清Ca2+濃度及心肌組織Caspase-3蛋白、心肌鈣調(diào)蛋白(CAM)表達(dá)水平的影響，從分子水平探討其在I/R損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇健康雄性10周齡的SD大鼠，體重350～400 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SYXK-2013-0025)，SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飲食進(jìn)水均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、枸櫞酸組，每組10只。枸櫞酸組在再灌注前10 min尾靜脈注射枸櫞酸0.05 mol/L，給藥體積為1 ml(按照臨床成人用量等效劑量換算)，后用50 μl生理鹽水插管，假手術(shù)組、模型組給予等體積生理鹽水。

1.1.2 試驗(yàn)藥物與試劑 枸櫞酸(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；氯化三苯基四氮唑(TTC)、烏拉坦(購(gòu)自于Sigma公司)，每個(gè)標(biāo)本0.1 g TTC溶于5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光。Caspase-3試劑盒(購(gòu)自南京碧波生物科技公司)，BCATM Protein Assay Kit(23337，Pierse.USA)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 參考文獻(xiàn)方法建立大鼠I/R模型〔4〕。采用5%烏拉坦腹腔麻醉，尾靜脈置入24G套管留置針，大鼠仰位固定，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG)Ⅱ?qū)?lián)，頸部氣管切開置管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)控制大鼠呼吸(潮氣量8 ml/kg，呼吸頻率70次/min，吸呼比1∶2)，分離左頸總動(dòng)脈，將硬膜外麻醉導(dǎo)管插入連接電生理信號(hào)記錄儀，左冠狀動(dòng)脈前降支根部穿結(jié)扎線，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其余各組均缺血30 min后再灌注2 h，記錄心電圖變化。缺血模型判斷：左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎5 min后，Ⅱ?qū)?lián)ST抬高或QRS波群振幅增加、增寬與T波融合；動(dòng)脈血壓降低>20 mmHg，結(jié)扎血管支配區(qū)室壁發(fā)紺。再灌注模型判斷：缺血區(qū)發(fā)紺消失，再灌注30 min后抬高ST段降低>50%；排除再灌注前嚴(yán)重房室傳導(dǎo)阻滯，結(jié)扎前平均動(dòng)脈壓<60 mmHg。大鼠缺血再灌注120 min ECG記錄中出現(xiàn)室性心律失常：室性早搏高峰期1～5 min、15～19 min、35～55 min。處死大鼠，取心組織，測(cè)定預(yù)處理前后血清Ca2+濃度，TTC染色法測(cè)定梗死面積，活性分光光度法測(cè)定心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平，PCR測(cè)定CAM表達(dá)水平。

1.2.2 TTC染色法測(cè)定梗死面積 取心臟PBS沖洗后取左心室于-80℃冰凍5 min后切片，置于1%pH 8.5的TTC溶液，37℃孵育0.5 h，梗死區(qū)域未著色，正常組織染成紅棕色，采用Image pro plus6.0軟件分析梗死面積，計(jì)算左室缺血面積占左心室面積百分比(AAR/LV)。

1.2.3 分光光度法測(cè)定心肌組織Caspase-3活性 取心臟左室部分缺血區(qū)心肌組織，制備心肌組織勻漿，BCATM Protein Assay Kit法測(cè)定蛋白水平，比色法測(cè)定心肌組織Caspase-3活性，按照試劑盒說明書測(cè)定。

1.2.4 PCR法測(cè)定CAM蛋白表達(dá) 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，CAM序列正向引物：5'-GCTGCCTCTTCAAAATCGCC-3'，反向引物：5'-CTCTGCACTGTGTACCTCGG-3'。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)，20 μl PCR反應(yīng)體系，50℃ 2 min，95℃ 10 min后循環(huán)40次(95℃ 30 s，60℃ 30 s)，60℃采集熒光信號(hào)。

2 結(jié) 果

2.1 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)室性期前收縮發(fā)生次數(shù)、聯(lián)律、室速、室顫發(fā)生的影響 與對(duì)照組比較，模型組室性期前收縮發(fā)生次數(shù)明顯增加(P<0.05)，枸櫞酸組室性早搏次數(shù)與模型組比較降低(P<0.05)。與模型組比較，枸櫞酸組聯(lián)律、室速的平均發(fā)生次數(shù)顯著降低(P<0.05)。模型組室顫發(fā)生率為10%，發(fā)生次數(shù)為1次，持續(xù)時(shí)間為10.45 s，其余各組無(wú)室顫發(fā)生。見表1。

表1 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)室性早搏發(fā)生次數(shù)、聯(lián)律、室速發(fā)生情況影響±s,次,n=10)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)血清Ca2+濃度的影響 枸櫞酸預(yù)處理后血清Ca2+濃度低于預(yù)處理前，干預(yù)10 min后達(dá)峰谷，干預(yù)30 min后血清Ca2+濃度上升。見圖1。

圖1 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)血清Ca2+濃度的影響

2.3 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)I/R大鼠心肌梗死AAR/LV、心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 枸櫞酸組AAR/LV顯著低于模型組(P<0.05)。假手術(shù)組Caspase-3表達(dá)水平為1，與模型組比較，枸櫞酸組Capase-3顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)心肌梗死AAR/LV、心肌組織Capase-3蛋白表達(dá)影響

2.4 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)I/R大鼠心肌組織CAM表達(dá)影響 與假手術(shù)組比較，模型組CAM表達(dá)顯著升高，枸櫞酸組CAM表達(dá)明顯降低。見圖2。

圖2 枸櫞酸預(yù)處理對(duì)I/R大鼠心肌組織CAM表達(dá)影響

3 討 論

心肌I/R損傷導(dǎo)致惡性心律失常，心肌梗死后發(fā)生心律失常重要原因?yàn)樾氖译娭貥?gòu)，心肌細(xì)胞膜離子通道結(jié)構(gòu)與功能變化在心律失常發(fā)生過程中有重要作用〔5～7〕，L-Ca2+通道開放及動(dòng)作電位延長(zhǎng)引起早后除極，鈣超載在心肌I/R心律失常病理過程中具有重要作用，缺血缺氧Na+-K+ATP酶活性下降，Na+-H+交換增加，胞內(nèi)Na+超載，引發(fā)Na+-Ca2+交換，缺氧ATP生成減低，抑制肌漿網(wǎng)攝取及釋放Ca2+，胞質(zhì)Ca2+積聚，再灌注時(shí)補(bǔ)充了高能磷酸化合物，肌漿網(wǎng)攝取釋放Ca2+，細(xì)胞內(nèi)堆積大量鈣離子，延遲后除極幅度升高，引發(fā)室性心律失?！?～10〕。本研究結(jié)果表明，枸櫞酸可抑制大鼠I/R時(shí)室性心律失常。

心肌細(xì)胞L型鈣通道電流主要離子成分為Ca2+，L-Ca-L作為主要內(nèi)心離子流參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化及竇房結(jié)起搏過程，激活肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，維持正常心律，參與心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)與心肌細(xì)胞電活動(dòng)，增加心肌收縮力〔11〕。本研究結(jié)果表明，枸櫞酸處理后血清Ca2+濃度顯著低于處理前，有一定時(shí)間規(guī)律，說明枸櫞酸螯合細(xì)胞外Ca2+作用較強(qiáng)。細(xì)胞外Ca2+經(jīng)過Ca2+通道形成鈣電流，在慢反應(yīng)細(xì)胞中參與自動(dòng)除極，在快反應(yīng)細(xì)胞參與形成超射。細(xì)胞凋亡在I/R損傷病理過程中發(fā)揮作用，細(xì)胞凋亡與氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等多因素有關(guān)，凋亡觸發(fā)因素激活Caspase家族，引發(fā)瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Caspase-3處于核心位置，心肌細(xì)胞凋亡與Caspase-3高表達(dá)區(qū)域在相同心肌缺血區(qū)域。本研究結(jié)果顯示，心肌I/R過程心肌細(xì)胞凋亡增加，枸櫞酸組Caspase-3蛋白表達(dá)下降，缺血早期主要為細(xì)胞凋亡，隨缺血程度增加發(fā)生心肌壞死，再灌注后由于細(xì)胞內(nèi)鈣超載、大量自由基產(chǎn)生等促進(jìn)不可逆性細(xì)胞凋亡，加重I/R損傷，枸櫞酸干預(yù)可通過抗凋亡作用保護(hù)心肌組織。

枸櫞酸干預(yù)可減輕心肌缺血后鈣內(nèi)流導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載，改善心肌電重構(gòu)，心肌缺血缺氧抑制了心室肌細(xì)胞L-Ca-L，峰值電流下降，縮短肌細(xì)胞動(dòng)作電位2相時(shí)程，心肌復(fù)極加速，導(dǎo)致各部位心室肌復(fù)極不統(tǒng)一，引發(fā)室性心律失常；L-Ca-L峰值電流降低一方面降低了Ca2+調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)作用，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載形成震蕩性后電位，通過觸發(fā)活動(dòng)引發(fā)室性心律失常，另一方面由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)凋亡基因表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞凋亡，心肌梗死面積與心肌細(xì)胞凋亡程度有關(guān)，枸櫞酸對(duì)I/R大鼠心肌保護(hù)作用與降低血清Ca2+濃度，下調(diào)Capase-3蛋白、CAM表達(dá)水平，降低心肌細(xì)胞凋亡，減輕室性心律失常有關(guān)。

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〔2015-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

李艷芳(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病的診斷和治療工作。

R54

A

1005-9202(2016)21-5249-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.015

1 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院急診科