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    促紅細胞生成素對內(nèi)毒素所致大鼠腎臟線粒體損傷的保護作用

    2016-12-06 03:34:59張國興李曉華李秀江
    中國老年學雜志 2016年21期
    關鍵詞:外膜電鏡內(nèi)毒素

    張國興 齊 力 李曉華 趙 輝 孫 霓 孫 宇 李秀江

    (吉林省腫瘤醫(yī)院ICU科,吉林 長春 130012)

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    促紅細胞生成素對內(nèi)毒素所致大鼠腎臟線粒體損傷的保護作用

    張國興 齊 力1李曉華2趙 輝 孫 霓 孫 宇 李秀江

    (吉林省腫瘤醫(yī)院ICU科,吉林 長春 130012)

    目的 利用建立脂多糖(LPS)大鼠內(nèi)毒素血癥導致腎臟損傷模型觀察促紅細胞生成素(EPO)防治脂多糖對腎臟造成損害的機制。方法 隨機選取成年Wistar大鼠30只,采用等組實驗法分為空白對照組、脂多糖(LPS)組以及聯(lián)合(LPS+EPO)組。除空白對照組以外,其余兩組分別注射LPS 10 mg/ml,采取尾靜脈注射建立腎臟損傷模型,空白對照組給予同等量生理鹽水,30 min后,LPS+EPO組給予rhEPO(5 000 U/kg)經(jīng)尾靜脈注射。其余2組大鼠給予生理鹽水。在LPS注射后24 h處死大鼠,分離提取腎臟組織線粒體,用 Clark 氧電極法檢測線粒體呼吸功能,線粒體內(nèi)、外膜試劑盒測定線粒體膜完整性,一氧化氮(NO)試劑盒測定線粒體NO含量,電鏡掃描觀察線粒體形態(tài)變化。結(jié)果 LPS組和LPS+EPO組的線粒體外膜完整率、內(nèi)膜膜電位、呼吸控制率均較空白對照組明顯降低(P<0.01),LPS+EPO組上述結(jié)果均高于LPS組(P<0.05);LPS組線粒體NO含量明顯高于空白對照組(P<0.01),LPS+EPO組低于LPS組(P<0.01),電鏡掃描見LPS組線粒體結(jié)構(gòu)受損明顯,EPO減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷。結(jié)論 EPO對內(nèi)毒素導致的腎臟線粒體損傷有保護作用,可能與EPO抑制NO生成有關。

    促紅細胞生成素;內(nèi)毒素;腎損傷;線粒體

    據(jù)不完全統(tǒng)計表明,每天有1萬多人死于感染疾病,而被感染人群的比率每年高達8%〔1〕。絕大多數(shù)被感染的患者腎臟功能破壞是造成死亡的首要原因。腎臟是重癥感染所致多臟器損傷中最常受累及的臟器之一,急性腎衰竭的發(fā)病率可高達40%~50%〔2〕。促紅細胞生成素(EPO)對內(nèi)毒素所致腎臟損傷具有保護作用〔3〕,本研究探討EPO對于脂多糖(LPS)所致大鼠急性腎損傷的腎臟線粒體的保護作用。

    1 材料及方法

    1.1 動物及主要試劑 Wistar成年大鼠30只,雌鼠15只,雄鼠15只,重量最大為250 g,所有的大鼠均有合格證明,證號為:scxk(吉)2008-0005,由吉大實驗動物中心提供,大鼠供養(yǎng)溫度22℃~24℃,并保證大鼠的吃食正常,此次研究的相關內(nèi)容以及規(guī)定均已經(jīng)通過審查。重組人EPO的批號為(20071102V;100 000 IU/支),是由沈陽三生制藥所生產(chǎn)的。LPS(Sigma-L2880;≥99%) 上海Sigma公司。Percoll 細胞分離液 Pharmacia17-0891-01(MK 02742)由日本郵購,IMM以及外膜功能檢測盒的生產(chǎn)公司為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,NO試劑盒購于南京建成生物醫(yī)藥有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 模型的建立及標本采集 對實驗大鼠飼養(yǎng)7 d,并按照基礎適應性方法進行飼養(yǎng),7 d后開始進行實驗,采用等組實驗法,平均分為空白對照組、LPS組以及聯(lián)合(LPS+EPO)組,每組各10只。除空白對照組外,其余兩組各尾靜脈注射含量為10 mg/ml的LPS〔4〕。注射LPS后,等待0.5 h,LPS+EPO組尾靜脈注射含量為5 000 U/kg的重組人紅細胞生成素,空白對照組以及LPS組注射等量氯化鈉溶液,LPS注射后24 h,乙醚吸入麻醉后處死。取右側(cè)新鮮腎臟組織用于線粒體提取,左側(cè)腎臟組織2.5%戊二醛固定。

    1.2.2 腎臟線粒體提取 取腎臟組織,最重為500 mg,將其轉(zhuǎn)移到冰冷的mitochondrion分離緩沖液之中,進行實驗時,應用的所有設備以及緩沖液都要控制冰冷度,以4℃為最佳,所采用的試樣要將其放置在3.6 ml 12%的Percoll分層液中攪拌均勻,并使用勻漿器均勻攪動,以10次為最佳,且使用的勻漿器直徑應為0.12 mm,并再次用直徑0.06 mm的勻漿器攪拌,數(shù)量與之前一致。獲得mitochondrion的方式選擇Percoll密度梯度離心法〔3〕,加入分離介質(zhì)重懸mitochondrion,按照1∶0.4的體積,并放置于冰槽中,等待檢查。

    1.2.3 mitochondrion呼吸功能測定 使用Respiration Measurement法,在反應槽中放置2.5 ml的反應溶劑(225 mmol/L D-木蜜醇,70 mmol/L白砂糖,1 mmol/L乙二胺四乙酸,0.1%牛血清白蛋白,10 mmol/L磷酸三鉀,ph=7.4,設置溫度25℃),將所有物質(zhì)充分攪拌均勻,當基本氧濃度為240 μmol/L時,則狀態(tài)平衡。將含量為2 mg的線粒體懸液進行60 s的孵育。將4 mmol/L的Disodium Succinate放置,耗氧速率為4態(tài)呼吸。將50 mmol/L的二磷酸腺苷加入,測定耗氧速率為3態(tài)呼吸。4態(tài)呼吸和3態(tài)呼吸分別為R3和R4,新鮮提取的線粒體,按照檢測試劑盒說明書進行檢測線粒體膜完整性及NO含量。

    1.2.4 線粒體超微結(jié)構(gòu) 記錄2.5% C5H8O2已經(jīng)固定的腎組織,進行1% OsO4后加固,梯度酒精脫水,Epoxy resin包埋,使用型號為LKB-Ⅲ的超薄切片機進行切片,醋酸氧鈾以及C6H5O7Pb雙上色。完成上述過程后,使用規(guī)格為JEM-1200EX透射式電子顯微鏡,對線粒體的結(jié)構(gòu)變化進行記錄。

    1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1 線粒體呼吸功能對比 LPS+EPO組、LPS組R3及RCR相比于空白對照組差異顯著(P<0.01);與LPS組比較,LPS+EPO組R3和RCR值升高(P<0.05)。見表1。

    2.2 線粒體內(nèi)外膜完整性對比及NO含量mitochondrion完整性和內(nèi)膜膜電位熒光對比 與LPS組比較,外膜完整率及內(nèi)膜膜電位熒光比值升高(P<0.05)。LPS組NO含量明顯高于空白對照組(P<0.01),LPS+EPO組低于LPS組(P<0.05)。見表2。

    表1 各組大鼠腎臟線粒體呼吸功能比較

    與空白對照組比較:1)P=0.003,2)P= 0.001;與LPS組比較:3)P=0.009,4)P=0.019

    表2 各組大鼠腎臟線粒體膜完整性比較及NO含量比較

    與空白對照組比較:1)P=0.005,2)P= 0.008,3)P=0.000;與LPS組比較:4)P=0.017,5)P=0.038,6)P=0.010

    2.3 電鏡形態(tài)觀察 LPS組腎臟線粒體明顯腫脹,線粒體內(nèi)腔擴大,嵴數(shù)量減少,模糊紊亂,部分嵴消失或空泡化,LPS+EPO組腎臟線粒體損傷有不同程度的緩解,線粒體腫脹減輕,嵴致密排列較整齊,部分嵴模糊,排列尚規(guī)則。見圖1。

    圖1 各組大鼠腎臟線粒體電鏡掃描結(jié)果(×10 000)

    3 討 論

    線粒體是細胞維持生命的重要細胞器,由內(nèi)膜、外膜和基質(zhì)組成,是三磷酸腺苷(ATP)形成的主要場所,是機體的 “能量工廠”。ATP生成的主要方式是氧化磷酸化,電子在內(nèi)膜呼吸鏈中傳遞。內(nèi)毒素所致的重癥感染導致臟器功能障礙的機制十分復雜,線粒體功能障礙在發(fā)病機制中的作用越來越受到重視。本研究結(jié)果表明,LPS可以導致腎臟線粒體損傷,主要表現(xiàn)在線粒體呼吸功能顯著降低,線粒體膜的完整性遭到破壞,電鏡掃描下線粒體腫脹,嵴結(jié)構(gòu)破壞明顯。

    重癥感染時,LPS使用TOLL樣受體,將腫瘤壞死因子-α誘發(fā)出,在此過程中,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和其受體-1相聯(lián)合,使其1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶異常開放,同時加速活性氧(ROS)的產(chǎn)生,最終導致線粒體氧化應激損傷〔5〕。因此TNF-α與感染性休克誘導的線粒體功能障礙有著密切關系〔6〕。

    本研究組既往的研究〔3〕表明EPO對絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)的活化進行遏制,將核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達有效減少,真正的控制TNF-α的表達,來保護重癥感染導致的急性腎損傷,萬芳等〔7〕的研究表明EPO降低重癥感染時組織NO的產(chǎn)生。本研究中,給予LPS建立重癥感染模型后,再給予EPO保護臟器治療,線粒體呼吸功能顯著改善,R3和RCR值升高,線粒體膜完成性明顯提高,電鏡掃描證實線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。NO含量較LPS組降低。

    綜上所述,EPO可以保護LPS導致的腎臟線粒體破壞,調(diào)節(jié)線粒體呼吸功能,其機制可能與EPO抑制TNF-α表達和減低NO生成有關。

    1 Mayr FB,Yende S,Angus DC.Epidemiology of severe sepsis〔J〕.Virulence,2014;5(1):4-11.

    2 劉曉偉,劉 志.嚴重膿毒癥并發(fā)急性腎衰竭患者92例臨床研究〔J〕.中國全科醫(yī)學,2010;13(7):738-40.

    3 張國興,李曉華,趙 輝,等.促紅細胞生成素對脂多糖所致大鼠腎損傷的保護作用〔J〕.中華實驗和臨床感染病雜志(電子版),2014;8(6):5-9.

    4 劉 彤,李 哲,畢曉穎.新生大鼠腦組織中線粒體的分離〔J〕.中國實驗診斷學,2011;15(6):1006-7.

    5 Siepe M,Goebel U,Mecklenburg A,etal.Pulsatile pulmonary perfusion during cardiopulmonary bypass reduces the pulmonary inflammatory response 〔J〕.Ann Thorac Surg,2008;86(1):115-22.

    6 Víctor VM,Esplugues JV,Hernandez-Mijares A,etal.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in sepsis:a potential therapy with mitochondria-targeted antioxidants〔J〕.Infect Disord Drug Targets,2009;9(4):376-89.

    7 萬 芳,吳 儉,汪翠婷,等.重組人促紅細胞生成素對感染性休克大鼠腦組織的保護作用〔J〕.南昌大學學報(醫(yī)學版),2011;5(3):1-4.

    〔2015-10-10修回〕

    (編輯 袁左鳴)

    吉林省衛(wèi)生廳科研項目(No.2012Z067)

    李秀江(1961-),男,教授,主要從事危重病研究。

    張國興(1985-),男,碩士,主治醫(yī)師,主要從事危重病研究。

    R6

    A

    1005-9202(2016)21-5230-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.006

    1 長春市朝陽區(qū)醫(yī)院 2 吉林大學第一醫(yī)院感染科

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