羊肺蛋白酶解工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

楊旭卉 文 飛 王先倩 齊 琦 蘇 偉 托 尼

(1. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省晴隆縣海權(quán)清真肉羊食品加工有限公司，貴州 黔西南布依族苗族自治州 561400)

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羊肺蛋白酶解工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

楊旭卉1文 飛1王先倩1齊 琦2蘇 偉1托 尼3

(1. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省晴隆縣海權(quán)清真肉羊食品加工有限公司，貴州 黔西南布依族苗族自治州 561400)

羊肺；蛋白；酶解；抗氧化

目前，酶解技術(shù)因其反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于多肽的制備，也使得通過酶解內(nèi)臟等副產(chǎn)物來制備生物活性肽成為研究熱點(diǎn)。Barkia等[1-2]分別利用堿性蛋白酶酶解沙丁魚內(nèi)臟和魚頭，前者獲得了分子量為3.5 kD的抗氧化活性肽，后者得到ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制肽。Elavarasan等[3]通過風(fēng)味蛋白酶來酶解3種不同淡水鯉魚，得到的多肽表現(xiàn)出較高的ACE抑制活性。Zhou Da-yong等[4]通過5種不同的蛋白酶酶解鮑魚內(nèi)臟,研究不同酶解產(chǎn)物的抗氧化活性及其與原料中總氨基酸組成的差異分析，結(jié)果表明不同的肽液都具有較優(yōu)的抗氧化活性；與原料氨基酸相比，不同酶解產(chǎn)物的氨基酸含量有所差異，5種酶解產(chǎn)物中都存在清除自由基活性較強(qiáng)的組氨酸、亮氨酸和酪氨酸。Mamelona等[5]通過堿性蛋白酶酶解無脊椎動物副產(chǎn)物(包括海參內(nèi)臟、生殖腺和海膽)，所得酶解物均具有較高的清除ORAC自由基和抑制脂質(zhì)過氧化自由基的能力。

隨著羊肉需求量增多和加工企業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，產(chǎn)生大量的羊副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物常被加工成飼料或直接丟棄，不僅產(chǎn)品附加值較低，而且對環(huán)境造成污染。中國羊肉加工企業(yè)雖多，但對羊副產(chǎn)物的加工利用大多還停留在粗加工階段，使得大量的羊副產(chǎn)物未得到充分利用。羊肺為羊肉加工過程中的副產(chǎn)物之一，蛋白質(zhì)含量豐富，同時含鐵、硒等營養(yǎng)元素，并有補(bǔ)益肺氣、止咳、利尿行水的作用。因此，對羊肺進(jìn)行深加工、精加工，提高其附加值是亟待解決的問題。

目前，國內(nèi)外學(xué)者已對羊骨[6-8]、羊腦[9]、羊胎盤[10-11]、羊肝[12]、羊胃[13]等羊副產(chǎn)物進(jìn)行了相關(guān)研究，而關(guān)于羊肺的研究[14]主要集中于綿羊肺炎支原體分離與鑒定等畜禽方面，對羊肺進(jìn)行酶解，研究其抗氧化活性的研究未有報道。本研究采用酶解技術(shù)，通過響應(yīng)面優(yōu)化羊肺酶解工藝，研究羊肺酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性及其氨基酸組成，以期為羊肺深加工、生物活性肽產(chǎn)品的開發(fā)和提高羊肺資源加工利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

羊肺：貴州晴隆海權(quán)羊肉加工有限公司；

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)：美國Sigma公司；

中性蛋白酶(酶活力40萬U/g)、堿性蛋白酶(酶活力40萬U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力80萬U/g)、胰蛋白酶(酶活力4萬U/g)：廣西南寧龐博生物有限公司；

其他試劑：均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

定氮儀：KDN-08系列，浙江托普儀器科學(xué)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-S6型，北京科偉儀器有限公司；

酸度計：PHS-06型，上海歐宇儀器有限公司；

紫外分光光度計：TU-1950系列，北京普析儀器科學(xué)有限公司；

氨基酸分析儀：L8800型，日本日立儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

原料預(yù)處理→石油醚脫脂12 h→按比例加水勻漿→調(diào)節(jié)pH值→恒溫酶解→滅酶(100 ℃，10 min)→冷卻→過濾→酶解液→測定水解度

1.2.2 蛋白酶的篩選 以水解度為指標(biāo)進(jìn)行篩選。稱取已脫脂的原料15 g，根據(jù)表1不同酶的作用條件，進(jìn)行酶解。

1.2.3 水解度的測定 總氮含量測定按 GB 5009.5—2010的凱氏定氮法執(zhí)行；水解后生成的氨基態(tài)氮含量測定采用甲醛電位滴定法[15]進(jìn)行。水解度按式(1)計算：

(1)

式中：

c——水解度，%；

m1——水解后生成的氨基的量，g；

m2——樣品中總氮含量，g。

表1 各種酶酶解條件

1.2.4 酶解液體外抗氧化活性測定

(1) 清除DPPH自由基能力測定：參照文獻(xiàn)[16]。

(2) 還原力測定：參照文獻(xiàn)[16]。

(3) 清除超氧陰離子能力測定：參照文獻(xiàn)[16]。

(4) 清除羥基自由基能力測定：參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 以水解度為指標(biāo)，以中性蛋白酶進(jìn)行羊肺酶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，以酶解時間、酶解溫度、加酶量、水料比為酶解因素，確定單因素的條件：

(1) 酶解時間：分別稱取5份(每份15 g)脫脂勻漿羊肺，在反應(yīng)溫度為50 ℃、pH為7.0、水料比為2∶1(mL/g)、加酶量為1 200 U/g的條件下，研究酶解時間(1，2，3，4，5 h)對羊肺水解度的影響。

(2) 酶解溫度：分別稱取5份(每份15 g)脫脂勻漿羊肺，在pH為7.0、水料比為2∶1(mL/g)、加酶量為1 200 U/g的條件下酶解4 h，研究酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對羊肺水解度的影響。

(3) 加酶量：分別稱取5份(每份15 g)脫脂勻漿羊肺，在酶解溫度為50 ℃、水料比為2∶1(mL/g)、pH為7.0的條件下酶解4 h，研究加酶量(400，800，1 200，1 600，2 000 U/g)對羊肺水解度的影響。

(4) 水料比：分別稱取5份(每份15 g)脫脂勻漿羊肺，在酶解溫度為50 ℃、pH為7.0、加酶量為1 600 U/g的條件下酶解4 h，研究水料比(1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，mL/g)對羊肺水解度的影響。

1.2.6 羊肺基本理化成分測定

(1) 蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2010采用凱氏定氮法測定。

(2) 脂肪含量：參照GB/T 5009.6—2003采用索氏抽提法測定。

(3) 水分含量：參照GB/T 5009.3—2003采用直接干燥法測定。

(4) 灰分含量：參照GB/T 5009.4—2003采用灼燒法測定。

1.2.7 羊肺酶解液中氨基酸含量分析 參考文獻(xiàn)[18]，略微修改：稱取羊肺酶解液0.5 mL于水解管中，加入6 mol/L HCl溶液5 mL，充氮?dú)夂螅瑹崛诿芊猓?10 ℃烘箱中水解 24 h，待放冷后，用蒸餾水無損轉(zhuǎn)移水解液至容量瓶中，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2～3，再用蒸餾水定容至100 mL容量瓶，取約1 mL適量濃度的水解液過45 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，采用全自動氨基酸分析儀上樣測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肺基本組成分析

由表2可知，羊肺酶解液的粗蛋白質(zhì)含量在17%左右，可用于羊肺多肽的酶解。

2.2 蛋白酶的篩選

蛋白酶的種類不同，其作用位點(diǎn)及其所結(jié)合的底物特異性也有所不同。在各酶最適條件下，對羊肺進(jìn)行酶解，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種蛋白酶中，中性蛋白酶的水解度最高，為9.58%，其次是胰蛋白酶(7.51%)，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的水解度均為6.70%。中性蛋白酶是一種金屬蛋白酶，其主要作用于疏水性氨基酸殘基或任一氨基酸肽鍵的Leu端[19]，其酶解產(chǎn)物的水解度最高。因此，選用中性蛋白酶酶解羊肺進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 羊肝基本組分分析

圖1 酶種類對羊肺酶解液水解度的影響

2.3 單因素試驗(yàn)條件對中性蛋白酶酶解羊肺水解度的影響

2.3.1 酶解時間 由圖2可知，酶解時間4 h前，隨著酶解時間的延長，羊肺水解度呈逐漸增大趨勢，酶解4 h后水解度變化較小。這是因?yàn)樵诜磻?yīng)4 h前，酶活力高，酶解時間的延長促使反應(yīng)向正方向進(jìn)行，加快羊肺蛋白質(zhì)被降解的速率，當(dāng)酶解反應(yīng)達(dá)到4 h后，大分子蛋白完全被降解為小分子肽，酶切位點(diǎn)開始減少，酶活力降低，使得水解度趨于平緩[20]。因此，考慮時間成本，選擇4 h為最佳酶解時間。

圖2 酶解時間對羊肺酶解液水解度的影響

2.3.2 酶解溫度 由圖3可知，溫度過高或過低都會對羊肺水解度造成影響，高溫會使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，從而使酶活性降低，水解度降低；低溫不利于酶與底物反應(yīng)完全，水解不徹底，也會造成水解度較低。所以，選擇酶解溫度為50 ℃。

2.3.3 加酶量 由圖4可知，在酶添加量低于1 600 U/g時，水解度上升趨勢較快，高于1 600 U/g時，水解度變化緩慢。出于蛋白酶使用成本的考慮，選擇酶用量為1 600 U/g。

圖3 酶解溫度對羊肺酶解液水解度的影響

圖4 加酶量對羊肺酶解液水解度的影響

2.3.4 水料比 在蛋白酶解反應(yīng)中，水在反應(yīng)中有利于分子的擴(kuò)散和運(yùn)動，一方面水量的多少會影響酶與底物的濃度高低，另一方面會影響水解的效果[18]。由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，羊肺水解度隨水料比的增大而增大，在水料比為2∶1(mL/g)時水解度達(dá)到最大值，隨后水解度表現(xiàn)為逐步減小?？紤]合理用水，選擇水料比2∶1(mL/g)較為適宜。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、加酶量、水料比、酶解時間為自變量，水解度為響應(yīng)值，按照Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計，因素水平編碼表見表3，試驗(yàn)設(shè)計和分析采用Design-Expert.V8.0.6軟件。

圖5 水料比對羊肺酶解液水解度的影響

水平A酶解溫度/℃B加酶量/(U·g-1)C水料比(mL/g)D酶解時間/h-14512001∶1305016002∶1415520003∶15

2.4.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 利用Design-Expert.V8.0.6軟件，對表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到水解度對自變量酶解溫度、加酶量、水料比、酶解時間的二次多項(xiàng)式回歸模型方程：

Y=18.08+0.60A+0.64B+0.05C+0.41D-0.82AB-0.19AC-0.72AD+0.44BC-0.06BD-0.10CD-3.23A2-1.24B2-1.98C2-2.16D2。

(2)

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表5 回歸方程各項(xiàng)的方差分析?

2.4.2 響應(yīng)面直觀圖分析 圖6中顯示了各自變量之間的交互作用對羊肺水解度三維響應(yīng)圖和等高線圖的影響。由圖6可知，酶解溫度與加酶量、酶解溫度與酶解時間之間的交互作用顯著，這與方差分析結(jié)果吻合。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，酶解溫度與加酶量、酶解溫度與酶解時間之間的交互作用對水解度的影響與單因素變化結(jié)果一致。圖6(a)沿加酶量方向的等高線密度高于酶解溫度，說明加酶量對水解度的影響大于酶解溫度；而圖6(c)沿酶解溫度方向的等高線密度高于酶解時間，說明酶解溫度對水解度的影響大于酶解時間。

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過軟件Design-Expert.V8.0.6對方程進(jìn)行求解，得出中性蛋白酶酶解羊肺的最佳工藝條件為：酶解溫度50.25 ℃，加酶量為1 698.58 U/g，水料比為2.03∶1 (mL/g)，酶解時間為4.08 h，此時理論上水解度為18.19%。考慮實(shí)際操作可行性，將其修正為：酶解溫度50 ℃，加酶量1 700 U/g，水料比2∶1(mL/g)，酶解時間4 h，對上述最優(yōu)酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證，取脫脂羊肺，在最優(yōu)酶解條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到羊肺酶解液水解度為18.89%，實(shí)際值與理論值相接近，說明模型擬合度較好。

圖6 因素之間的交互作用對羊肺酶解液水解度的影響

2.5 氨基酸組成分析

氨基酸的組成在一定程度上影響酶解物的生物活性。由表6可知，羊肺酶解液中含有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸等疏水性氨基酸，占總氨基酸含量的27.02%。研究[21]表明，疏水性氨基酸在脂相中具有良好的溶解性，從而保證了酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。羊肺酶解液中疏水性氨基酸的存在，也為其具有較強(qiáng)抗氧化活性提供了可能。

表6 羊肺酶解液氨基酸結(jié)果分析?

? *表示必需氨基酸；疏水性氨基酸[21]包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸。

2.6 羊肺酶解液的體外抗氧化活性

2.6.1 清除DPPH·能力 由圖7可知，羊肺酶解液與Vc對DPPH·的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，不同質(zhì)量濃度的酶解液和Vc與DPPH·清除率之間近似呈量效關(guān)系，這與Zhou Da-yong等[4]采用DPPH法測定中性蛋白酶酶解鮑魚內(nèi)臟所得酶解物清除DPPH·的結(jié)果一致。在質(zhì)量濃度為100 mg/mL時，羊肺酶解液對DPPH·的清除率為73.20%，而Vc的清除率達(dá)到95.20%。羊肺酶解液的IC50值為67 mg/mL，高于Vc的IC50值26.5 mg/mL。IC50

圖7 羊肺酶解液與Vc對DPPH·的清除作用

Figure 7 Scavenging effect of sheep lung hydrolysate derived from the neutral proteases and ascorbic acid on DPPH radical

值越低，表明抗氧化能力越強(qiáng)。盡管羊肺酶解液的清除能力不如Vc，但其表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

2.6.2 還原力 多數(shù)研究[21-22]表明，還原力與抗氧化能力具有相關(guān)性，還原力越大，其抗氧化能力越強(qiáng)。由圖8可知，在一定濃度范圍內(nèi)，羊肺酶解液和Vc的還原力都隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度(11 mg/mL)下，羊肺酶解液的吸光值為0.472，約為Vc吸光值(0.973)的48.51%。羊肺酶解液的還原力雖低于Vc的還原力，但羊肺酶解液可作為一種良好的天然抗氧化劑。

圖8 羊肺酶解液與Vc的還原能力

Figure 8 Reduction ability of sheep lung hydrolysate derived from the neutral proteases and ascorbic acid

2.6.4 清除·OH能力 在自由基體系中，·OH的活性最強(qiáng)，能與體內(nèi)多種生物分子(如氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA) 反應(yīng)，引起機(jī)體發(fā)生多種疾病[21]。由圖10可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，羊肺酶解液和Vc對·OH的清除率與質(zhì)量濃度之間表現(xiàn)出量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，羊肺酶解液對·OH的清除能力為38.92%，低于王艷梅等[22]關(guān)于黃緣盒龜肉的酶解產(chǎn)物對·OH 55%的清除率，而Vc對·OH的清除能力達(dá)到75.48%。羊肺酶解液與Vc清除·OH的IC50值分別為31.88，14.03 mg/mL。羊肺酶解液的IC50值約為Vc的2.27倍。

圖9 羊肺酶解液與Vc對·的清除作用

Figure 9 Scavenging effect of sheep lung hydrolysate derived from the neutral proteases and ascorbic acid on superoxide anions radical

圖10 羊肺酶解液與Vc對·OH的清除作用

Figure 10 Scavenging effect of sheep lung hydrolysate derived from the neutral proteases and ascorbic acid on hydroxyl radical

3 結(jié)論

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Optimization of protease enzymatic hydrolysis of sheep lung and studies on antioxidant activities of its hydrolysates

YANGXu-hui1WENFei1WANGXian-qian1QIQi2SUWei1TUONi3

(1.CollegeofLiquorandFood,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China； 3.QinglongCounty,GuizhouSeaPowerSheepHalalFoodProcessingLtd.,SouthwestGuizhouAutonomousPrefecture,Guizhou561400,China)

By using the hydrolysis degree as the evaluation, the sheep lung enzymatic process was optimized to investigate the antioxidate activities of the enzymolysis products, hydrolyzed by neutral protease. On the basis of single factor studies, the response surface analysis (RSM) assay was then used to obtain the best enzymatic proscess. Our results showed that the optimal condition was as follows. The enzyme amount was 1 700.0 U/g, with solid-liquid ratio 2∶1(mL/g) , enzymatically hydrolyzed for 4 h at 50 ℃. Under this optimal conditions, 3 times of the replication experiments turned out that the error of the actual degree of hydrolysis (18.89%) was small, compared with the theory one (18.19%). Moreover, the absorption value of reducing power was found to be 0.472, andIC50of the DPPH radical scavenging rate, the superoxide anion radical scavenging rate, and the hydroxyl radical scavenging rate were 67 mg/mL, 40.07 mg/mL, and 31.88 mg/mL, respectively. These results of above detection indicated that enzymatic hydrolysates of sheep lungs possessed certain antioxidant activityinvirto.

sheep lung; protein; hydrolysis; antioxidant

黔西南州種草養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展省州科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(編號：黔西南科號[2012]4)

楊旭卉，女，貴州大學(xué)在讀碩士研究生。

蘇偉(1974—)，男，貴州大學(xué)副教授，博士。

E-mail: suwei1886@163.com

2016-03-05

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.035