不同極性梨多酚抗氧化性能的研究

張東京 高貴珍 張興桃

(宿州學院，安徽 宿州 234000)

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不同極性梨多酚抗氧化性能的研究

張東京 高貴珍 張興桃

(宿州學院，安徽 宿州 234000)

按萃取溶劑的極性不同對梨多酚進行萃取分離，得到不同極性梨多酚萃取物。通過比較抗氧化值的大小，評價不同極性梨多酚的抗氧化性能。結(jié)果表明：第15天時加入水層梨多酚的大豆油樣品，過氧化值為9.43 mmol/kg，抑制率為41.86%；加入正丁醇層梨多酚過氧化值為10.19 mmol/kg，抑制率為37.17%；加入乙酸乙酯層梨多酚過氧化值為11.03 mmol/kg，抑制率為34.99%?？梢缘贸霾煌瑯O性梨多酚的抗氧化性能及清除自由基能力差異顯著，水層梨多酚活性最強，正丁醇層梨多酚次之，乙酸乙酯層梨多酚活性最弱，即梨多酚的抗氧化性能隨著浸提溶劑極性的增強而增強。

梨；多酚；抗氧化性；水；正丁醇；乙酸乙酯

梨中含脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維、糖、鈣、鐵、磷、多種維生素和多酚類物質(zhì)，具有養(yǎng)陰清熱，降血壓的功效。梨是“百果之宗”，因其味道酸甜、柔嫩多汁，故又稱之為“天然礦泉水”[1]。梨多酚是從梨中提取出來的一種純天然抗氧化劑，其主要成分為黃酮類化合物。近幾年，大量的研究[2-4]顯示梨多酚具有多種藥理功能，如抑菌、抗氧化、抗動脈硬化、生發(fā)烏發(fā)等。有機溶劑提取法是利用乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑提取物質(zhì)原料，具有重復性強等優(yōu)點[5]。

目前對于梨多酚的研究多集中在提取和抗氧化活性評價等方面。孫紅艷等[6]利用超聲波輔助法提取刺梨多酚，發(fā)現(xiàn)得到的梨多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑菌性能。徐芹等[7]對碭山梨中的多酚氧化酶進行了研究，研究得出碭山梨多酚氧化酶的最佳條件分別為pH值4.5和溫度34 ℃；該酶促褐變反應動力學符合米氏方程，其反應的速率可達178.57 U/min。楊光宇等[8]研究趙州雪花梨中多酚的酶促褐變，得出該反應體系中，選擇的底物是鄰苯二酚，雪花梨中多酚氧化酶的最佳條件分別為pH值7.0和溫度25 ℃。但關(guān)于不同極性梨多酚抗氧化性能的比較研究目前未見報道。本研究擬通過采取有機溶劑提取梨總多酚，測定不同極性梨多酚的總多酚含量，利用不同極性梨多酚對氫氧根自由基清除能力進行試驗，研究不同極性梨多酚清除自由基的差異，旨在為工業(yè)化提取安全高效的天然抗氧化劑梨多酚提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

碭山酥梨：產(chǎn)自安徽省宿州市碭山縣；

乙醇、三氯化鐵、正丁醇、水楊酸、沒食子酸、碘化鉀、乙酸乙酯、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、冰醋酸、淀粉：分析純；

大豆油：福臨門一級大豆油；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

粉碎機：HL-20型，上海海菱電器有限公司；

可見分光光度儀：722G型，上海儀電分析儀器有限公司；

電子天平：FA2104型，上海超平科學儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101型，龍口市電爐制造廠。

1.2 不同極性梨多酚的提取及分離

榨汁，稱取已榨汁(含渣，不去皮)的樣品230 g，按料液比1∶3(g/mL)添加濃度為70%的乙醇，然后放置在 90 ℃水浴回流情況下提取30 min，然后過濾，取濾液。梨渣再參照上面過程重復2次，聚集3次提取濾液，將濾液在50 ℃下真空濃縮，向濃縮液中添加2倍量的乙酸乙酯，攪拌10 min，于分液漏斗中分層，取上層液，重復3次，合并3次提取液，分別為乙酸乙酯層萃取物和水層萃取物，在水層中再添加2倍體積的正丁醇，搖勻10 min后，于分液漏斗中分層，取上層液，重復3次，合并3次提取液，得到正丁醇層萃取物和水層萃取物[9]，將3種萃取物分別進行干燥，后取干燥產(chǎn)物用水溶解得到不同極性的梨多酚溶液。

1.3 酥梨中總多酚含量的計算

1.3.1 標準曲線的制作 分別向刻度試管中轉(zhuǎn)移1.0 mL不同梯度的沒食子酸溶液，再分別轉(zhuǎn)移0.3 mL福林試劑，振蕩，存放5 min，轉(zhuǎn)移1.5 mL飽和碳酸鈉，定容至10 mL，振搖搖勻，靜置30 min，以空白作參照對比，測定在波長760 nm處的吸光值[10-11]。

1.3.2 酥梨中總多酚含量的測定 分別取不同極性的梨多酚萃取液1.0 mL放于刻度試管中，再轉(zhuǎn)移0.3 mL福林試劑，混勻，存放5 min，轉(zhuǎn)移1.5 mL飽和碳酸鈉，定容至10 mL，振搖搖勻，靜置30 min，測定在波長760 nm處的吸光值[12]。依據(jù)標準曲線回歸方程和所測得的吸光值，計算試驗樣品中的總多酚含量。

1.4 不同極性梨多酚的抗氧化能力測定

當大豆油儲存一段時間后，會有過氧化物的生成，該過氧化物可以和具有一定還原性的碘化鉀發(fā)生氧化還原作用而生成碘，采用淀粉指示劑，用硫代硫酸鈉滴定，通過滴定反應中所消耗的硫代硫酸鈉的量來換算植物油的過氧化值，從而測定出梨多酚的抗氧化能力[13]。

分別取相同體積的乙酸乙酯層梨多酚、正丁醇層梨多酚、水層梨多酚，加入到棕色瓶中，然后向棕色瓶中加入20 g大豆油，充分攪拌混勻后放于(60±2) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，間隔6 h振蕩搖勻，每3 d取樣1次，測其過氧化值(POV)[14]，過氧化值(POV)的計算公式：

(1)

(2)

式中：

POV——抗氧化值，mmol/kg；

C——硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；

V1——油樣消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL；

V2——空白消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL；

M——樣品的質(zhì)量，g；

X——抑制率，%；

POVa——空白抗氧化值，mmol/kg；

POVb——油樣抗氧化值，mmol/kg。

1.5 不同極性梨多酚對胡蘿卜素的護色效果測定

β-胡蘿卜素為胡蘿卜汁中的主要色素物質(zhì)，其波長在446 nm處有最大吸收峰。通過向胡蘿卜汁中加入不同極性的梨多酚，測定其在446 nm處的吸光度，來比較不同極性梨多酚對胡蘿卜汁護色效果的差異。

分別取相同體積的乙酸乙酯層梨多酚、正丁醇層梨多酚、水層梨多酚放于刻度試管中，然后向刻度試管中加入6 mL胡蘿卜汁，搖勻，光照室溫下放置3 h，測定在波長446 nm處的吸光值。

1.6 不同極性梨多酚對氫氧自由基清除作用

本研究通過不同極性梨多酚對氫氧自由基的清除率，來驗證梨多酚對氫氧自由基有清除效果，并對比它們之間的差異[15]。

氫氧自由基具有很高的反應活性，在反應體系中加入水楊酸，可以有效地結(jié)合氫氧自由基產(chǎn)生有色物質(zhì)，這種有色物質(zhì)在510 nm處有強吸收。而加入具有清除氫氧自由基能力的被測物質(zhì)時，由于被測物質(zhì)與水楊酸競爭氫氧自由基，從而使有色物質(zhì)的生成量減少。固定反應時間，通過與沒有氫氧自由基的空白組比較，便可以測出試驗組清除氫氧自由基的效果[16]。

不同極性梨多酚清除自由基試驗步驟：在清洗干凈的試管中加入5 mL蒸餾水，30 μL 0.02 mol/L的FeSO4，100 μL 0.01 mol/L的水楊酸，再加入25 μL 0.02 mol/L的雙氧水，于37 ℃的水浴中反應30 min后，測定其在510 nm處的吸光度，即為空白值。同上試驗，在清洗干凈的試管中分別加入不同量的樣品后，接著再加入0.02 mol/L的雙氧水25 μL，于37 ℃的水浴中反應35 min后，測定在510 nm處的吸光度[17]。

(3)

式中：

S——自由基的清除率，%；

A1——樣品吸光度；

A0——空白對照的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法與軟件

數(shù)據(jù)分析運用 SPSS 13.0 軟件，采用方差分析進行分析處理，各處理組間的差異比較用 LSD 法，P<0.05有統(tǒng)計學意義。運用 Microsoft Excel 2010 軟件繪制統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酥梨中不同極性梨多酚的含量

以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標建立標準曲線，見圖1。各萃取液極性的順序為水>正丁醇>乙酸乙酯，依據(jù)相似相溶，酥梨的提取液經(jīng)過不同極性萃取劑作用，可以萃取得到不同極性的梨多酚。經(jīng)測定計算，各萃取液中梨多酚含量見表1。

圖1 沒食子酸標準曲線

萃取劑多酚含量/(μg·mL-1)乙酸乙酯0.980±0.004正丁醇 2.160±0.005水 3.830±0.002

由表1可知，水層梨多酚含量最多，正丁醇層次之，乙酸乙酯層梨多酚含量最少。依據(jù)相似相溶原理，說明碭山酥梨中較高極性的梨多酚含量較多，而低極性梨多酚含量較少。

2.2 不同極性梨多酚的抗氧化能力

不同極性梨多酚的過氧化值見表2。

表2 不同極性梨多酚的過氧化值

由表2可知：沒有添加梨多酚的空白油樣，放置第9天時，POV值為9.98 mmol/kg，即接近規(guī)定值(POV≤10 mmol/kg)的出廠標準。而添加不同極性梨多酚的油樣，放置到第15天時，水層多酚的POV值仍低于10 mmol/kg，而正丁醇層和乙酸乙酯層多酚的POV值略高于10 mmol/kg。由此可見梨多酚可以延緩植物油的氧化，延長其保質(zhì)期。通過比較POV值及抑制率，發(fā)現(xiàn)極性不同梨多酚所表現(xiàn)出來的抗氧化性能有所差異，其抗氧化性能水層梨多酚高于正丁醇層梨多酚，正丁醇層梨多酚強于乙酸乙酯層梨多酚，得出極性較大的梨多酚其抗氧化能力較強，極性較小的梨多酚抗氧化能力相對較弱，且在短時間內(nèi)3種極性梨多酚的抑制率呈波動上升狀態(tài)。比較3種極性梨多酚，水層梨多酚的抗氧化性能較強，這可能是在極性較強的溶劑中，多酚類物質(zhì)的溶解能力較強，處于同樣狀況時，水層梨多酚在反應體系中分散程度大，梨多酚分子與自由基碰撞的機會較多，清除自由基的反應速度較快。但是正丁醇和乙酸乙酯層梨多酚分散程度相對較小，在反應體系中擴散的較慢，其梨多酚分子與自由基碰撞的機會較少，抗氧化性能相對較低[18]。

2.3 不同極性梨多酚對胡蘿卜素的護色效果的比較

由圖2可知，梨多酚對胡蘿卜汁有護色作用，且水層梨多酚的護色效果強于正丁醇層梨多酚，正丁醇層梨多酚的護色效果強于乙酸乙酯層梨多酚，得出極性較大的梨多酚其護色能力較強，極性較小的梨多酚護色效果相對較弱。在濃度<0.4 g/100 mL時，加入的梨多酚濃度越大，其護色作用越強，當梨多酚濃度>0.4 g/100 mL時，隨著梨多酚濃度的增加護色作用減弱，且在試驗過程中發(fā)現(xiàn)添加梨多酚過多時，會改變胡蘿卜汁的顏色，呈淺棕色。胡羅卜汁護色作用下降，可能是梨多酚濃度增大誘導其內(nèi)部自由基生成的緣故[19]。

2.4 不同極性梨多酚清除氫氧自由基的能力

由圖3可知，水層梨多酚對氫氧自由基的抑制作用強于正丁醇層梨多酚，正丁醇層梨多酚的抑制作用強于乙酸乙酯層梨多酚，得出極性較大的梨多酚對氫氧自由基的抑制作用較強，極性較小的梨多酚對氫氧自由基的抑制作用相對較弱。這可能是不同溶劑提取的梨多酚種類和數(shù)量有所差異，極性強的溶劑提取的梨多酚給電子能力相對較強[20]。

圖2 不同濃度梨多酚對胡蘿卜汁的護色作用

圖3 不同極性梨多酚對氫氧自由基的清除作用

3 結(jié)論

梨多酚有一定的抗氧化及清除自由基性能，應用前景廣闊。本研究采用水、正丁醇、乙酸乙酯3種不同極性的溶劑分離酥梨中的多酚類物質(zhì)，并比較了浸提物的抗氧化性能。結(jié)果表明，水層梨多酚清除氫氧自由基的抑制作用最強，正丁醇層梨多酚次之，乙酸乙酯層梨多酚最弱，即梨多酚的極性與抗氧化活性呈正相關(guān)趨勢。研究結(jié)果為高抗氧化性梨多酚的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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Research on antioxidative activities of different polar polyphenols from pear

ZHANGDong-jingGAOGui-zhenZHANGXing-tao

(SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China)

Polar polyphenols were extracted from pear using different polar solvents in this study. The antioxidant properties of different polar polyphenols were evaluated by comparing the antioxidant value. The results showed that the peroxide value was 9.43 mmol/kg, and the inhibition rate was 41.86%, added soybean oil with the water layers polyphenols at the fifteenth day. Moreover, the values were 10.19 mmol/kg, and 37.17%, respectively, while adding peroxide value soybean oil with n-butanol layers pear polyphenol. When ethyl acetate layer pear polyphenol was added, the values were changed to be 11.03 mmol/kg and 34.99% respectively. Significant differences of the antioxidant properties and free radical scavenging abilities of different polar polyphenols from pear could be found in the present studies. The PPO activities order of polyphenols extracted by solvents was water, n-butanol, ethyl acetate, and the PPO activities of polyphenols extracted from pear increased accordant with the solvents polarity increasing.

pear; polyphenols; antioxidant; water; n-butanol; ethyl acetate

宿州學院平臺項目(編號：2015ykf01)；安徽省教育廳(編號：2013zytz073)

張東京(1987—)，男，宿州學院助教，碩士。

2016—08—21

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.037

E-mial：zhangdongjing1987@163.com